李祥欣， 張保朝， 劉義鋒， 劉少哲， 裴 雙， 余 洋， 溫昌明

（南陽市中心醫(yī)院，河南南陽 473000）

偏頭痛臨床表現(xiàn)為頭部搏動(dòng)樣疼痛的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙疾病，病程復(fù)雜，反復(fù)發(fā)作，常伴有惡心、嘔吐等癥狀，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量［1］，但發(fā)病機(jī)制目前尚不明確。目前臨床上常用曲普坦類藥物治療偏頭痛，但效果不佳，且不能從根本上治療疾病［2］，因此尋找新的治療方案對(duì)于緩解疾病意義重大。三七總皂苷（total saponins ofPanax notoginseng，TSPN）作為三七的有效成分，對(duì)神經(jīng)功能具有保護(hù)作用［3］，但具體機(jī)制尚不清楚。神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白（neuregulin，NRG）/表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，ErbB）信號(hào)通路作為腦神經(jīng)元中信號(hào)傳導(dǎo)通路，對(duì)神經(jīng)元具有保護(hù)作用［4］；在抑郁大鼠模型中能保護(hù)神經(jīng)元免受損傷，實(shí)現(xiàn)對(duì)疾病的緩解［5］，但尚未顯示其在偏頭痛中的研究。因此，本研究采用硝酸甘油溶液皮下注射制備偏頭痛大鼠模型，探討TSPN 對(duì)偏頭痛的保護(hù)機(jī)制，以期為臨床上TSPN治療偏頭痛提供參考資料。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物

48 只SD 大鼠（SPF 級(jí)、雄性），6 周齡，體重（190±10）g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（京）2016-0011。溫度（23±0.5）℃、濕度（50±5）%、12 h 光照/12 h 黑暗條件下正常飲水?dāng)z食。本研究實(shí)驗(yàn)動(dòng)物符合3R 原則，本研究遵守國(guó)際疼痛研究協(xié)會(huì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和指南有關(guān)規(guī)定，經(jīng)本院倫理協(xié)會(huì)審核并通過。

2 主要試劑

硝酸甘油溶液（北京益民藥業(yè)有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H11020289，規(guī)格：1 mL：5 mg×1支/盒）；三七總皂苷片（滇虹藥業(yè)集團(tuán)玉溪生物制藥有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字Z53021487）；NRG/ErbB 通路抑制劑AG825（Biosource）；蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色液（北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)：G1120）；大鼠白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）、IL-1β、5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）、β-內(nèi)啡肽（β-endorphin，β-EP）、降鈣素基因相關(guān)肽（calcitonin gene-related peptide，CGRP）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒及NRG1、ErbB2、ErbB3、ErbB4、caspase-3 和cleaved caspase-3 抗體（Abcam，貨號(hào)分別為：ab234570、ab255730、ab114804、ab274398、ab203548、ab191139、ab237715、ab32121、ab19391、ab184787 和ab52072）；大鼠一氧化氮（nitric oxide，NO）ELISA 試劑盒（上海潤(rùn)裕生物科技有限公司，貨號(hào)：18941）。ChemiDoc XRS+蛋白成像系統(tǒng)（Bio-Rad）。

3 主要方法

3.1 實(shí)驗(yàn)分組及建模 SD 大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（control group）、模型組（model group）、TSPN 組（TSPN group；10 mg/kg TSPN）和TSPN+抑制劑組（TSPN+inhibitor group；10 mg/kg TSPN+50 μg/kg AG825），每組12 只。TSPN 組參考人與動(dòng)物等效劑量換算法灌胃10 mg/kg TSPN［6］，TSPN+抑制劑組在TSPN 組基礎(chǔ)上尾靜脈注射50 μg/kg AG825，對(duì)照組和模型組分別灌胃和靜脈注射等體積生理鹽水，每天1次，連續(xù)1周。

