傅 文，農(nóng)小連，劉可鵬，藍雨雁

（廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧 530021）

神經(jīng)病理性疼痛（neuropathic pain，NP）是指由中樞或周圍神經(jīng)系統(tǒng)軀體感覺傳導(dǎo)通路的損傷或疾病所導(dǎo)致的疼痛。損傷或疾病痊愈后疼痛仍可持續(xù)，常演變?yōu)槁蕴弁?，表現(xiàn)為異常性疼痛和痛覺過敏[1]。一般人群NP 患病率在6.9%～10.0%[2]。NP 發(fā)病率高，但診斷和治療較為困難，患者除疼痛外常伴有焦慮、抑郁和睡眠障礙，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[3]。糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛表達，是調(diào)節(jié)正常大腦結(jié)構(gòu)和功能突觸可塑性的關(guān)鍵信號分子，通過其磷酸化位點影響神經(jīng)元的保護或變性[4]，參與神經(jīng)元發(fā)育和神經(jīng)退行性變相關(guān)的神經(jīng)元凋亡過程[5]。研究表明，NP大鼠背根神經(jīng)節(jié)（dorsal root ganglion，DRG）中發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS），GSK-3β在ERS期間被激活[6-7]，而抑制GSK-3β可顯著減弱體內(nèi)和體外的ERS 程度[8-9]。然而，GSK-3β在NP 大鼠DRG 神經(jīng)元細(xì)胞ERS 時通過何種途徑參與NP的具體機制目前仍不清楚。本課題組前期體內(nèi)實驗研究發(fā)現(xiàn)，通過鞘內(nèi)注GSK-3β 抑制劑A014418 可以減輕慢性坐骨神經(jīng)壓迫（chronic constrictive injury，CCI）大鼠的機械痛閾值和熱痛閾值，減輕ERS相關(guān)蛋白BIP和CHOP的表達，對CCI大鼠具有較好的鎮(zhèn)痛作用。

本實驗通過體外建立衣霉素（TM）誘導(dǎo)的大鼠DRG 神經(jīng)元細(xì)胞ERS 模型模擬NP 大鼠DRG 神經(jīng)元細(xì)胞ERS，并給予A014418，探究GSK-3β 對大鼠DRG 神經(jīng)元細(xì)胞ESR 與凋亡的影響，為尋找新的NP治療方法提供思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和主要試劑 大鼠DRG神經(jīng)元細(xì)胞系購于上海賽百慷生物技術(shù)公司。TM購自北京索萊寶科技有限公司。DMEM低糖培養(yǎng)基、10%胎牛血清（FBS）（Gibco 公司，美國）；Total RNA 提取試劑、實時熒光定量PCR（qPCR）試劑盒（Takara 公司，日本）；PCR 擴增引物（生工生物公司，中國）；實時熒光定量PCR 儀（ABI7500，賽默飛公司，美國)；GSK-3β抑制劑A014418（MCE公司，美國）；兔抗GSK-3β抗體、兔抗磷酸化（p）-GSK-3β 抗體（CST 公司，美國）；兔抗GRP78/BIP 抗體、兔抗Bcl-2 抗體、兔抗Bax 抗體、山羊抗兔及山羊抗鼠二抗（Abcam 公司，英國）；兔抗鼠Tubμlin抗體（中杉金橋公司，中國）；超敏ECL化學(xué)發(fā)光底物試劑盒（雅酶公司，中國）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和分組 大鼠DRG 神經(jīng)元細(xì)胞用10%FBS、1%青—鏈霉素混合液的低糖DEME培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，及時換液、傳代。取對數(shù)生長期細(xì)胞進行實驗。將細(xì)胞分為4 組：空白對照組（C 組）、TM 組、TM+A014418 組（TM+A 組）和單獨A014418 組（A 組）。TM 組和TM+A 組 以2 μg/mL TM作用24 h誘導(dǎo)細(xì)胞ERS[10]。TM+A 組和A 組加入10 μmol/L GSK-3β 抑制劑A014418作用24 h。C組細(xì)胞不作任何處理。

1.3 CCK-8法檢測大鼠DRG神經(jīng)元細(xì)胞活性 收集各組DRG神經(jīng)元細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度（5×104個/mL），96 孔板中每孔加入100 μL，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)24 h后，加入CCK-8溶液10 μL，混勻后繼續(xù)培養(yǎng)2 h。用酶標(biāo)儀檢測450 nm波長處各孔的吸光度（OD）值，計算細(xì)胞存活率。

