蔣 霞， 袁鈺萍， 陳舒懷， 段名揚， 鄧祖躍△

（1浙江工業(yè)大學綠色制藥協(xié)同創(chuàng)新中心，浙江杭州 310014；2浙江省食品藥品檢驗研究院，浙江杭州 310052）

腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemia-reperfusion injury，CIRI）是指腦組織在經(jīng)歷一段時間的缺血后，重新供血，被供血區(qū)組織產(chǎn)生大量的活性物質(zhì)造成的腦組織損傷，這種損傷機制被認為與炎癥反應(yīng)、細胞凋亡和氧化應(yīng)激等有關(guān)［1］。近期研究發(fā)現(xiàn)，鐵離子代謝異常引起的細胞鐵死亡可能是腦缺血再灌注損傷的重要病理生理機制［2］。

鐵死亡（ferroptosis）是2012 年才提出的一種新型細胞死亡方式，是由鐵代謝紊亂和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物大量累積導致細胞死亡的一系列過程［2］。鐵死亡與許多疾病密切相關(guān)，如腫瘤、神經(jīng)退行性疾病、腎功能損傷和缺血再灌注損傷等［3］。Fang等［4］報道，在腦缺血再灌注損傷大鼠的損傷腦區(qū)觀察到鐵蓄積。Tou 等［5］在單側(cè)短暫性大腦中動脈栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）大鼠模型中發(fā)現(xiàn)腦組織中有大量鐵積累，而鐵死亡抑制劑ferrostatin-1 治療可以減少腦梗死體積，并改善MCAO 引起的行為缺陷。這些研究均表明，鐵死亡與腦損傷密切相關(guān)。在尋找治療缺血再灌注腦損傷的藥物中，有研究者關(guān)注到了以鐵死亡為靶點的藥物?，F(xiàn)在臨床上主要是鐵螯合劑、輔酶Q10 和補充硒（Se）等化學制劑，其應(yīng)用均有一定的局限性，且可選品種比較少，為了更好防治鐵死亡對缺血再灌注腦損傷的影響，有研究者開始尋找抗鐵死亡的天然藥物［6］。許璐等［7］報道，丹參酮ⅡA 可能通過抑制脂質(zhì)氧化活性和鐵含量達到抑制鐵死亡和保護海馬細胞的作用。Yu等［8］發(fā)現(xiàn)一種植物來源的單萜酚——香芹酚，可通過降低活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的水平，減少鐵沉積和升高谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）的水平，即通過抑制鐵死亡來抑制缺血再灌注損傷后海馬神經(jīng)元的損害并逆轉(zhuǎn)神經(jīng)功能缺陷。

角鯊烯（squalene，SQU）是深海環(huán)境中的大型鯊魚肝臟中提取出的天然物質(zhì)，是一種開鏈三萜類化合物。由6 個異戊二烯單位構(gòu)成的三萜類化合物具有攜氧、降膽固醇、抗氧化、抗輻射和解毒的作用，同時對免疫功能及腫瘤的預防和治療也有一定的生理作用［9-10］，本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，SQU 能拮抗谷氨酸對腦的毒性損傷［11］。那么SQU 對CIRI 腦組織損傷是否有作用，目前還沒有明確報道，本次實驗的目的是證實角鯊烯對腦缺血再灌注損傷腦組織的保護作用，進一步了解角鯊烯調(diào)節(jié)CIRI 是否與鐵死亡相關(guān)并探討可能的機制，為角鯊烯的臨床應(yīng)用提供實驗基礎(chǔ)。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 藥品、試劑和儀器 藥用植物油（西安天正藥用輔料有限公司）；角鯊烯膠丸（浙江海力生）；去鐵敏（deferoxamine，DFO）；鐵死亡誘導劑erastin、鐵死亡的強效抑制劑鐵抑素1（ferrostatin-1，F(xiàn)er-1）為Selleck 產(chǎn)品；TTC 染液、谷胱甘肽（glutathione，GSH）試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒、組織鐵測定試劑盒和ROS 測定試劑盒均購自南京建成；Ⅰ抗：GPX4、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（transferrin receptor 1，TFR1）和乙酰輔酶A 合成酶長鏈家族成員4（acyl-CoA synthetase long-chain family member 4，ACSL4）購自Santa Cruz；SLC7A11、膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白（ferroportin 1，F(xiàn)PN1）購自Abcam；GAPDH、Bradford 蛋白濃度測定試劑盒、青霉素/鏈霉素抗生素均購自碧云天；Ⅱ抗（Bioworld）；FeCl3、DMSO、MTT、DMEM 培養(yǎng)液、0.25%胰酶和磷酸鹽緩沖液（PBS）均購自Gibco；新生牛血清（天杭生物）。Spectra Max190 酶標儀（Molecuar Devices）；AI6000 化學發(fā)光成像系統(tǒng)（GE）；RM2400型切片機、生物顯微鏡（Leica）；CO2培養(yǎng)箱（Thermo）等。

1.2 實驗動物 Sprague-Dawley（SD）大鼠，雄性，體質(zhì)量180～200 g，清潔級，購自浙江省醫(yī)學科學院實驗動物中心［許可證號為SCXK（浙）2019-0002］。每天12 h光照（光照時間為8∶00～20∶00），自由飲食飲水，環(huán)境溫度為20～22 ℃，相對濕度為75%，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

