張 莉，何 達(dá)，席俊峰

（陜西榆林市第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科，榆林 719000）

慢性阻塞性肺病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一種以不完全可逆氣流受限，且進(jìn)行性發(fā)展為特征的肺部疾病，其作為世界上第三常見(jiàn)的威脅生命的疾病，與高發(fā)病率和高死亡率有關(guān)[1-2]。研究數(shù)據(jù)表明，COPD 的全球疾病負(fù)擔(dān)預(yù)計(jì)從2003 年第13 位上升到2030 年第5 位，COPD 未來(lái)的疾病形勢(shì)將更趨嚴(yán)重[3]。慢性氣道炎癥被認(rèn)為是COPD 持續(xù)發(fā)展的重要誘因，因此抗炎治療是COPD 的主要治療手段[4]。近年來(lái)，糖皮質(zhì)激素以其顯著的抗炎作用在COPD的治療中得到了越來(lái)越多的應(yīng)用。然而，由于皮質(zhì)類(lèi)固醇的易耐藥性導(dǎo)致其在臨床上對(duì)COPD 的療效相當(dāng)有限[5]。因此，有必要尋找其他有效的抗炎靶點(diǎn)作為治療COPD潛在的藥物研發(fā)策略。丹酚酸B是從中草藥丹參中提取的主要生物活性成分，其具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)等作用[6-7]。研究表明，白介素（IL）-4/IL-13 能夠通過(guò)激活JAK/STAT6 通路，介導(dǎo)過(guò)敏性氣道上皮杯狀細(xì)胞化生和黏液高分泌，而氣管內(nèi)滴注IL-13可顯著促進(jìn)STAT6的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)[8]，提示IL-13是STAT6的上游調(diào)控因子，且IL-13/STAT6 通路參與調(diào)控了COPD 的發(fā)生發(fā)展。此外，炎癥性Th17 細(xì)胞與免疫抑制調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（Treg）的失衡是COPD的發(fā)病機(jī)制之一，恢復(fù)Th17/Treg平衡可延緩COPD疾病進(jìn)展[9]。然而，迄今為止，丹酚酸B 對(duì)COPD 的作用及其機(jī)制尚未明確，本研究旨在探究丹酚酸B 對(duì)COPD 的作用及其可能的機(jī)制，以期為開(kāi)發(fā)新的COPD治療策略提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑和儀器

6 周齡雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠40 只，體質(zhì)量180～220 g（西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）；丹酚酸B（純度≥98%，成都格利普生物科技有限公司）；地塞米松（純度≥98%，美國(guó)Sigma 公司）；阿爾辛藍(lán)—過(guò)碘酸—雪夫（AB-PAS）染色試劑盒（北京雷根生物技術(shù)有限公司）；MUC5AC、RORγt、Foxp3、IL-13 和STAT6 抗體（英國(guó)Abcam 公司）；Phospho-STAT6（Tyr641）抗體（美國(guó)Cell Signaling Technology公司）；GAPDH抗體（北京義翹神州生物技術(shù)有限公司）；大鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）、白細(xì)胞介素6（IL-6）、白細(xì)胞介素10（IL-10）和白細(xì)胞介素17A（IL-17A）ELISA 檢測(cè)試劑盒（上海江萊生物科技有限公司）；Ani-Res2005 動(dòng)物肺功能分析系統(tǒng)（北京貝蘭博科技有限公司）；倒置顯微鏡（日本尼康）；全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek）。

1.2 造模及分組給藥

40 只SD 大鼠于動(dòng)物房飼養(yǎng)，環(huán)境溫度22～26 ℃，提供充足飲水及飼料。待大鼠適應(yīng)環(huán)境一周后，將其隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、丹酚酸B組和陽(yáng)性對(duì)照組，每組10 只。除對(duì)照組外，其余組大鼠采用煙熏聯(lián)合氣管內(nèi)滴注脂多糖（LPS）法建立慢阻肺大鼠模型[10]。造模組在第1、14 天于大鼠每次持續(xù)30 min。對(duì)照組氣道內(nèi)注射生理鹽水。丹酚酸B組和陽(yáng)性對(duì)照組氣道內(nèi)注射200 μg LPS，在第2～13天和第15～28 天每天給予兩次煙熏處理，大鼠在每次煙熏前1 h分別腹腔注射丹酚酸B（50 mg/kg）[11]和地塞米松（0.2 mg/kg）[12]，其余組注射生理鹽水，持續(xù)給藥4周。

