周卓琳, 劉秀潔, 王新雨, 王淑遠, 宋正陽, 田云娜,張 賽, 黃丹娜, 王萬鐵△
(1溫州醫(yī)科大學缺血-再灌注損傷研究所,浙江溫州 325035;2溫州市人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科,浙江溫州 325035)
缺血再灌注損傷是器官血流中斷引起局部缺血,再灌注后組織損傷進一步加重的現(xiàn)象。近些年,肺缺血再灌注損傷(lung ischemia-reperfusion injury,LIRI)已成為肺移植和心臟搭橋等術(shù)后常見而嚴重的并發(fā)癥[1]。LIRI 的發(fā)病機制十分復雜,且目前尚未完全闡明。因此,深入研究LIRI 的發(fā)病機制對于尋找減少組織損傷的新療法具有重要意義。
核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)炎癥小體是一種多蛋白復合物,由NLRP3、含caspase 募集結(jié)構(gòu)域的凋亡相關(guān)斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain,ASC)和pro-caspase-1 組成,在經(jīng)典細胞焦亡(pyroptosis)通路中起著重要作用[2]。NLRP3 炎癥小體能激活caspase-1,隨后,活化的caspase-1 又對gasdermin D(GSDMD)和白細胞介素1β 前體(pro-interleukin-1β,pro-IL-1β)進行切割形成GSDMD-N 和IL-1β,該過程被稱為細胞焦亡[3]。適度的細胞焦亡能清除入侵的病原體,維持機體平衡,而過度的細胞焦亡會引起細胞死亡,組織損傷和器官衰竭[4-5]。最近研究表明,NLRP3 炎癥小體介導的細胞焦亡,參與了LIRI 的發(fā)生發(fā)展過程[6],但其具體機制并不清楚。因此,本實驗通過建立大鼠肺泡II 型上皮細胞(type II alveolar epithelia cells,AEC II)缺氧/復氧損傷細胞模型,探討NLRP3 炎癥小體介導的細胞焦亡在大鼠AEC II 缺氧/復氧損傷中的作用及其機制。
大鼠AEC II購于上海富衡生物有限公司。
RPMI-1640 培養(yǎng)液購自Gibico;胎牛血清購自ExCell Bio;LPS 購自Sigma;ATP 和MCC950 購自MedChemExpress;CCK-8 試劑盒購自日本同仁;乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)試劑盒、caspase-1活性檢測試劑盒、抗GAPDH、辣根酶標記山羊抗鼠Ⅱ抗、辣根酶標記山羊抗兔Ⅱ抗和Alexa Fluor 488 標記山羊抗兔Ig G 購于中國碧云天生物技術(shù)研究所;抗NLRP3和IL-1β購自Abcam;抗GSDMD抗體購自Santa Cruz Biotechnology;抗NF-κB 抗體購自Cell Signaling Technology;超敏ECL 化學發(fā)光試劑盒購自Advansta。
3.1 細胞培養(yǎng)和實驗分組 AEC II 用含12%胎牛血清、1%青、鏈霉素的RPMI-1640 培養(yǎng)液在37 ℃,5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隨機分為4 組:(1)對照(control,Con)組:常氧環(huán)境下培養(yǎng)36 h;(2)缺氧/復氧(H/R)組:缺氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h 后,復氧培養(yǎng)24 h;(3)NLRP3 炎癥小體激動劑(LPS+ATP)組:缺氧前用LPS(100 μg/L)預處理細胞4 h,再用ATP(1 mmol/L)預處理細胞2 h,其余處理同H/R 組;(4)NLRP3 炎癥小體抑制劑(MCC950)組:缺氧前用MCC950(10 μmol/L)預處理細胞2 h,其余處理同H/R組。
3.2 H/R 損傷模型的建立 在本實驗室前期研究基礎上,構(gòu)建大鼠AEC II的H/R模型[7]。AEC II棄去舊培養(yǎng)液,加入經(jīng)高純氮氣飽和處理過的無糖無血清培養(yǎng)液作為缺氧液。放入提前設置好參數(shù)(1%O2,94%N2,5%CO2,37 ℃)的三氣培養(yǎng)箱缺氧孵育6 h。缺氧處理結(jié)束后,將缺氧液更換為無血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液,置于常氧培養(yǎng)箱中(95% O2,5%CO2,37 ℃)復氧孵育24 h。
