彭 珣，趙若蓓，黃愛芳，潘小潔，高天云，潘 玲

（廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，南寧 530021）

急性腎損傷（acute kidney disease,AKI）為臨床常見的急危重癥疾病，發(fā)病率高，預(yù)后不容樂觀，耗費巨大的醫(yī)療資源。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，發(fā)達國家AKI住院患者占住院總?cè)藬?shù)的3.2%～9.6%[1-3]，AKI院內(nèi)總體病死率約為10%～20%[4]，國內(nèi)報道顯示醫(yī)院住院患者AKI發(fā)病率為0.15%～11.20%，病死率為5.00%～23.33%[5-6]。AKI 不僅有高發(fā)病率及死亡率，還是慢性腎臟?。–KD）的重要原因[7]。有研究提示，高危住院患者中的AKI 約40%遺留慢性腎臟損害，10%～20%甚至需要持續(xù)性透析。目前已知的影響AKI 發(fā)生及進展的危險因素較多，相關(guān)機制復(fù)雜。其中，腎小管上皮細胞損傷及纖維化變被認為是AKI 發(fā)生進展甚至慢性化轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵機制[8]，尤其腎小管細胞凋亡是腎纖維化重要原因，但具體機制尚不清楚。近年有研究表明，Hedgehog（Hh）/Gli 通路是腎纖維化的重要信號通路[9-10]，Gli 是一種特別的血管周圍間充質(zhì)干細胞（MSCs）的標志物，而這種血管周圍MSCs 是肌成纖維細胞的重要來源。Gli 有Gli1，Gli2 及Gli3 三種類型，其中Gli2 則是導(dǎo)致腎小管上皮細胞損傷及修復(fù)不良的一種鋅指蛋白，也是肌成纖維細胞活化過程中的驅(qū)動因子[11]，調(diào)控Hedgehog通路下游靶基因的激活和轉(zhuǎn)錄，引起腎小管上皮細胞凋亡，導(dǎo)致腎小管損傷及纖維化轉(zhuǎn)變。

目前Hedgehog/Gli2 通路在AKI 發(fā)生發(fā)展中的作用及機制研究鮮少。本課題組擬運用短發(fā)夾RNA（shRNA）沉默、過表達、實時熒光定量PCR（RT-qPCR）及流式細胞儀凋亡測定等技術(shù)，通過順鉑刺激腎小管上皮細胞構(gòu)建AKI 體外細胞模型進行研究，探討Hedgehog 通路關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Gli2 在AKI 腎小管上皮細胞凋亡及纖維化轉(zhuǎn)變中的作用，為AKI發(fā)生及進展的防治提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 細胞株與主要試劑

大鼠腎小管上皮細胞NRK52E，購于中國科學(xué)院上海細胞庫。DMEM 培養(yǎng)基購于美國Gibco 公司，順鉑購于美國Sigma公司，細胞凋亡試劑盒購自杭州聯(lián)科生物公司，CCK-8試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司，RNA提取試劑盒購自美國Axygen公司，熒光定量試劑盒購自美國ABclonal 公司。Gli2 沉默和過表達慢病毒均購自上海吉凱基因公司。

1.2 細胞培養(yǎng)及順鉑干預(yù)

NRK52E 細胞用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基在5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細胞匯合度達到80%～90%，胰酶消化細胞，調(diào)整細胞密度約5×105個/mL 接種至6 孔板內(nèi)，分別加入0 μmol/L、12.5 μmol/L、25 μmol/L 的順鉑刺激24 h，提取總RNA，用RT-qPCR法檢測Gli2表達水平的情況。

取對數(shù)生長期的NRK52E 細胞接種至6 孔板內(nèi)，加入Gli2 沉默和過表達慢病毒感染48 h 后，更換新鮮培養(yǎng)基，加入嘌呤霉素篩選，殺死轉(zhuǎn)染失敗的無抗性細胞。取部分細胞，提取總RNA，用RTqPCR 法檢測沉默和過表達效率。細胞分組如下：沉默空載組、沉默Gli2 組、過表達空載組及過表達Gli2 組，沉默Gli2 組感染沉默Gli2 慢病毒，沉默空載組感染沉默對照慢病毒，過表達Gli2組感染過表達Gli2慢病毒，過表達空載組感染過表達對照慢病毒，然后每組均分別用順鉑12.5 μmol/L 處理細胞24 h，建立順鉑所致腎損傷體外細胞模型。

1.3 細胞凋亡檢測

順鉑12.5 μmol/L 處理各組細胞24 h 后，取105個細胞，1 200 r/min離心5 min，離心去上清，每管加入50 μL 1×Binding Buffer，重懸，按以下分組加入染料：陰性管：不加任何染料；樣本管：加入5 μL Annexin-V APC 和10 μL 7-AAD，將溶液輕輕地震蕩后，室溫避光孵育15 min，分別加入200 μL 1×Binding Buffer，在1 h內(nèi)進行流式細胞儀檢測。

