劉宏軍， 顧建軍， 高君吟， 王玉秀， 閔凌峰

（揚州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，蘇北人民醫(yī)院呼吸與危重癥科，江蘇揚州，225001）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一種常見的慢性疾病，持續(xù)的呼吸道癥狀和氣流受限是它的主要特征，被認為是來自于各種終生的、動態(tài)的和累積的基因-環(huán)境相互作用的結(jié)果，吸煙是其中最主要的危險因素［1］。它是目前全世界排名前三的死亡原因之一，90%的死亡發(fā)生在低收入和中等收入國家［2］。在2015 年，中國20 歲及20 歲以上的COPD 患者總數(shù)估計為9 990萬，其中相當(dāng)一部分患者未能得到及時診斷［3］。此外，在許多未達到COPD 肺功能診斷標準的人群中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了肺部損害，和某些功能的下降［4］。尋找參與COPD 發(fā)病機制的生物標志物，將有利于COPD的早期發(fā)現(xiàn)、干預(yù)和治療。近年來，高通量測序已廣泛用于研究肺部疾病的發(fā)病機制［5］，多個COPD 相關(guān)的差異基因被發(fā)現(xiàn)，由于檢測和分析方法的局限性，目前仍不能完全解釋COPD 發(fā)病原因［6-7］。有人嘗試利用多個數(shù)據(jù)集綜合分析，提高可靠性，獲得了一定成果［8］。在本研究中，我們利用差異分析方法，鑒定出在多個COPD 相關(guān)mRNA 數(shù)據(jù)集中均差異表達的2 個基因為FGG和FGA，結(jié)合不同數(shù)據(jù)庫來源、不同組織樣本、不同種屬的數(shù)據(jù)集分析它們的表達特點，結(jié)果提示纖維蛋白原γ 鏈（fibrinogen gamma chain，F(xiàn)GG）和纖維蛋白原α 鏈（fibrinogen alpha chain，F(xiàn)GA）可能是參與COPD 發(fā)病機制的生物標志物。FGG 與FGA 在蛋白水平與mRNA 表達是否一致不得而知，因此我們構(gòu)建了小鼠吸煙模型進行了驗證，具體報告如下。

材 料 和 方 法

1 數(shù)據(jù)分析

1.1 數(shù)據(jù)來源 從基因表達數(shù)據(jù)庫（GEO）找到3個人肺組織來源的mRNA 表達數(shù)據(jù)集GSE57148、GSE47460（測序平臺：GPL14550）、GSE76925，人小氣道上皮（支氣管鏡刷檢獲得）來源數(shù)據(jù)集GSE5058，小鼠肺組織來源數(shù)據(jù)集GSE17737。腫瘤基因組圖譜數(shù)據(jù)庫（the Cancer Genome Atlas，TCGA）獲得病理正常的癌旁肺組織的mRNA表達數(shù)據(jù)。

1.2 差異基因獲取方法 利用R 軟件的limma包對GSE57148 表達矩陣數(shù)據(jù)進行差異基因分析，使用GEO2R 在線分析獲得GSE47460（GPL14550 平臺）數(shù)據(jù)集差異基因的.txt文件，顯著差異基因標準為|log-FC|＞0.5，adj.P. Val＜0.05，對獲得的兩組差異基因取交集，在GSE76925 進行GEO2R 在線分析獲得的差異基因文件中進行驗證。

1.3 GO 分析 在DAVID 網(wǎng)站（6.8）對獲得的上調(diào)基因及下調(diào)差異基因分別做GO 富集分析，以P＜0.05，F(xiàn)DR＜0.01為標準篩選結(jié)果。

1.4 基因表達特征分析 選擇人肺組織數(shù)據(jù)集GSE76925、小氣道上皮數(shù)據(jù)集GSE5058、小鼠肺組織數(shù)據(jù)集GSE17737 和TCGA 病理正常的癌旁肺組織的mRNA 表達數(shù)據(jù)，在各個表達矩陣中提取FGG 與FGA 的mRNA 表達值，結(jié)合各組數(shù)據(jù)包含的吸煙或COPD狀態(tài)信息進行特征分析。