1.3 各組大鼠肺功能測(cè)定

給藥28 d 后，10%水合氯醛麻醉大鼠（3 mL/kg），于頸部切一小口，在氣管內(nèi)插入塑料插管，然后將插管連接到AniRes2005 動(dòng)物肺功能分析系統(tǒng)（Bestlab，北京）上，測(cè)量每分鐘通氣量（MVV）、用力呼氣量（FVC）、0.3 s用力呼氣量（FEV0.3）和呼出25%FVC氣量時(shí)的流速（FEV0.3/FVC%）。

1.4 肺泡灌洗液（BALF）收集

給藥28 d 后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉幼鼠（0.1 g/kg），暴露肺和氣管，結(jié)扎右主支氣管。插入灌洗管灌洗左肺，收集BALF。

1.5 肺組織濕/干重比（W/D）測(cè)定

給藥28 d 后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉幼鼠（0.1 g/kg），取右上肺，去除肺表面水分和血跡，稱(chēng)重，即為濕重（W）。隨后65 ℃恒溫箱干燥肺組織，48 h后稱(chēng)重，即為干重（D）。計(jì)算各組大鼠W/D值。

1.6 蘇木精—伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色檢測(cè)大鼠肺組織病理學(xué)變化

大鼠肺組織用4%多聚甲醛固定72 h，梯度酒精脫水，二甲苯透明。石蠟包埋、切片。石蠟切片常規(guī)二甲苯、乙醇脫蠟至水，蘇木素染色10 min，0.7%鹽酸乙醇分化數(shù)秒，流水洗滌后，伊紅液浸染3 min。梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。切片于光學(xué)顯微鏡下放大觀察分析。按照參考文獻(xiàn)[10]中的方法，對(duì)肺組織病理學(xué)損傷進(jìn)行評(píng)分：0 分，無(wú)損傷；1 分，1～25%損傷；2 分，＞25～50%損傷；3 分，＞50～75%損傷。

1.7 AB-PAS染色檢測(cè)杯狀細(xì)胞增生

按“1.6”項(xiàng)方法制備肺石蠟切片，脫蠟至水。阿爾辛藍(lán)染液浸染10 min水洗后，0.5%高錳酸水溶液氧化10 min 水洗后，雪夫試劑避光浸染30 min；流水沖洗后，蘇木精復(fù)染核1 min，鹽酸酒精分化，氨水返藍(lán)。梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)脂封固，顯微鏡觀察并拍照，用Image Pro Plus6.0 軟件測(cè)量相應(yīng)支氣管上皮AB-PAS 陽(yáng)性面積和總面積，按照以下公式計(jì)算AB/PAS 陽(yáng)性率：AB/PAS 陽(yáng)性率=（AB-PAS陽(yáng)性面積/總面積）×100%

1.8 免疫組化檢測(cè)大鼠肺組織MUC5AC表達(dá)

腎臟石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，3% H2O2避光孵育15 min，PBS清洗后，5%BSA避光孵育1 h，MUC5AC 一抗稀釋液（1:100）4 ℃孵育過(guò)夜。二抗稀釋液（1:200）避光孵育1 h。DAB 顯色液顯色，蘇木素染液染色5 min。自來(lái)水沖洗，1%鹽酸酒精溶液分化10 s。0.2%氨水做返藍(lán)處理8 s。自來(lái)水沖洗后，切片進(jìn)行脫水、透明處理，中性樹(shù)膠封片，光學(xué)顯微鏡觀察分析。

1.9 Western blotting 檢測(cè)MUC5AC、RORγt、Foxp3和IL-13/STAT6通路蛋白表達(dá)

將各組大鼠肺組織剪碎，RIPA 裂解液裂解組織，離心取上清，BCA法測(cè)定蛋白濃度。取30 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)至PVDF 膜上。10%脫脂奶粉封閉，隨后加入MUC5AC（1:1 000）、RORγt（1:1 000）、Foxp3（1:1 000）、IL-13（1:1 000）、p-STAT6（1:2 000）、STAT6（1:500）和GAPDH（1:5 000）抗體，4 ℃條件下過(guò)夜孵育。加入二抗（1:5 000）室溫孵育1 h 后，滴加BeyoECL Star 工作液到膜上，化學(xué)發(fā)光成像儀檢測(cè)。