1.4 RT-qPCR檢測腎損傷、纖維化相關(guān)指標相關(guān)表達量

細胞干預(yù)處理24 h 后收集細胞，提取細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，進行RT-qPCR 檢測，反應(yīng)條件為：95 ℃3 min；95 ℃10 s，60 ℃1 min，40 個循環(huán)；95 ℃10 s，65 ℃1 min，97 ℃1 s。擴增引物由武漢金開瑞生物工程有限公司合成，引物序列見表1。

表1 RT-qPCR引物序列

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0 進行統(tǒng)計學(xué)分析，符合正態(tài)分布的計量資料采用均數(shù)±標準差（）表示，組間比較用t檢驗或者方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 順鉑誘導(dǎo)腎小管上皮細胞損傷中Gli2 表達水平

隨著順鉑濃度的增加，Gli2 的mRNA 表達水平不斷升高（P＜0.05），提示順鉑可呈劑量依賴性誘導(dǎo)NRK52E細胞中Gli2的表達，見圖1。

圖1 不同濃度的順鉑誘導(dǎo)NRK52E 細胞Gli2 水平表達情況（*P＜0.05）

2.2 Gli2沉默和過表達效率檢測

提取轉(zhuǎn)染沉默Gli2 組和過表達Gli2 組慢病毒的NRK52E細胞的總RNA，分別以感染沉默和過表達慢病毒空載質(zhì)粒的NRK52E 細胞為對照，結(jié)果顯示沉默Gli2 組NRK52E 表達水平下調(diào)，沉默效率為65.3%，而過表達Gli2 組Gli2 表達水平上調(diào)4.56 倍（圖2）。結(jié)果表明，我們成功獲得了NRK52E 沉默和過表達Gli2的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株。

圖2 沉默及過表達Gli2效率檢測

2.3 沉默和過表達Gli2 對順鉑處理NRK52E 細胞后AKI和纖維化指標的影響

在沉默Gli2 組和過表達Gli2 組分別予12.5 μmol/L順鉑處理NRK52E細胞24 h后，沉默Gli2組AKI 標志物NGAL 及纖維化標志物αSMA、TGFβ1的mRNA 水平低于沉默空載組，Hedgehog 通路中Smo 的mRNA 水平也顯著低于沉默空載組（均P＜0.05），圖3；過表達Gli2組αSMA水平高于過表達空載組（P＜0.05），NGAL 及TGFβ1 的mRNA 水平與對照組比較無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。

圖3 沉默及過表達Gli2組順鉑刺激細胞后AKI和纖維化指標的情況

2.4 沉默和過表達Gli2 對順鉑處理NRK52E 細胞后細胞凋亡的影響

與沉默空載組比較，沉默Gli2組細胞的早期凋亡、晚期凋亡以及總凋亡百分比、促進凋亡分子Bax和凋亡相關(guān)蛋白Caspase7 的mRNA 水平均較空載組降低（均P＜0.05），見圖4、圖6。

圖4 沉默Gli2對順鉑致AKI的細胞凋亡的影響

與過表達空載組比較，過表達Gli2組細胞的早期凋亡、晚期凋亡以及總凋亡百分比均升高（均P＜0.05），Bax、Caspase3、Caspase7 的mRNA 水平無統(tǒng)計學(xué)差異（均P＞0.05），見圖5、圖6。