2 實驗方法

2.1 動物模型構(gòu)建及樣本取材 雄性C57BL/6J 小鼠（8周齡，體重20～25 g）16只購自北京維通利華實驗動物中心，許可證號為SCXK（京）2016-0006。隨機分配為對照組與吸煙組，每組8 只，采用煙熏法建立小鼠COPD 模型，對照組予新鮮空氣，吸煙組在自制染毒箱內(nèi)以南京牌香煙（焦油量11 mg）煙霧（cigarette smoke，CS）作為刺激物處理30 min，每次使用5支香煙，每天2 次，間隔4 h，每周暴露5 天，連續(xù)處理24 周，處理完成后麻醉小鼠行氣管插管，0.8 mL 生理鹽水沖洗肺部3 次，收集支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF），從胸腔取肺，左肺制勻漿離心后凍存上清，右肺行組織切片，4%甲醛固定肺組織24 h后石蠟包埋。所有動物實驗方案均經(jīng)揚州大學(xué)研究倫理委員會批準。

2.2 ELISA 采用ELISA 試劑盒，按說明書操作，檢測小鼠肺組織及肺泡灌洗液中白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）水平。

2.3 HE 染色及免疫組化染色 蠟塊樣本正中矢狀面切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇洗脫二甲苯，蘇木紫染色，1%酸性乙醇分化后水洗，伊紅染色后，梯度乙醇脫水，二甲苯透明后蓋片，觀察肺泡間隙擴大情況。蠟塊樣本正中矢狀面切片，以二甲苯脫蠟、乙醇水合、檸檬酸鈉高溫修復(fù)、兔抗小鼠FGG、FGA、α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）和E-鈣黏蛋白（E-cadherin）抗體孵育；山羊抗兔IgG H＆amp;L（HRP）Ⅱ抗在室溫下染色20 min，最后DAB 反應(yīng)顯色。所有切片均采用Olympus顯微鏡拍攝。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學(xué)處理，所有實驗均獨立重復(fù)3 次，計量資料使用均數(shù)±標準差（mean±SD）表示，多組間比較采用單因素方差分析，并采用SNK 法進行事后比較，兩組均數(shù)間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1 篩選差異基因

以adj.P.Val＜0.05 和|logFC|＞0.5 的閾值進行篩選之后，GSE57148 數(shù)據(jù)集中鑒定出850 個差異基因（上調(diào)495 個，下調(diào)355 個），GSE47460（GPL14550）鑒定出238 個差異基因（139 個上調(diào)，99 個下調(diào)）。兩組取交集獲得共同的COPD 與非COPD 差異基因（上調(diào)22 個，下調(diào)7 個），在GSE76925 差異基因結(jié)果中進行驗證，仍然符合adj.P. Val＜0.05 和|logFC|＞0.5 標準的差異基因包括8 個上調(diào)的差異基因，分別是FGA、FGG、COL14A1、COMP、NPTX1、TIMP4、GREM1和CYP1B1，及2 個下調(diào)差異基因分別是SLITRK6和PRPH。

2 GO分析結(jié)果

在DAVID 網(wǎng)站（6.8 版本）對上調(diào)基因及下調(diào)基因分別做GO 富集分析，選擇P＜0.01，F(xiàn)DR＜0.01 為標準，下調(diào)基因無陽性結(jié)果。上調(diào)差異基因GO 分析結(jié)果主要包含生物學(xué)過程、細胞定位和分子功能3個方面，其中生物學(xué)過程結(jié)果主要有細胞外基質(zhì)組織、膠原原纖維組織、凝血，纖維蛋白凝塊形成、肽類激素分泌的正調(diào)控等；基因主要定位于細胞外間隙、纖維蛋白原復(fù)合物、細胞外基質(zhì)、血小板α 顆粒中；分子功能僅包括一項蛋白質(zhì)結(jié)合、橋接。其中FGA與FGG 以及COL14A1，共同定位于細胞間隙，參與細胞外基質(zhì)及膠原纖維合成等生物學(xué)過程，涉及分子功能是蛋白質(zhì)結(jié)合和橋接。FGA與FGG還共同參與凝血，纖維蛋白凝塊形成等其他多個生物學(xué)過程。