3.3 CCK-8 細胞活力和LDH 活性測定 細胞處理結(jié)束后,根據(jù)說明書每孔加入110 μL 的CCK-8 混合液(CCK8∶RPMI-1640 培養(yǎng)液=1∶10),放入常氧培養(yǎng)箱孵育0.5~2 h,置酶標儀于波長450 nm處的吸光度(A)值。培養(yǎng)液LDH 含量測定,收集各組細胞上清液按照試劑盒說明書操作。
3.4 caspase-1 活性測定 細胞處理結(jié)束后,提取各組細胞蛋白,蛋白定量,根據(jù)caspase-1活性檢測試劑盒說明書加入試劑盒內(nèi)的試劑,置多功能酶標儀于波長405 nm 處的A值。caspase-1 活性(%)=實驗處理組A值/實驗對照組A值×100%。
3.5 Western blot 法檢測細胞焦亡相關(guān)蛋白水平細胞處理結(jié)束后,每皿加入RIPA 裂解液(1∶100)500 μL,提取各組細胞蛋白。蛋白定量,凝膠電泳,電轉(zhuǎn)印至PVDF 膜(濕轉(zhuǎn)),5%脫脂牛奶封閉,用兔抗NFκB、NLRP3、IL-1β 和GAPDH 抗體,以及鼠抗GSDMD抗體4 ℃搖床孵育過夜,TBST 洗膜4 次,辣根過氧化物酶標記相應Ⅱ抗孵育1 h。免疫條帶ECL 法顯示,利用熒光化學發(fā)光成像系統(tǒng)進行圖像采集,采用Image Lab軟件分析條帶。
3.6 免疫熒光細胞化學法檢測NF-κB 和caspase-1表達水平 將AEC II 接種在6 孔板的細胞爬片上,4%的多聚甲醛固定細胞,0.5% Triton X-100 通透,5%牛蛋白血清(BSA)封閉之后滴加抗NF-κB 和caspase-1 抗體,濕盒4 ℃過夜。次日PBS 洗滌3 次滴加稀釋好的Ⅱ抗,濕盒室內(nèi)孵育1 h(此后都在暗室操作),PBS 洗滌3次滴加含有DAPI的抗熒光淬滅劑封片液封片,置于正置熒光顯微鏡下采集圖像。采用ImageJ軟件進行分析。
采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。所有的計量資料均以均數(shù)±標準差(Mean±SD)表示。多組樣本間的比較應用單因素方差分析(one-way ANOVA),兩兩比較采用LSD 法。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。
與Con 組相比,H/R、LPS+ATP 和MCC950 三組的細胞活力顯著下降(P<0.05),LDH 釋放顯著增加(P<0.05);與H/R 組相比,LPS+ATP 組的細胞活力顯著下降(P<0.05),LDH 釋放顯著增加(P<0.05),MCC950 組的細胞活力顯著升高(P<0.05),LDH 釋放顯著減少(P<0.05),見圖1。
Figure 1. Effects of NLRP3 inflammasome inhibitor MCC950 on the AEC II injury induced by hypoxia/reoxygenation(H/R). A:the viability of AEC II detected by CCK-8 assay;B:the release level of LDH. Mean±SD.n=3.**P<0.05vs control(Con)group;##P<0.05vs H/R group.圖1 NLRP3炎癥小體抑制劑MCC950對缺氧/復氧引起的AEC II損傷的影響
與Con 組相比,H/R、LPS+ATP 和MCC950 組細胞中NF-κB 和caspase-1 免疫熒光表達顯著增多(P<0.05);與H/R 組相比,LPS+ATP 組細胞中NF-κB 和caspase-1免疫熒光表達顯著增加(P<0.05),MCC950組細胞中NF-κB和caspase-1免疫熒光表達顯著減少(P<0.05),見圖2。
Figure 2. Effects of NLRP3 inflammasome inhibitor MCC950 on the expression of NF-κB(A)and caspase-1(B)in the AEC II induced by hypoxia/reoxygenation(H/R). The scale bar=100 μm. Mean±SD.n=3.**P<0.05vs control(Con)group;##P<0.05vs H/R group.圖2 NLRP3炎癥小體抑制劑MCC950對缺氧/復氧誘導的AEC II中NF-κB和caspase-1熒光表達的影響
與Con 組相比,H/R、LPS+ATP 和MCC950 組的caspase-1 活性顯著上升(P<0.05);與H/R 組相比,LPS+ATP 組細胞caspase-1 活性顯著上升(P<0.05),MCC950 組細胞caspase-1 活性顯著下降(P<0.05),見圖3。