圖5 過表達Gli2對順鉑致AKI的細胞凋亡的影響

圖6 沉默和過表達Gli2組順鉑刺激細胞后凋亡標志物表達的情況

3 討論

AKI 發(fā)生及進展的機制復(fù)雜，而急性腎小管壞死（ATN）是最常見的AKI類型，目前認為ATN發(fā)生后引起腎小管上皮細胞損傷，如病因持續(xù)存在則小管上皮細胞修復(fù)不良并轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞，如仍不能糾正則進一步纖維化轉(zhuǎn)變，AKI 易發(fā)生進展至CKD 甚至慢性腎衰[12]。腎小管上皮細胞損傷是AKI 發(fā)生后慢性纖維化轉(zhuǎn)變的啟動機制，腎小管上皮細胞損傷是否修復(fù)不良決定AKI 的臨床轉(zhuǎn)歸。順鉑等腎毒性化療藥物導(dǎo)致的AKI 是臨床常見的ATN類型，順鉑誘導(dǎo)的ATN常用于AKI的基礎(chǔ)實驗研究模型，也被廣泛用作AKI纖維化至慢性腎損傷的模型。我們的研究也是基于順鉑刺激腎小管誘導(dǎo)ATN 的體外細胞實驗探討Gli2 對AKI 腎小管上皮細胞凋亡和纖維化的影響。我們的研究結(jié)果提示，順鉑可誘導(dǎo)NRK52E 細胞中Gli2 的mRNA 表達，并呈劑量依賴性，Hedgehog 通路的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Gli2 可影響順鉑誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞凋亡及纖維化，沉默Gli2能改善順鉑介導(dǎo)AKI的腎小管上皮細胞凋亡，下調(diào)纖維化、AKI 標志物表達，并可下調(diào)Hedgehog 通路蛋白受體Smo 表達。而過表達Gli2 可促進腎小管上皮細胞凋亡率，上調(diào)纖維化標志物。有研究表明，順鉑可激活Hedgehog信號通路參與腎小管損傷，而這個過程中Hedgehog通路下游轉(zhuǎn)錄因子Gli1 及Gli2 的水平也升高，能夠阻斷Hedgehog 信號通路的藥物可同時抑制Gli2 蛋白水平[13]。而另一橫紋肌溶解后AKI 的動物試驗也表明，腎小管受損情況下Hh 通路可發(fā)生滯后激活，AKI 之后的24 h 及72 h 時Hh 通路的Shh 及Gli2 表達明顯上調(diào)[14]，這些均提示Hedgehog/Gli 通路參與調(diào)控AKI腎小管上皮細胞損傷，而Gli2可能是引起AKI發(fā)生及進展的促進因子。此外本研究發(fā)現(xiàn)過表達Gli2組經(jīng)順鉑刺激后，腎小管上皮細胞的早期凋亡、晚期凋亡以及總凋亡百分比均升高。而沉默Gli2組經(jīng)順鉑刺激后，腎小管上皮細胞的早期凋亡、晚期凋亡以及總凋亡百分比均降低，凋亡相關(guān)的關(guān)鍵蛋白Bax 和Caspase7 的mRNA 水平較空載組降低。有研究也發(fā)現(xiàn)，Gli2水平的表達與Bcl-2表達相關(guān)，抑制Gli2表達可以抑制Bcl-2、Bax，Caspase-3和Caspase-9，加速細胞凋亡[15]。這些結(jié)果表明，Gli2可能是通過引起腎小管細胞凋亡而促進了AKI 中腎小管損傷。

近年來，Hedgehog/Gli 信號通路在腎纖維化中的作用倍受關(guān)注[16]，為腎纖維化的防治提供了新的方向。研究表明，Hedgehog/Gli 信號通路的活化促進腎纖維化的形成。Hedgehog信號傳導(dǎo)通路由Hh配體、膜蛋白受體、核轉(zhuǎn)錄因子和下游靶基因4部分組成。Hedgehog 通路起關(guān)鍵作用的核轉(zhuǎn)錄因子為Gli，其中Gli1和Gli2主要作為轉(zhuǎn)錄激活因子發(fā)揮功能，而Gli3主要作為轉(zhuǎn)錄抑制因子發(fā)揮功能[17-18]，而且單獨完全抑制Gli1 時仍不能控制纖維化，提示Gli2 是Hedgehog 通路致腎纖維化中重要的效應(yīng)因子[16]。我們的研究也提示，沉默Gli2能下調(diào)纖維化、AKI標志物表達，并可下調(diào)Hedgehog通路蛋白受體Smo 表達。而過表達Gli2 可促進上調(diào)纖維化標志物。其他研究也表明Hedgehog/Gli2 通路在腎臟纖維化中的明確作用?？赡艿臋C制為Hedgehog 配體活化后對細胞膜上的受體發(fā)揮信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，并通過核轉(zhuǎn)錄因子Gli2影響腎小管上皮細胞周期阻滯，驅(qū)動肌成纖維細胞—細胞周期進展[11]，導(dǎo)致腎小管上皮細胞損傷、修復(fù)不良及轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細胞，作為纖維化的驅(qū)動因子，形成促纖維化微環(huán)境，加速腎纖維化形成和發(fā)展。而降低Gli2蛋白水平，可阻滯隨后的肌成纖維細胞的細胞周期，從而減少腎臟纖維化。研究還認為，Gli2 抑制劑可能有望作為減少肌成纖維細胞增殖而緩解腎纖維化的治療藥物。這些均提示Hedgehog/Gli2 通路在腎損傷纖維化過程中發(fā)揮重要作用，Gli2 作為通路的轉(zhuǎn)錄因子可能是肌成纖維細胞增殖引起纖維化的關(guān)鍵干預(yù)靶點。

綜上，本研究通過順鉑誘導(dǎo)AKI的體外細胞模型探討Gli2 對AKI 中腎小管上皮細胞凋亡及纖維化的機制，研究結(jié)果提示Hedgehog/Gli2通路影響腎小管上皮細胞凋亡及纖維化轉(zhuǎn)變，Gli2 可能在AKI發(fā)生發(fā)展中起重要作用，為闡明AKI后纖維化及慢性化轉(zhuǎn)變的機制提供了一定理論依據(jù)，然本研究僅通過體外實驗層面驗證Gli2 在AKI 腎小管損傷及纖維化中的作用，尚無法闡明Hedgehog/Gli2通路在AKI 發(fā)生發(fā)展中的具體分子機制，有待未來開展更深入的研究探討明確。