3FGG與FGA基因表達量與吸煙及COPD的關(guān)系

COPD患者肺組織FGG與FGA的表達以及FGG/FGA（FGG 與FGA 表達量的比值）均高于表型正常的吸煙者（P＜0.05），見圖1A、B。為分析它們診斷COPD 的價值，對FGG/FGA、FGG 和FGA 分別作ROC曲線分析，F(xiàn)GG/FGA 曲線下面積為0.7315，F(xiàn)GG 與FGA 曲線下面積分別為0.7097 和0.6275，見圖1C。吸煙20 包1 年以上者肺組織的FGG 表達與FGG/FGA 高于吸煙20 包1 年以下的低劑量吸煙者，見圖1D、E。TCGA 數(shù)據(jù)顯示當(dāng)前吸煙者肺組織FGG與FGA 表達顯著高于非吸煙者，戒煙小于15 年者仍不能完全恢復(fù)正常，見圖1F。

Figure 1. FGG and FGA expression in the lung were affected by smoking and COPD. A：expression of FGG and FGA in smokers and COPD patients；B：the ratio of FGG to FGA expression in smokers and COPD patients；C：ROC analysis of FGG，F(xiàn)GA and FGG/FGA；D：FGG and FGA expression in the lungs analyzed according to the number of cigarettes packs-year；E：the ratio of FGG to FGA expression in the lungs analyzed according to the number of cigarettes packs-year；F：FGG and FGA expression in pathologically normal lung tissue from patients from TCGA by different smoking status. Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01vs smokers；#P＜0.05vs 0～20 group；△P＜0.05vs non-smokers；△P＜0.05vs current smokers.圖1 FGG與FGA表達受吸煙史及COPD疾病的影響

肺組織的FGG 與FGA 水平不受年齡和性別的強烈影響，見圖2A、B。小氣道上皮來源的數(shù)據(jù)中，F(xiàn)GG 與FGA 水平在COPD 患者中同樣高于表型正常的吸煙者，COPD 組患者FGA 表達水平高于COPD 早期分組，且在COPD 早期分組又高于表型正常吸煙者，見圖2C。香煙煙霧處理同樣會導(dǎo)致小鼠肺組織FGG與FGA基因表達增高，煙霧處理時間越長，這種趨勢越明顯，脫毒處理后這種趨勢可以部分逆轉(zhuǎn)，見圖2D。

Figure 2. Relationship between FGG and FGA expression with age，sex，tissue origin and species. A：FGG and FGA expression in lungs from the GSE76925 by sex；B：FGG and FGA expression in lungs from the GSE76925 by age；C：FGG and FGA expression in human tracheal epithelia；D：FGG and FGA expression in the lungs of mice that were sham-treated or that were exposed to cigarette smoke for different weeks. Mean±SD.n=3.*P＜0.05vs smokers group；#P＜0.05vs early COPD group；△P＜0.05vs sham group；＠P＜0.05vs smoke 12 weeks group；▲P＜0.05vs smoker 24 weeks group.圖2 FGG和FGA表達與年齡、性別和組織來源與種屬的關(guān)系

4 小鼠肺組織與肺泡灌洗液中IL-6水平的變化

經(jīng)ELISA 試劑盒檢測，吸煙組小鼠肺泡灌洗液及肺組織勻漿中，IL-6 水平均高于對照組（P＜0.01），見表1。

表1 ELISA檢測小鼠BALF及肺組織勻漿中IL-6的水平Table 1. Detection of IL-6 in BALF and lung homogenate of the mice by ELISA（ng/L. Mean±SD.n=8）