末次給藥1 h 后，模型組、TSPN 組和TSPN+抑制劑組大鼠參考Tassorelli 等［7］方法建立偏頭痛模型：大鼠按10 mg/kg（2 mL）劑量硝酸甘油溶液皮下注射，當(dāng)大鼠出現(xiàn)耳紅、爬籠、撓頭、咬尾、往返運(yùn)動(dòng)增加等現(xiàn)象，則為造模成功。對(duì)照組大鼠相同部位注射等體積生理鹽水。

3.2 各組行為學(xué)評(píng)分 記錄各組大鼠連續(xù)30 min內(nèi)出現(xiàn)爬籠、撓頭、咬尾和往返運(yùn)動(dòng)次數(shù)，每個(gè)癥狀出現(xiàn)1 次記1 分［8］，以造模成功為0 min，共記錄0～30 min、60～90 min 和120～150 min 三個(gè)時(shí)段。觀察耳紅出現(xiàn)時(shí)間和耳紅消失時(shí)間。

3.3 樣本收集 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后腹主動(dòng)脈采血，加入促凝管中，1 200×g離心10 min，收集血清，置于-20 ℃冰箱備用；斷頭處死，取腦組織，隨機(jī)6 只置于4%多聚甲醛中固定，另6只置于-80 ℃冰箱保存。

3.4 HE 染色檢測(cè)腦組織神經(jīng)元形態(tài) 取出4%多聚甲醛中固定組織，石蠟切片（厚度：5 μm），二甲苯脫蠟、乙醇水合，經(jīng)蘇木精染色、鹽酸分化、伊紅復(fù)染后，顯微鏡下觀察腦組織神經(jīng)元形態(tài)。

3.5 ELISA 檢測(cè)血清中NO、IL-6 和IL-1β 水平及腦組織中5-HT、β-EP和CGRP含量 取出血清，參考大鼠ELISA試劑盒說明書檢測(cè)血清中NO、IL-6和IL-1β水平；腦組織取0.5 mg，加入預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液，冰上勻漿，1 200×g離心25 min，取上清，參考大鼠ELISA 試劑盒說明書檢測(cè)腦組織中5-HT、β-EP 和CGRP含量。

3.6 Western blot 法檢測(cè)腦組織中NRG1、ErbB2、ErbB3、ErbB4、caspase-3 和cleaved caspase-3 蛋白表達(dá)情況 取30 mg 腦組織，冰上勻漿，RIPA 裂解液裂解組織，10 000×g、4 ℃離心20 min，上清為總蛋白，上樣20 μg 蛋白、PVDF 膜轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入Ⅰ抗（NRG1，1∶1 000；ErbB2，1∶1 000；ErbB3，1∶500；ErbB4，1∶500；caspase-3，1∶2 000；cleaved caspase-3，1∶2 000）于4 ℃孵育過夜；加入對(duì)應(yīng)Ⅱ抗，室溫孵育1 h；ECL 化學(xué)發(fā)光液避光顯色，蛋白成像系統(tǒng)拍照和定量分析。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)均采用GraphPad Prism7.0進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）描述。多組間比較行單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 TSPN對(duì)大鼠頭痛發(fā)作時(shí)行為學(xué)和耳紅的影響

與對(duì)照組相比，模型組和TSPN+抑制劑組在0～30 min、60～90 min 和120～150 min 的行為學(xué)評(píng)分，以及TSPN 組在0～30 min和60～90 min的行為學(xué)評(píng)分顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，TSPN 組在0～30 min、60～90 min 和120～150 min 的行為學(xué)評(píng)分，以及TSPN+抑制劑組在60～90 min 和120～150 min 的行為學(xué)評(píng)分顯著降低（P＜0.05），TSPN 組耳紅出現(xiàn)時(shí)間延長(zhǎng)（P＜0.05），TSPN 組和TSPN+抑制劑組耳紅消失時(shí)間縮短（P＜0.05）；與TSPN 組相比，TSPN+抑制劑組在0～30 min、60～90 min 和120～150 min 行為學(xué)評(píng)分升高（P＜0.05），耳紅出現(xiàn)時(shí)間縮短（P＜0.05），耳紅消失時(shí)間延長(zhǎng)（P＜0.05），見圖1、2。