1.4 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）法檢測大鼠GSK-3β、Bax、BIP 和Bcl-2 mRNA 表達 提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，按照試劑盒說明書，進行PCR擴增，PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性15 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火、延伸34 s，共40個循環(huán)。引物序列如下：GSK-3β 上游：5’-GACAGTGGTGTGGATCAGTTGGTG-3’，下游：5’-GCGATTGCCTCTGGTGGAGTTC-3’；Bax 上游：5’-GACGCATCCACCAAGAAGCTGAG-3’，下游：5’-GCTGCCACACGGAAGAAGACC-3’；Bcl-2 上游：5’-GGGCTACGAGTGGGATACTGGAG-3’，下游：5’-TCGGTTGCTCTCAGGCTGGAAG-3’；BIP 上游：5’-CGGAGGAGGAGGACAAGAAGGAG-3’，下游：5’-ATACGACGGTGTGATGCGGTTG-3’；GAPDH 上游：5’-CCAATGTGTCCGTCGCGTGGATCT-3’，下游：5’-GTTGAAGTCGCAGGAGACAACC-3’。用2-ΔΔCT法計算目的基因相對表達量。

1.5 Western blotting 法檢測大鼠GSK-3β、p-GSK-3β、Bax、BIP 和Bcl-2 蛋白表達 取各組DRG 神經(jīng)元細(xì)胞，加入RIPA蛋白裂解液，BCA法檢測蛋白濃度；煮沸使蛋白變性，10% SDS-PAGE 電泳分離蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，脫脂牛奶封閉1 h；分別加入一抗Tubulin（1∶5 000）、GSK-3β（1∶1 000）、Bax（1∶1 000）、p-GSK-3β（1∶800）、BIP（1∶1 000）、Bcl-2（1∶1 000）4 ℃冰箱中孵育過夜，洗膜；加入山羊抗兔二抗（1∶3 000）室溫孵育1 h，洗膜；ECL 發(fā)光液反應(yīng)1 min，掃描圖像后使用Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 A014418能提高大鼠DRG神經(jīng)元細(xì)胞生存率 A 組與C 組細(xì)胞存活率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；TM 組和TM+A 組細(xì)胞存活率較C 組明顯降低（均P＜0.05），TM+A組細(xì)胞存活率明顯高于TM組（P＜0.05），見表1。

表1 4組大鼠DRG神經(jīng)元細(xì)胞生存率比較%，

表1 4組大鼠DRG神經(jīng)元細(xì)胞生存率比較%，

與C組比較，*P＜0.05；與TM組比較，#P＜0.05。

2.2 A014418 下調(diào)BIP、Bax、GSK-3β mRNA 表達，上調(diào)Bcl-2 mRNA 表達 與C 組比較，TM 組BIP、Bax、GSK-3β mRNA 表達上調(diào)，Bcl-2 表達下調(diào)，Bax/Bcl-2 比值升高（均P＜0.05），TM+A 組BIP、Bax mRNA表達上調(diào)，GSK-3β、Bcl-2 mRNA表達下調(diào)，Bax/Bcl-2 比值升高（均P＜0.05），A 組GSK-3β mRNA 表達下調(diào)（P＜0.05），A 組與C 組Bax、BIP 和Bcl-2 mRNA 表達及Bax/Bcl-2 比值比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）；與TM 組比較，TM+A 組GSK-3β、Bax、BIP mRNA表達下調(diào)，Bcl-2 mRNA表達上調(diào)，Bax/Bcl-2比值降低（均P＜0.05），見表2。

表2 4組大鼠DRG神經(jīng)元細(xì)胞BIP、Bax、Bcl-2、GSK-3β mRNA表達比較

表2 4組大鼠DRG神經(jīng)元細(xì)胞BIP、Bax、Bcl-2、GSK-3β mRNA表達比較

與C組比較，*P＜0.05；與TM組比較，#P＜0.05。

2.3 A014418下調(diào)BIP、Bax蛋白表達，上調(diào)p-GSK-3β、Bcl-2 蛋白表達 A 組與C 組BIP、Bax、Bcl-2 和p-GSK-3β 蛋白表達及Bax/Bcl-2 比值、p-GSK-3β/GSK-3β 比值比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）；與C 組比較，TM 組和TM+A 組Bcl-2 和p-GSK-3β蛋白表達下調(diào)，BIP和Bax蛋白表達上調(diào)，p-GSK-3β/GSK-3β 的比值降低，Bax/Bcl-2 比值升高（均P＜0.05）；與TM 組比較，TM+A 組Bcl-2 和p-GSK-3β蛋白表達上調(diào)，BIP和Bax蛋白表達下調(diào)，p-GSK-3β/GSK-3β 比值升高，Bax/Bcl-2 比值降低（均P＜0.05）；4 組GSK-3β 蛋白表達量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），見圖1。