Figure 3. The effect of NLRP3 inflammasome inhibitor MCC950 on the activity of caspase-1 in the AEC II induced by hypoxia/reoxygenation(H/R). Mean±SD.n=3.**P<0.05vs control(Con)group;##P<0.05vs H/R group.圖3 NLRP3 炎癥小體抑制劑MCC950 對缺氧/復氧誘導的AEC II中caspase-1活性的影響
Western blot檢測結(jié)果顯示,與Con組相比,H/R、LPS+ATP和MCC950組的NLRP3、GSDMD-N和IL-1β的蛋白表達顯著增加(P<0.05);與H/R組相比,LPS+ATP 組的NLRP3、GSDMD-N 和IL-1β 的蛋白表達顯著增加(P<0.05),MCC950 組的NLRP3、GSDMD-N和IL-1β的蛋白表達顯著下降(P<0.05),見圖4。
Figure 4. Effects of NLRP3 inflammasome inhibitor MCC950 on the protein expression levels of NLRP3(A),GSDMD-N(B),IL-1β(C)and NF-κB(D)in the AEC II induced by hypoxia/reoxygenation(H/R). Mean±SD.n=3.**P<0.05vs control(Con)group;##P<0.05vs H/R group.圖4 NLRP3炎癥小體抑制劑MCC950對缺氧/復氧誘導的AEC II中NLRP3、GSDMD-N、IL-1β和NF-κB蛋白表達的影響
肺缺血/再灌注損傷表現(xiàn)為血管通透性增加,肺水腫,炎癥反應。當機體遭受缺血/再灌注(缺氧/復氧)等應激條件時,肺組織的主要效應細胞AEC II會發(fā)生損傷性改變,影響肺泡表面活性物質(zhì)的功能,引起細胞功能紊亂,加重肺組織的損傷[8]。本實驗結(jié)果顯示,與Con組相比,H/R 組的細胞活力顯著下降,LDH 含量增加,AEC II 損傷加重,提示H/R 細胞損傷模型成功。
在焦亡信號通路中,NLRP3 通過ASC 與pro-caspase-1 連接形成NLRP3 炎癥小體激活casapse-1。生理情況下,caspase-1 以酶原的形式存在。被炎癥小體激活后,形成活化的caspase-1?;罨腸aspase-1切割pro-IL-1β 形成成熟的IL-1β,引起炎癥反應。GSDMD-N 是炎癥小體活化后誘導細胞焦亡的可靠標志[9]。GSDMD 作為細胞焦亡唯一的底物,經(jīng)上游活化的casapse-1 切割后形成具有穿孔作用的GSDMD-N 端,致使細胞腫脹、細胞膜溶解,釋放細胞內(nèi)的IL-1β 到細胞外,加大炎癥反應,進一步誘導細胞焦亡[10-11]。本研究顯示,離體AEC II 細胞經(jīng)缺氧/復氧、NLRP3 炎癥小體激動劑-LPS+ATP 處理后,細胞焦亡相關(guān)蛋白NLRP3、GSDMD-N 和IL-1β 水平增加,caspase-1 活力增加和熒光表達增強,初步證實了NLRP3 炎癥小體介導的細胞焦亡參與了H/R 引起的AEC II損傷。本研究中預先采用NLRP3炎性小體抑制劑MCC950 處理后,上述焦亡通路中的相關(guān)蛋白表達水平均出現(xiàn)下調(diào),表明NLRP3炎癥小體抑制劑-MCC950對H/R引起的AEC II損傷具有干預作用。
NF-κB 被認為是控制缺血/再灌注(缺氧/復氧)損傷過程中促炎基因表達的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。當發(fā)生缺血再灌注(缺氧/復氧)時,NF-κB 激活的促炎因子基因,釋放大量促炎因子,進一步加重組織、細胞及器官損傷[12]。研究表明NF-κB作為NLRP3炎性小體的“起始”信號,在NLRP3炎癥小體的活化中,發(fā)揮著重要的作用[13]。Kuang等[14]表明,NLRP3沉默通過減少NF-κB 抑制劑降解而降低肺纖維化中膠原蛋白合成。另外,Wang 等[15]表明,在非酒精性脂肪肝,NLRP3 炎性小體抑制劑-MCC950 通過抑制NLRP3 炎癥小體減少NF-κB 的激活,降低肝臟炎癥反應。這些研究表明NF-κB 和NLRP3 炎癥小體相互之間有上下游的關(guān)系。本實驗顯示,NLRP3 炎癥小體抑制劑-MCC950 可使NF-κB 表達減少,改善細胞焦亡,減輕H/R 引起的AEC II 損傷,其潛在機制可能與其抑制NF-κB有關(guān)。
綜上所述,H/R 可激活NF-κB 和NLRP3 炎癥小體,上調(diào)細胞焦亡相關(guān)信號傳導,加重AEC II 損傷;應用NLRP3 炎癥小體抑制劑MCC950 可抑制H/R 引起的AEC II 損傷,其潛在機制可能與其抑制NF-κB有關(guān)。本研究采用離體大鼠AEC II,探討了NLRP3炎癥小體介導的細胞焦亡在大鼠AEC II 缺氧/復氧損傷中的作用機制,但仍需進一步從整體動物實驗中得到證實。