Figure 1. Comparison of behavioral scores during headache attack of the rats in the 4 groups. Mean±SD.n=12.*P＜0.05vs control group；#P＜0.05vs model group；＆amp;P＜0.05vs TSPN group.圖1 4組大鼠頭痛發(fā)作時(shí)行為學(xué)評(píng)分比較

Figure 2. The appearance time and disappearance time of the rats in the 4 groups were compared. A：ear red appearance time；B：ear red disappearance time.Mean±SD.n=12.*P＜0.05vs control group；#P＜0.05vs model group；＆amp;P＜0.05vs TSPN group.圖2 4組大鼠耳紅出現(xiàn)時(shí)間和耳紅消失時(shí)間比較

2 TSPN對(duì)大鼠腦組織神經(jīng)元的影響

對(duì)照組腦組織神經(jīng)元染色均勻，細(xì)胞未腫脹、壞死；模型組神經(jīng)元出現(xiàn)明顯空泡狀，細(xì)胞萎縮、壞死嚴(yán)重，出現(xiàn)局部壞死、血管阻塞現(xiàn)象；TSPN 組神經(jīng)元損傷得到一定修復(fù)，神經(jīng)元僅存在部分空泡現(xiàn)象；TSPN+抑制劑組細(xì)胞空泡現(xiàn)象明顯，出現(xiàn)部分血管阻塞現(xiàn)象，見圖3。

Figure 3. Neurons in brain tissues of the rats in the 4 groups（HE staining，scale bar=100 μm）. A：control group；B：model group；C：TSPN group；D：TSPN+inhibitor group. Long arrow：vascular obstruction；short arrow：atrophic cells；H：local necrosis；V：vacuole cells. Obvious vacuoles，cell atrophy，severe necrosis，local necrosis，and blood vessel obstruction were observed in model group. Partial vacuolation was observed in TSPN group. Cellular vacuolation was obvious in TSPN+inhibitor group.圖3 4組大鼠腦組織神經(jīng)元形態(tài)

3 TSPN 對(duì)大鼠血清中NO、IL-6 和IL-1β 水平的影響

與對(duì)照組相比，模型組和TSPN+抑制劑組血清中NO、IL-6 和IL-1β 水平，以及TSPN 組血清中NO 水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，TSPN 組血清中NO、IL-6 和IL-1β 水平，以及TSPN+抑制劑組血清中IL-6 和IL-1β 水平顯著降低（P＜0.05）；與TSPN 組相比，TSPN+抑制劑組血清中NO、IL-6 和IL-1β 水平顯著升高（P＜0.05），見圖4。

Figure 4. The levels of NO，IL-6 and IL-1β in serum of the rats in the 4 groups were compared. A：NO level in serum；B：IL-6 level in serum；C：IL-1β level in serum. Mean±SD.n=12.*P＜0.05vs control group；#P＜0.05vs model group；＆amp;P＜0.05vs TSPN group.圖4 4組大鼠血清中NO、IL-6和IL-1β水平比較

4 TSPN 對(duì)大鼠腦組織中5-HT、β-EP 和CGRP 含量的影響

與對(duì)照組相比，模型組腦組織中5-HT和β-EP含量，以及TSPN+抑制劑組腦組織中5-HT 含量顯著降低（P＜0.05），TSPN 組腦組織中β-EP 含量，以及模型組、TSPN 組和TSPN+抑制劑組腦組織中CGRP 含量顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，TSPN 組腦組織中5-HT和β-EP含量，以及TSPN+抑制劑組腦組織中β-EP 含量顯著升高（P＜0.05），TSPN 組和TSPN+抑制劑組腦組織中CGRP 含量顯著降低（P＜0.05）；與TSPN 組相比，TSPN+抑制劑組腦組織中5-HT 和β-EP含量顯著降低（P＜0.05），CGRP含量顯著升高（P＜0.05），見圖5。