1.10 ELISA 檢測(cè)TNF-α、TGF-β、IL-6、IL-10 和IL-17A水平

取大鼠5 mL BALF，4 ℃條件下3 000 rpm 離心10 min，取上清液。根據(jù)ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)上清液中TNF-α、TGF-β、IL-6、IL-10 和IL-17A 水平，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各炎性因子水平。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 丹酚酸B 對(duì)慢阻肺大鼠肺功能及W/D 比值的影響

與對(duì)照組相比，模型組大鼠FEV0.3、FEV0.3/FVC和MVV 顯著降低（P＜0.05），W/D 比值顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，丹酚酸B 組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠MVV 顯著升高（P＜0.05），W/D 比值顯著降低（P＜0.05），F(xiàn)EV0.3、FVC 和FEV0.3/ FVC 無(wú)顯著變化（P＞0.05），見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠肺功能參數(shù)及W/D比值的比較

表1 各組大鼠肺功能參數(shù)及W/D比值的比較

與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

2.2 丹酚酸B 對(duì)慢阻肺大鼠肺組織病理學(xué)損傷的影響

HE 染色下可見(jiàn)對(duì)照組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)正常，與對(duì)照組（0.78±0.02）相比，模型組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)被破壞，伴有明顯的肺泡腔內(nèi)出血，同時(shí)肺組織病理學(xué)評(píng)分顯著升高（2.67±0.04，P＜0.05）；與模型組相比，丹酚酸B 組（1.38±0.01）和陽(yáng)性對(duì)照組（1.51±0.02）大鼠肺組織病理學(xué)變化明顯改善，肺組織病理學(xué)評(píng)分亦顯著降低（P＜0.05）,見(jiàn)圖1。

圖1 HE染色檢測(cè)各組大鼠肺組織病理學(xué)變化（400×）

2.3 丹酚酸B對(duì)慢阻肺大鼠杯狀細(xì)胞增生的影響

與對(duì)照組（0）相比，模型組支氣管上皮杯狀細(xì)胞增多，AB/PAS 陽(yáng)性率顯著升高（17.56±0.84）%，P＜0.05）；與模型組相比，丹酚酸B組（6.89±0.89）%和陽(yáng)性對(duì)照組（5.38±0.83）%大鼠支氣管上皮杯狀細(xì)胞明顯減少，AB/PAS陽(yáng)性率顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)圖2。

2.4 丹酚酸B對(duì)慢阻肺大鼠黏液高分泌的影響

與對(duì)照組相比，模型組大鼠肺組織中MUC5AC表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，丹酚酸B組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠MUC5AC 表達(dá)顯著降低（P＜0.05）,見(jiàn)圖3～圖4。

圖4 各組大鼠肺組織MUC5AC表達(dá)

2.5 丹酚酸B對(duì)慢阻肺大鼠IL-13/STAT6通路的影響

與對(duì)照組相比（IL-13，0.12±0.13；p-STAT6，0.38±0.23），模型組大鼠IL-13（2.61±0.13）和p-STAT6（2.41±0.06）表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，丹酚酸B 組大鼠IL-13（0.82±0.03）和p-STAT6（1.23±0.08）表達(dá)顯著降低（P＜0.05），與模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照組IL-13（0.8±0.02）和p-STAT6（1.21±0.06）表達(dá)顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)圖5。

圖5 各組大鼠IL-13和p-STAT6表達(dá)

2.6 丹酚酸B對(duì)慢阻肺大鼠炎性因子水平的影響

與對(duì)照組相比，模型組大鼠TNF-α、TGF-β 和IL-6 水平顯著升高（均P＜0.05）；與模型組相比，丹酚酸B 組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠TNF-α、TGF-β 和IL-6水平顯著降低（均P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠BALF 中TNF-α、TGF-β和IL-6水平的比較pg/mL，

表2 各組大鼠BALF 中TNF-α、TGF-β和IL-6水平的比較pg/mL，

與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

2.7 丹酚酸B對(duì)慢阻肺大鼠Th17/Treg平衡的影響

與對(duì)照組相比，模型組大鼠RORγt 表達(dá)和IL-17A水平顯著升高（均P＜0.05），F(xiàn)oxp3表達(dá)和IL-10水平顯著降低（均P＜0.05）；與模型組相比，丹酚酸B 組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠RORγt 表達(dá)和IL-17A 水平顯著降低（P＜0.05），F(xiàn)oxp3 表達(dá)和IL-10 水平顯著升高（P＜0.05），見(jiàn)圖6，表3。