5 小鼠肺組織HE染色觀察

如圖3 所見，吸煙組小鼠肺組織可見部分肺泡腔擴大、肺泡間隔斷裂、肺泡腔融合形成，而對照組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)相對完整。

Figure 3. HE staining of mouse lung tissues. The mice in the 2 groups were treated with air and cigarette smoke，respectively.圖3 小鼠肺組織HE染色

6 小鼠肺組織FGG、FGA、α-SMA 與E-cadherin水平的變化

免疫組織化學(xué)方法檢測小鼠肺組織FGG、FGA、α-SMA與E-cadherin的表達，結(jié)果表明香煙煙霧處理可致肺組織中FGG、FGA 和α-SMA 水平升高，E-cadherin 水平下降，F(xiàn)GG 與FGA 主要表達于支氣管及肺泡上皮細胞，以肺泡上皮細胞為主，見圖4。

討論

本研究中，我們對GSE57148 與GSE47460 數(shù)據(jù)集分別進行了差異基因分析后取交集，以上數(shù)據(jù)集的共同特點是均采用COPD 患者與非COPD 患者的分組方式，均為肺組織標本，每組樣本量都大于90。GSE76925是一個以COPD 患者與表型正常吸煙者為分組方式的數(shù)據(jù)集，將前述結(jié)果在該數(shù)據(jù)集再次進行驗證。對最終獲得的差異基因進行了GO 分析，顯示以上差異基因中FGA與FGG以及COL14A1共同定位于細胞間隙，參與細胞外基質(zhì)及膠原纖維合成等生物學(xué)過程。而細胞外基質(zhì)重塑是COPD 的重要特征［9］。

COL14A1在肺動脈高壓患者的血管內(nèi)膜中層顯著上調(diào)，通過穩(wěn)定膠原纖維增加了血管硬度［10］，COL14A1與COPD的關(guān)系尚未見報道。

FGG 與FGA 除參與細胞外基質(zhì)重塑，還共同參與凝血等多個生物學(xué)過程。很多凝血指標，如血漿纖維蛋白原等變化，被證明與COPD 相關(guān)［11］。FGA、FGB 和FGG 各自獨立編碼的3 個多肽鏈，以鏈內(nèi)和鏈間的二硫鍵的形式，構(gòu)成了纖維蛋白原［12］。纖維蛋白原被認為是可行的COPD 標志物，主要用來預(yù)測COPD 的不良預(yù)后［13］。FGG、FGA、FGB基因均被報道存在多個突變體，可致遺傳性纖維蛋白原缺陷［14-15］。

我們選擇FGG 與FGA 作為下一步研究對象。通過對GSE76925 數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，吸煙可致人肺組織FGG與FGA表達增高，戒煙有助于逆轉(zhuǎn)這個情況，但需時較長，TCGA 的數(shù)據(jù)表明戒煙小于15 年，這種趨勢仍不能完全緩解。研究表明，吸煙時間越長、吸煙強度越高，COPD 的風(fēng)險就會顯著增加，戒煙后，與現(xiàn)在的吸煙者相比，曾經(jīng)吸煙者患COPD 的風(fēng)險較低［16］，我們的統(tǒng)計結(jié)果有助于解釋驅(qū)動這一現(xiàn)象的內(nèi)在原因。COPD 患者肺組織FGG/FGA 值高于表型正常吸煙者，輔助診斷COPD的效果甚至要優(yōu)于FGG或FGA單個基因的表現(xiàn)。此外肺組織FGG 與FGA的mRNA 表達不受年齡和性別的強烈影響，因而具備成為COPD標志物的良好潛力。

在一個小氣道上皮來源的數(shù)據(jù)集中，我們發(fā)現(xiàn)FGA 還有助于區(qū)分肺一氧化碳彌散量（diffusion capacity for carbon monoxide of lung，DLCO）下降的COPD 早期患者，DLCO 與COPD 的發(fā)病和預(yù)后顯著相關(guān)［17］，與肺組織樣本的區(qū)別在于，小氣道上皮樣本中FGG 與FGA 表達水平相接近。肺組織FGG 與FGA 的mRNA 表達變化，先于COPD 發(fā)生就已出現(xiàn)，這為COPD的早期診斷提供了可能。