圖1 4組DRG神經(jīng)元細(xì)胞GSK-3β、BIP、Bcl-2、Bax及p-GSK-3β蛋白表達比較

3 討論

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細(xì)胞中最重要的細(xì)胞器之一，主要參與維持胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)以及新生蛋白多肽（膜蛋白、分泌型蛋白）的折疊修飾、并保證新生蛋白多肽折疊的正確、順利進行。多種病理條件，如缺血、缺氧、鈣代謝紊亂以及一些有害因素如損傷、細(xì)菌感染、中毒等刺激下，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生以伴侶蛋白表達及非折疊蛋白反應(yīng)啟動為特征的ERS[11]。如果應(yīng)激反應(yīng)過強或持續(xù)存在，細(xì)胞損傷嚴(yán)重，內(nèi)環(huán)境無法及時恢復(fù)穩(wěn)態(tài)時，則會引起蛋白錯誤折疊，進而引起一系列疾病，如NP。

本課題組前期實驗以及研究報道均證實ERS參與了NP 的發(fā)病過程[12-14]，NP 狀態(tài)下，ERS 相關(guān)蛋白BIP 和CHOP 表達顯著升高，在電子顯微鏡下可觀察到CCI大鼠DRG組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)明顯改變，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面顆粒脫落、腫脹，線粒體脊消失，線粒體空泡化；而在坐骨神經(jīng)周圍局部浸潤GSK-3β 抑制劑后，DRG組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)只有少數(shù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體輕度腫脹[15-16]，提示CCI大鼠DRG組織發(fā)生ERS，并可能存在線粒體功能障礙。有研究表明，TM 通過N-糖基化作用，可影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)蛋白質(zhì)的合成和修飾，導(dǎo)致異常蛋白質(zhì)積累誘發(fā)ERS[17-18]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，采用TM 濃度為2 μg/mL，作用24 h為條件構(gòu)建誘導(dǎo)大鼠DRG 神經(jīng)元細(xì)胞ERS 模型較為合適。在此條件下，體外建立TM 誘導(dǎo)的大鼠DRG神經(jīng)元細(xì)胞ERS模型中，檢測到ERS相關(guān)基因BIP、Bax mRNA和蛋白表達顯著上調(diào)，Bcl-2 mRNA和蛋白表達顯著下調(diào)，因此本實驗?zāi)Ｐ偷慕⑹浅晒Φ?。此外，通過CCK-8 檢測細(xì)胞活性發(fā)現(xiàn)TM 誘導(dǎo)ERS使細(xì)胞存活率顯著降低，提示ERS可能促進大鼠DRG神經(jīng)元細(xì)胞凋亡。

GSK-3β是一種在進化上非常保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，參與調(diào)節(jié)眾多蛋白質(zhì)的磷酸化。在ER應(yīng)激中，BIP 通過促進GSK-3β 與tau 的結(jié)合，在GSK-3β 依賴性tau 過度磷酸化中起著重要作用[19]。A014418 作為一種ATP 競爭性的GSK-3β 抑制劑，抑制GSK-3β特異性位點（Ser-396）的tau磷酸化，具有抗細(xì)胞凋亡效果[20]，且本身不影響神經(jīng)元細(xì)胞活力[21]，因此，本研究選擇A014418 作為GSK-3β 抑制劑。A014418 處理TM 組細(xì)胞后，p-GSK-3β（Ser9）表達上調(diào)，證明了A014418 對GSK-3β 活性的抑制作用。Bax、Bcl-2 蛋白是影響細(xì)胞凋亡的重要分子[22]，兩者比值是調(diào)控細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因素[23]。本研究中，A014418 使TM 誘導(dǎo)ERS 大鼠DRG 神經(jīng)元細(xì)胞的ERS 相關(guān)分子伴侶BIP mRNA 表達顯著下調(diào)，細(xì)胞凋亡相關(guān)Bax mRNA 與蛋白表達顯著下調(diào)，Bcl-2 mRNA與蛋白表達顯著上調(diào)，Bax/Bcl-2比值降低，細(xì)胞存活率顯著升高，而單獨應(yīng)用A014418對未發(fā)生ERS 大鼠DRG 神經(jīng)元細(xì)胞的生存狀態(tài)則無明顯影響，驗證了A014418 的抗凋亡效果。這些結(jié)果提示，抑制GSK-3β 磷酸化，能減輕TM 誘導(dǎo)大鼠DRG神經(jīng)元細(xì)胞的ERS，減少細(xì)胞凋亡。值得注意的是，經(jīng)多次重復(fù)實驗，本研究發(fā)現(xiàn)各組GSK-3β mRNA 表達有差異，而蛋白表達卻無差異，這可能與轉(zhuǎn)錄后，蛋白未能完成完整的翻譯、折疊、修飾等過程，從而影響其抗原性有關(guān)。同時，在ESR時，被激活的GSK-3β 通過何種途徑對大鼠DRG 神經(jīng)元細(xì)胞ERS產(chǎn)生影響，并導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。這些問題仍需進一步的實驗研究論證。

綜上所述，抑制GSK-3β磷酸化可減輕TM誘導(dǎo)的大鼠DRG 神經(jīng)元細(xì)胞ERS，減少細(xì)胞凋亡。GSK-3β有望成為治療NP的一個新靶點。