表3 各組大鼠BALF 中IL-10和IL-17A水平的比較pg/mL，

表3 各組大鼠BALF 中IL-10和IL-17A水平的比較pg/mL，

與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

圖6 各組大鼠RORγt和Foxp3表達(dá)

3 討論

已有研究表明，丹酚酸B可促進(jìn)肺細(xì)胞增殖、遷移，并抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，從而逆轉(zhuǎn)肺泡結(jié)構(gòu)的破壞[13]。本研究結(jié)果表明，丹酚酸B 可改善COPD大鼠肺功能及肺組織病理學(xué)變化。COPD發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，氣道黏液高分泌是其重要的病理特征[12]。氣道黏液的主要成分是糖蛋白，而這些復(fù)雜的糖蛋白主要是在粘蛋白（Mucin，MUC）基因的調(diào)控下進(jìn)行合成。粘蛋白5AC（Mucin5AC，MUC5AC）是氣道上皮杯狀細(xì)胞表達(dá)的主要基因之一[14]。香煙煙霧、細(xì)菌產(chǎn)物、細(xì)胞因子（如IL-13）、趨化因子和中性粒細(xì)胞蛋白酶等刺激物均可上調(diào)MUC5AC 的表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)杯狀細(xì)胞發(fā)生增生或化生[15]。據(jù)報(bào)道，抑制IL-13的產(chǎn)生可抑制JAK2/STAT6途徑活化，進(jìn)一步抑制哮喘小鼠的MUC5AC 表達(dá)和黏液高分泌[16]。本研究結(jié)果顯示，丹酚酸B 通過(guò)抑制IL-13/STAT6通路，進(jìn)一步抑制了COPD大鼠MUC5AC表達(dá)和黏液高分泌，與文獻(xiàn)報(bào)道的研究結(jié)果一致。

CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（T regulatory cells，Treg）是CD4+T 細(xì)胞的另一個(gè)亞型，在慢性炎癥過(guò)程中，通過(guò)接觸或釋放抑制性細(xì)胞因子（如IL-10）發(fā)揮對(duì)其他免疫細(xì)胞的負(fù)向調(diào)控作用[17]。IL-10主要由Tregs 產(chǎn)生，具有抑制促炎細(xì)胞因子和趨化因子的分泌及抑制Th17 分化的功能。同時(shí)，IL-10參與了Tregs 的分化，長(zhǎng)期吸入煙霧的大鼠外周血和BALF 中IL-10 減少，而TGF-β 的變化趨勢(shì)則相反[18]。Th17被IL-6、IL-1和TNF-α激活分化，產(chǎn)生標(biāo)志性細(xì)胞因子IL-17A；同時(shí)，Th17 特異性轉(zhuǎn)錄因子RORγt能促進(jìn)Th17分化與表達(dá)[19]。Foxp3是Treg分化所必需的特異性轉(zhuǎn)錄因子，IL-10和TGF-β可上調(diào)其表達(dá)，ROR-γt 可抑制其表達(dá)。最近的研究表明，F(xiàn)oxp3 的缺失可抑制Treg 的分化，導(dǎo)致嚴(yán)重的自身免疫和炎癥性疾病[20]。在COPD 患者和動(dòng)物模型中，Treg和Treg相關(guān)細(xì)胞因子的產(chǎn)生和功能都受到了明顯抑制[21]。而鑒于RORγt/Foxp3 介導(dǎo)的高Th17/Treg比值在COPD慢性炎癥中起關(guān)鍵作用[22]，本研究進(jìn)一步探究發(fā)現(xiàn)與正常大鼠相比，COPD 大鼠肺組織IL-10 水平及Foxp3 表達(dá)均明顯降低，TNF-α、TGF-β、IL-6 和IL-17A 水平和ROR-γt 表達(dá)明顯升高，而丹酚酸B 治療后可逆轉(zhuǎn)上述變化。提示丹酚酸B 可促進(jìn)COPD 大鼠Th17/Treg 平衡的恢復(fù)。

綜上所述，丹酚酸B 通過(guò)IL-13/STAT6 抑制COPD 大鼠黏液高分泌，并恢復(fù)Th17/Treg 平衡，在COPD中起到保護(hù)作用。該研究結(jié)果為明確丹酚酸B在COPD中的作用機(jī)制及開(kāi)發(fā)新的治療藥物提供了新的理論與實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)。