周卓琳， 劉秀潔， 王新雨， 王淑遠， 宋正陽， 田云娜，張 賽， 黃丹娜， 王萬鐵△

（1溫州醫(yī)科大學缺血-再灌注損傷研究所，浙江溫州 325035；2溫州市人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，浙江溫州 325035）

缺血再灌注損傷是器官血流中斷引起局部缺血，再灌注后組織損傷進一步加重的現(xiàn)象。近些年，肺缺血再灌注損傷（lung ischemia-reperfusion injury，LIRI）已成為肺移植和心臟搭橋等術(shù)后常見而嚴重的并發(fā)癥［1］。LIRI 的發(fā)病機制十分復雜，且目前尚未完全闡明。因此，深入研究LIRI 的發(fā)病機制對于尋找減少組織損傷的新療法具有重要意義。

核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）炎癥小體是一種多蛋白復合物，由NLRP3、含caspase 募集結(jié)構(gòu)域的凋亡相關(guān)斑點樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain，ASC）和pro-caspase-1 組成，在經(jīng)典細胞焦亡（pyroptosis）通路中起著重要作用［2］。NLRP3 炎癥小體能激活caspase-1，隨后，活化的caspase-1 又對gasdermin D（GSDMD）和白細胞介素1β 前體（pro-interleukin-1β，pro-IL-1β）進行切割形成GSDMD-N 和IL-1β，該過程被稱為細胞焦亡［3］。適度的細胞焦亡能清除入侵的病原體，維持機體平衡，而過度的細胞焦亡會引起細胞死亡，組織損傷和器官衰竭［4-5］。最近研究表明，NLRP3 炎癥小體介導的細胞焦亡，參與了LIRI 的發(fā)生發(fā)展過程［6］，但其具體機制并不清楚。因此，本實驗通過建立大鼠肺泡II 型上皮細胞（type II alveolar epithelia cells，AEC II）缺氧/復氧損傷細胞模型，探討NLRP3 炎癥小體介導的細胞焦亡在大鼠AEC II 缺氧/復氧損傷中的作用及其機制。

材 料 和 方 法

1 實驗細胞

大鼠AEC II購于上海富衡生物有限公司。

2 主要試劑和儀器

RPMI-1640 培養(yǎng)液購自Gibico；胎牛血清購自ExCell Bio；LPS 購自Sigma；ATP 和MCC950 購自MedChemExpress；CCK-8 試劑盒購自日本同仁；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）試劑盒、caspase-1活性檢測試劑盒、抗GAPDH、辣根酶標記山羊抗鼠Ⅱ抗、辣根酶標記山羊抗兔Ⅱ抗和Alexa Fluor 488 標記山羊抗兔Ig G 購于中國碧云天生物技術(shù)研究所；抗NLRP3和IL-1β購自Abcam；抗GSDMD抗體購自Santa Cruz Biotechnology；抗NF-κB 抗體購自Cell Signaling Technology；超敏ECL 化學發(fā)光試劑盒購自Advansta。

3 主要方法

3.1 細胞培養(yǎng)和實驗分組 AEC II 用含12%胎牛血清、1%青、鏈霉素的RPMI-1640 培養(yǎng)液在37 ℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隨機分為4 組：（1）對照（control，Con）組：常氧環(huán)境下培養(yǎng)36 h；（2）缺氧/復氧（H/R）組：缺氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h 后，復氧培養(yǎng)24 h；（3）NLRP3 炎癥小體激動劑（LPS+ATP）組：缺氧前用LPS（100 μg/L）預處理細胞4 h，再用ATP（1 mmol/L）預處理細胞2 h，其余處理同H/R 組；（4）NLRP3 炎癥小體抑制劑（MCC950）組：缺氧前用MCC950（10 μmol/L）預處理細胞2 h，其余處理同H/R組。

3.2 H/R 損傷模型的建立 在本實驗室前期研究基礎上，構(gòu)建大鼠AEC II的H/R模型［7］。AEC II棄去舊培養(yǎng)液，加入經(jīng)高純氮氣飽和處理過的無糖無血清培養(yǎng)液作為缺氧液。放入提前設置好參數(shù)（1%O2，94%N2，5%CO2，37 ℃）的三氣培養(yǎng)箱缺氧孵育6 h。缺氧處理結(jié)束后，將缺氧液更換為無血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液，置于常氧培養(yǎng)箱中（95% O2，5%CO2，37 ℃）復氧孵育24 h。

3.3 CCK-8 細胞活力和LDH 活性測定 細胞處理結(jié)束后，根據(jù)說明書每孔加入110 μL 的CCK-8 混合液（CCK8∶RPMI-1640 培養(yǎng)液=1∶10），放入常氧培養(yǎng)箱孵育0.5～2 h，置酶標儀于波長450 nm處的吸光度（A）值。培養(yǎng)液LDH 含量測定，收集各組細胞上清液按照試劑盒說明書操作。