吸煙及COPD 狀態(tài)下，肺組織FGG 與FGA 在蛋白水平是否與mRNA水平一致，尚未得到驗證。由于人肺組織獲取困難，我們決定以小鼠為研究對象，在來自小鼠的數(shù)據(jù)集中，我們再次驗證了吸煙對小鼠肺FGG 與FGA 表達的影響，與人肺組織中得到的結(jié)果是基本一致的。我們以香煙煙霧全身暴露法構(gòu)建了COPD 模型鼠［18］，HE 染色顯示吸煙組小鼠出現(xiàn)肺氣腫改變，提示COPD造模成功。免疫組化結(jié)果顯示吸煙處理可致小鼠肺組織FGG 與FGA 肽鏈含量增加，F(xiàn)GG與FGA在蛋白質(zhì)水平與mRNA密切相關(guān)。

ELISA 結(jié)果顯示，吸煙小鼠肺泡灌洗液及肺組織內(nèi)的IL-6 水平高于對照組，提示吸煙會誘發(fā)肺組織炎癥，這與已有的研究結(jié)果是相符的。A549 細胞被證明在IL-6刺激下能合成纖維蛋白原，相應(yīng)的3個多肽鏈表達均增高，但增高的水平不一致，這個過程受糖皮質(zhì)激素影響［19］，而香煙煙霧提取物刺激可使A549 細胞、單核細胞以及人支氣管上皮細胞內(nèi)IL-6水平升高［20-21］，吸煙或通過誘導(dǎo)肺局部炎癥促使肺上皮細胞合成FGG 與FGA 肽鏈，進而合成纖維蛋白原。金黃色葡萄球菌可通過與纖維蛋白原結(jié)合發(fā)揮致病作用［22］，這可以部分解釋，COPD 患者更高的肺炎發(fā)生率和更差的預(yù)后［23］。FGG與FGA雖然是合成纖維蛋白原的原料，但我們的研究表明，F(xiàn)GG 與FGA的表達變化并不一致，顯然不能與纖維蛋白原變化水平相等同。

FGG 與FGA 除參與合成纖維蛋白原，是否存在其他參與COPD 發(fā)生的機制仍是未知領(lǐng)域。已有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GG 可以通過激活上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）促進肝癌細胞遷移和侵襲［24］。FGA基因敲除促進A549 和H1299 細胞的增殖、遷移和侵襲，降低EMT 標志物E-cadherin 和細胞角蛋白5/8的表達［25］。EMT機制深度參與COPD發(fā)病過程中的氣道重構(gòu)［26］，小氣道重構(gòu)與肺泡附件丟失是COPD 小氣道氣流受限的決定性因素［27］，而小氣道與肺泡上皮正是FGG 與FGA 的主要表達區(qū)域。我們的動物實驗結(jié)果也顯示，吸煙可致小鼠肺組織α-SMA水平升高，E-cadherin水平下降。吸煙可能通過上調(diào)IL-6 影響FGG 與FGA 的表達調(diào)節(jié)肺泡上皮細胞EMT轉(zhuǎn)化，參與COPD的發(fā)生。

綜上所述，通過生物信息學(xué)分析，我們發(fā)現(xiàn)FGG與FGA 在肺組織的表達水平與吸煙及COPD 的發(fā)生顯著相關(guān)，F(xiàn)GG/FGA 有助于早期識別COPD，具有成為COPD 標志物的潛力。動物實驗證明FGG 與FGA在蛋白水平與mRNA 水平變化一致，吸煙或通過上調(diào)IL-6 刺激小鼠肺組織FGG 與FGA 的合成，繼而影響EMT 水平參與COPD 的發(fā)生。戒煙有助于緩解吸煙引起的肺組織基因表達異常。