Figure 5. Comparison of the contents of 5-HT，β-EP and CGRP in brain tissues of the rats in the 4 groups. A：5-HT content in brain tissue；B：β-EP content in brain tissue；C：CGRP content in brain tissue. Mean±SD.n=6*P＜0.05vs control group；#P＜0.05vs model group；＆amp;P＜0.05vs TSPN group.圖5 4組大鼠腦組織中5-HT、β-EP和CGRP含量比較

5 TSPN 對(duì)大鼠腦組織中NRG1、ErbB2、ErbB3、ErbB4、caspase-3 和cleaved caspase-3 蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，模型組和TSPN+抑制劑組腦組織中NRG1、ErbB2、ErbB3 和ErbB4 蛋白水平，以及TSPN 組腦組織中ErbB2、ErbB3 和ErbB4 蛋白水平顯著降低（P＜0.05），模型組和TSPN+抑制劑組腦組織中cleaved caspase-3/caspase-3蛋白水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，TSPN 組腦組織中NRG1、ErbB2、ErbB3 和ErbB4 蛋白水平，以及TSPN+抑制劑組腦組織中NRG1 蛋白水平顯著升高（P＜0.05），TSPN 組和TSPN+抑制劑組腦組織中cleaved caspase-3/caspase-3 蛋白水平顯著降低（P＜0.05）；與TSPN 組相比，TSPN+抑制劑組腦組織中NRG1、ErbB2、ErbB3和ErbB4 蛋白水平顯著降低（P＜0.05），cleaved caspase-3/caspase-3 蛋白水平顯著升高（P＜0.05），見圖6。

Figure 6. The protein levels of NRG1，ErbB2，ErbB3，ErbB4，caspase-3 and cleaved caspase-3 in brain tissues of the rats in the 4 groups. Mean±SD.n=6.*P＜0.05vs control group；#P＜0.05vs model group；＆amp;P＜0.05vs TSPN group.圖6 4組大鼠腦組織中NRG1、ErbB2、ErbB3、ErbB4、caspase-3和cleaved caspase-3蛋白水平情況

討論

偏頭痛中醫(yī)屬“頭風(fēng)”、“頭痛”、“厥頭痛”等范疇，表現(xiàn)為感受外邪、情至內(nèi)傷、飲食不節(jié)、久病至淤所致肝、脾、腎失常，導(dǎo)致痰淤阻絡(luò)［9］。本研究中，偏頭痛大鼠出現(xiàn)耳紅、爬籠、撓頭、咬尾、往返運(yùn)動(dòng)增加，提示大鼠出現(xiàn)不適癥狀。TSPN 在神經(jīng)保護(hù)方面研究成為熱點(diǎn)，可緩解神經(jīng)元損傷［10］，在麻醉藥七氟醚致神經(jīng)元損害中，TSPN 可促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡進(jìn)而緩解七氟醚導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞凋亡、學(xué)習(xí)和記憶障礙現(xiàn)象，實(shí)現(xiàn)對(duì)機(jī)體的保護(hù)［11］。TSPN 治療偏頭痛后大鼠耳紅、爬籠、撓頭、咬尾、往返運(yùn)動(dòng)癥狀均有所減輕，耳紅出現(xiàn)時(shí)間延后、耳紅消退時(shí)間提前，提示TSPN 能夠緩解偏頭痛造成的不適癥狀。HE 染色檢測(cè)，偏頭痛大鼠腦組織出現(xiàn)明顯的神經(jīng)元壞死、空泡現(xiàn)象；經(jīng)TSPN 治療后，腦組織神經(jīng)元損傷現(xiàn)象得到一定緩解，提示TSPN 可能緩解神經(jīng)元損傷實(shí)現(xiàn)對(duì)偏頭痛大鼠的保護(hù)。