3.4 caspase-1 活性測定 細胞處理結(jié)束后，提取各組細胞蛋白，蛋白定量，根據(jù)caspase-1活性檢測試劑盒說明書加入試劑盒內(nèi)的試劑，置多功能酶標儀于波長405 nm 處的A值。caspase-1 活性（%）=實驗處理組A值/實驗對照組A值×100%。

3.5 Western blot 法檢測細胞焦亡相關(guān)蛋白水平細胞處理結(jié)束后，每皿加入RIPA 裂解液（1∶100）500 μL，提取各組細胞蛋白。蛋白定量，凝膠電泳，電轉(zhuǎn)印至PVDF 膜（濕轉(zhuǎn)），5%脫脂牛奶封閉，用兔抗NFκB、NLRP3、IL-1β 和GAPDH 抗體，以及鼠抗GSDMD抗體4 ℃搖床孵育過夜，TBST 洗膜4 次，辣根過氧化物酶標記相應Ⅱ抗孵育1 h。免疫條帶ECL 法顯示，利用熒光化學發(fā)光成像系統(tǒng)進行圖像采集，采用Image Lab軟件分析條帶。

3.6 免疫熒光細胞化學法檢測NF-κB 和caspase-1表達水平 將AEC II 接種在6 孔板的細胞爬片上，4%的多聚甲醛固定細胞，0.5% Triton X-100 通透，5%牛蛋白血清（BSA）封閉之后滴加抗NF-κB 和caspase-1 抗體，濕盒4 ℃過夜。次日PBS 洗滌3 次滴加稀釋好的Ⅱ抗，濕盒室內(nèi)孵育1 h（此后都在暗室操作），PBS 洗滌3次滴加含有DAPI的抗熒光淬滅劑封片液封片，置于正置熒光顯微鏡下采集圖像。采用ImageJ軟件進行分析。

4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。所有的計量資料均以均數(shù)±標準差（Mean±SD）表示。多組樣本間的比較應用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩兩比較采用LSD 法。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

1 NLRP3 炎癥小體抑制劑MCC950 對缺氧/復氧引起的AEC II損傷的影響

與Con 組相比，H/R、LPS+ATP 和MCC950 三組的細胞活力顯著下降（P＜0.05），LDH 釋放顯著增加（P＜0.05）；與H/R 組相比，LPS+ATP 組的細胞活力顯著下降（P＜0.05），LDH 釋放顯著增加（P＜0.05），MCC950 組的細胞活力顯著升高（P＜0.05），LDH 釋放顯著減少（P＜0.05），見圖1。

Figure 1. Effects of NLRP3 inflammasome inhibitor MCC950 on the AEC II injury induced by hypoxia/reoxygenation（H/R）. A：the viability of AEC II detected by CCK-8 assay；B：the release level of LDH. Mean±SD.n=3.**P＜0.05vs control（Con）group；##P＜0.05vs H/R group.圖1 NLRP3炎癥小體抑制劑MCC950對缺氧/復氧引起的AEC II損傷的影響

2 NLRP3 炎癥小體抑制劑MCC950 對缺氧/復氧誘導的AEC II中NF-κB和caspase-1表達的影響

與Con 組相比，H/R、LPS+ATP 和MCC950 組細胞中NF-κB 和caspase-1 免疫熒光表達顯著增多（P＜0.05）；與H/R 組相比，LPS+ATP 組細胞中NF-κB 和caspase-1免疫熒光表達顯著增加（P＜0.05），MCC950組細胞中NF-κB和caspase-1免疫熒光表達顯著減少（P＜0.05），見圖2。

Figure 2. Effects of NLRP3 inflammasome inhibitor MCC950 on the expression of NF-κB（A）and caspase-1（B）in the AEC II induced by hypoxia/reoxygenation（H/R）. The scale bar=100 μm. Mean±SD.n=3.**P＜0.05vs control（Con）group；##P＜0.05vs H/R group.圖2 NLRP3炎癥小體抑制劑MCC950對缺氧/復氧誘導的AEC II中NF-κB和caspase-1熒光表達的影響

3 NLRP3 炎癥小體抑制劑MCC950 對缺氧/復氧誘導的AEC II中caspase-1活性的影響

與Con 組相比，H/R、LPS+ATP 和MCC950 組的caspase-1 活性顯著上升（P＜0.05）；與H/R 組相比，LPS+ATP 組細胞caspase-1 活性顯著上升（P＜0.05），MCC950 組細胞caspase-1 活性顯著下降（P＜0.05），見圖3。

Figure 3. The effect of NLRP3 inflammasome inhibitor MCC950 on the activity of caspase-1 in the AEC II induced by hypoxia/reoxygenation（H/R）. Mean±SD.n=3.**P＜0.05vs control（Con）group；##P＜0.05vs H/R group.圖3 NLRP3 炎癥小體抑制劑MCC950 對缺氧/復氧誘導的AEC II中caspase-1活性的影響

4 NLRP3 炎癥小體抑制劑MCC950 對缺氧/復氧誘導的AEC II細胞焦亡相關(guān)蛋白水平的影響

Western blot檢測結(jié)果顯示，與Con組相比，H/R、LPS+ATP和MCC950組的NLRP3、GSDMD-N和IL-1β的蛋白表達顯著增加（P＜0.05）；與H/R組相比，LPS+ATP 組的NLRP3、GSDMD-N 和IL-1β 的蛋白表達顯著增加（P＜0.05），MCC950 組的NLRP3、GSDMD-N和IL-1β的蛋白表達顯著下降（P＜0.05），見圖4。

Figure 4. Effects of NLRP3 inflammasome inhibitor MCC950 on the protein expression levels of NLRP3（A），GSDMD-N（B），IL-1β（C）and NF-κB（D）in the AEC II induced by hypoxia/reoxygenation（H/R）. Mean±SD.n=3.**P＜0.05vs control（Con）group；##P＜0.05vs H/R group.圖4 NLRP3炎癥小體抑制劑MCC950對缺氧/復氧誘導的AEC II中NLRP3、GSDMD-N、IL-1β和NF-κB蛋白表達的影響

討論

肺缺血/再灌注損傷表現(xiàn)為血管通透性增加，肺水腫，炎癥反應。當機體遭受缺血/再灌注（缺氧/復氧）等應激條件時，肺組織的主要效應細胞AEC II會發(fā)生損傷性改變，影響肺泡表面活性物質(zhì)的功能，引起細胞功能紊亂，加重肺組織的損傷［8］。本實驗結(jié)果顯示，與Con組相比，H/R 組的細胞活力顯著下降，LDH 含量增加，AEC II 損傷加重，提示H/R 細胞損傷模型成功。

在焦亡信號通路中，NLRP3 通過ASC 與pro-caspase-1 連接形成NLRP3 炎癥小體激活casapse-1。生理情況下，caspase-1 以酶原的形式存在。被炎癥小體激活后，形成活化的caspase-1?；罨腸aspase-1切割pro-IL-1β 形成成熟的IL-1β，引起炎癥反應。GSDMD-N 是炎癥小體活化后誘導細胞焦亡的可靠標志［9］。GSDMD 作為細胞焦亡唯一的底物，經(jīng)上游活化的casapse-1 切割后形成具有穿孔作用的GSDMD-N 端，致使細胞腫脹、細胞膜溶解，釋放細胞內(nèi)的IL-1β 到細胞外，加大炎癥反應，進一步誘導細胞焦亡［10-11］。本研究顯示，離體AEC II 細胞經(jīng)缺氧/復氧、NLRP3 炎癥小體激動劑-LPS+ATP 處理后，細胞焦亡相關(guān)蛋白NLRP3、GSDMD-N 和IL-1β 水平增加，caspase-1 活力增加和熒光表達增強，初步證實了NLRP3 炎癥小體介導的細胞焦亡參與了H/R 引起的AEC II損傷。本研究中預先采用NLRP3炎性小體抑制劑MCC950 處理后，上述焦亡通路中的相關(guān)蛋白表達水平均出現(xiàn)下調(diào)，表明NLRP3炎癥小體抑制劑-MCC950對H/R引起的AEC II損傷具有干預作用。

NF-κB 被認為是控制缺血/再灌注（缺氧/復氧）損傷過程中促炎基因表達的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。當發(fā)生缺血再灌注（缺氧/復氧）時，NF-κB 激活的促炎因子基因，釋放大量促炎因子，進一步加重組織、細胞及器官損傷［12］。研究表明NF-κB作為NLRP3炎性小體的“起始”信號，在NLRP3炎癥小體的活化中，發(fā)揮著重要的作用［13］。Kuang等［14］表明，NLRP3沉默通過減少NF-κB 抑制劑降解而降低肺纖維化中膠原蛋白合成。另外，Wang 等［15］表明，在非酒精性脂肪肝，NLRP3 炎性小體抑制劑-MCC950 通過抑制NLRP3 炎癥小體減少NF-κB 的激活，降低肝臟炎癥反應。這些研究表明NF-κB 和NLRP3 炎癥小體相互之間有上下游的關(guān)系。本實驗顯示，NLRP3 炎癥小體抑制劑-MCC950 可使NF-κB 表達減少，改善細胞焦亡，減輕H/R 引起的AEC II 損傷，其潛在機制可能與其抑制NF-κB有關(guān)。

綜上所述，H/R 可激活NF-κB 和NLRP3 炎癥小體，上調(diào)細胞焦亡相關(guān)信號傳導，加重AEC II 損傷；應用NLRP3 炎癥小體抑制劑MCC950 可抑制H/R 引起的AEC II 損傷，其潛在機制可能與其抑制NF-κB有關(guān)。本研究采用離體大鼠AEC II，探討了NLRP3炎癥小體介導的細胞焦亡在大鼠AEC II 缺氧/復氧損傷中的作用機制，但仍需進一步從整體動物實驗中得到證實。