在本研究用硝酸甘油誘導(dǎo)大鼠制備偏頭痛模型，硝酸甘油作為NO 供體，在體內(nèi)可直接作用于血管平滑肌細(xì)胞生成NO，增加血液中NO 含量［12］；硝酸甘油也可刺激神經(jīng)末梢釋放CGRP，CGRP 在外周血中濃度增加會(huì)誘發(fā)血管擴(kuò)張和腦膜肥大細(xì)胞脫顆粒，進(jìn)而釋放神經(jīng)組織血管活性物質(zhì)，包括IL-6 和IL-1β等，誘發(fā)神經(jīng)源性炎癥偏頭痛［13］。5-HT在偏頭痛發(fā)作期水平降低，可引起血管擴(kuò)張性疼痛，臨床上多種頭痛藥通過激活5-HT 發(fā)揮作用［14］。β-EP 在疼痛應(yīng)激下可釋放入血，抑制P 物質(zhì)的釋放，從而使神經(jīng)疼痛感覺抑制［15］。本研究顯示，模型組血清中NO、IL-6 和IL-1β 水平，以及腦組織中CGRP 含量升高，腦組織中5-HT和β-EP含量降低。這提示大鼠受硝酸甘油刺激，生成NO，增加血液中NO 含量；同時(shí)刺激CGRP 的生成，CGRP 水平升高誘發(fā)血管擴(kuò)張和腦膜肥大細(xì)胞脫顆粒，促進(jìn)IL-6 和IL-1β 的升高，誘發(fā)炎癥偏頭痛；偏頭痛發(fā)生后神經(jīng)遞質(zhì)5-HT和β-EP含量降低，增加痛感，導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)不適癥狀。經(jīng)TSPN 治療后，血清中NO、IL-6 和IL-1β 水平，以及腦組織中CGRP 含量降低，腦組織中5-HT 和β-EP 含量升高，提示TSPN 能夠緩解硝酸甘油造成的大鼠炎癥性偏頭痛，減少大鼠痛感，實(shí)現(xiàn)對(duì)疾病的保護(hù)。

NRG 可作為配體結(jié)合于細(xì)胞表面ErbB 受體，引起原有構(gòu)象發(fā)生改變，進(jìn)而影響下游信號(hào)通路的變化，進(jìn)而調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞［16］。NRG 中NRG1 研究較廣泛，ErbB 在腦中神經(jīng)元胞體中可見ErbB2、ErbB3 和ErbB4。另有研究顯示，NRG/ErbB 通路具有抗凋亡作用，能夠抑制caspase-3的活化，實(shí)現(xiàn)對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞凋亡的緩解［17］；能夠抑制巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)，阻斷巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)促炎因子［18］。在本研究中，模型組NRG1、ErbB2、ErbB3和ErbB4蛋白水平降低，cleaved caspase-3/caspase-3 蛋白水平升高，提示NRG/ErbB 通路蛋白在偏頭痛腦組織中表達(dá)降低，對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用減弱，導(dǎo)致炎癥損傷加劇、神經(jīng)元凋亡嚴(yán)重。經(jīng)TSPN 治療后，NRG/ErbB 通路處于激活狀態(tài)，cleaved caspase-3/caspase-3 蛋白水平降低；在TSPN 治療基礎(chǔ)上添加抑制劑AG825，雖然AG825作為ErbB2 的特異性抑制劑，但ErbB2 受NRG 刺激發(fā)揮作用，會(huì)促進(jìn)cleaved caspase-3/caspase-3、炎癥因子IL-6 和IL-1β 水平升高，提示TSPN 能夠通過激活NRG/ErbB通路實(shí)現(xiàn)對(duì)炎癥、細(xì)胞凋亡的緩解。

綜上所述，TSPN 通過激活NRG/ErbB 通路實(shí)現(xiàn)對(duì)偏頭痛大鼠的保護(hù)，可能與抑制炎癥、抑制神經(jīng)元凋亡有關(guān)，為TSPN 在臨床上治療偏頭痛提供一定動(dòng)物實(shí)驗(yàn)參考依據(jù)。