2 方法

2.1 大鼠CIRI 模型的建立 按參考文獻［12］中的MCAO 方法稍改良建立大鼠CIRI模型，首先用2%戊巴比妥鈉麻醉大鼠（ip，3 mL/kg），于其頸部正中間切開，逐步剝離出頸部總動脈、頸外和頸內(nèi)動脈，在頸部總動脈的遠端剪一個0.4 mm 左右的V 型切口，從切口插入線栓入頸總動脈，然后不停調(diào)整角度，使線栓向前到達頸內(nèi)動脈和大腦中動脈，固定線栓，制造缺血模型，120 min 后拔出線栓，實現(xiàn)再灌注，縫合。假手術(shù)組處理同于模型組手術(shù)，不插線栓。12 h 后，參照后面所列的Zea-Longa 改良后評分法對造模大鼠進行評分，得分在1～3 分的大鼠為造模成功大鼠，去掉造模不成功的大鼠，并用同一批次的合格模型補足數(shù)目。

2.2 動物分組與給藥 60 只大鼠隨機分為假手術(shù)（sham）組、MCAO 組、低、中、高劑量（20、40和80 mg·kg-1·d-1灌胃）SQU 處理組（MCAO+SQU-L、MCAO+SQU-M、MCAO+SQU-H 組）和MCAO+DFO（100 mg·kg-1·d-1腹腔注射）陽性組，每組10 只。在模型建立前3 d 開始給藥，每天1 次灌胃給藥，陽性組灌胃溶劑，假手術(shù)組和模型組腹腔注射0.9% NaCl；造模后給藥7 d，最后1 d 進行行為學檢查，處死動物，取腦組織凍于液氮備用。

2.3 大鼠神經(jīng)行為學評分 再灌注12 h 和72 h 后，采用Longa改良評分法對大鼠神經(jīng)行為學評分：無癥狀為0 分，無法伸展對側(cè)前爪為1 分，大鼠向左側(cè)轉(zhuǎn)圈為2 分，行走時向偏癱一側(cè)傾斜為3 分，無自發(fā)活動或意識障礙為4分。

2.4 大鼠腦組織的TTC 染色 大鼠腦組織取下后，先放置于-20 ℃冰箱中冷凍至硬，行冠狀切片，每片厚2 mm，切出5片，放置于2%TTC染液中，37 ℃避光孵育30 min后，用4%多聚甲醛固定30 min后，拍照，采用Image-Pro plus 7.0 軟件進行圖像分析，計算大鼠腦部梗死灶體積。

2.5 FeCl3誘導的PC12 細胞損傷模型的建立及分組 將PC12 細胞（浙江工業(yè)大學藥學院藥理實驗室贈予）以1×108/L 的密度接種于96 孔板，24 h 后吸去培養(yǎng)基。然后加入含200 μmol/L FeCl3的培養(yǎng)基，培養(yǎng)4 h，換培養(yǎng)基，建立鐵死亡模型。細胞實驗分組：空白對照（control）組、FeCl3（200 μmol/L）組、FeCl3+SQU（80 mg/L）組、FeCl3+erastin（5 μmol/L）組、Fe-Cl3+Fer-1（5 μmol/L）組、FeCl3+SQU+erastin 組、Fe-Cl3+SQU+Fer-1 組和FeCl3+DFO（400 μmol/L）組，每組6個復孔，37 ℃，5%CO2孵育。加藥24 h后于倒置顯微鏡下進行細胞形態(tài)學觀察和存活率檢測，收集各組細胞凍存?zhèn)溆?。各組給藥劑量參考了相關(guān)文獻和前期預實驗結(jié)果。

2.6 鐵離子含量、ROS 熒光強度及GSH 和MDA 含量的檢測 取腦缺血再灌注損傷大鼠梗死交界區(qū)組織/各組PC12細胞勻漿，按照試劑盒說明書步驟操作測定鐵離子含量、ROS 熒光強度及GSH 和MDA含量。

2.7 細胞線粒體跨膜電位的檢測 各組PC12 細胞在加藥處理24 h后，吸去培養(yǎng)液，加入100 μL培養(yǎng)液和100 μL JC-1 染色工作液，混勻，37 ℃孵育20 min后用JC-1緩沖液洗滌2次，加入200 μL培養(yǎng)液，顯微鏡下觀察并拍照。比較各組細胞的線粒體跨膜電位變化情況。

2.8 Western blot 法檢測鐵死亡相關(guān)蛋白的表達水平 取腦缺血再灌注損傷大鼠梗死交界區(qū)組織/各組PC12 細胞提取總蛋白，試劑盒蛋白定量后進行Western blot 檢測：電泳、轉(zhuǎn)膜、孵育Ⅰ抗、Ⅱ抗，顯色，以GAPDH 為內(nèi)參照，應(yīng)用圖像分析軟件Image J進行分析。

3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件進行處理，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（mean±SD）表示，數(shù)據(jù)進行單因素方差分析后，用SNK-q檢驗進行各組間均數(shù)的兩兩比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

1 SQU對腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)功能的影響

術(shù)后12 h 和72 h，與假手術(shù)組相比，MCAO 模型組大鼠的神經(jīng)行為學評分增加（P＜0.05），提示該模型對大鼠的神經(jīng)功能有明顯的損傷。與模型組相比，SQU 各劑量和DFO 干預組的神經(jīng)行為學評分均小于模型組，呈劑量依賴性，其中MCAO+SQU-H 和MCAO+DFO 組神經(jīng)行為學評分較MCAO 組的差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），說明SQU 和DFO 均改善大鼠受損的神經(jīng)功能。與術(shù)后12 h 相比，各組大鼠在72 h 的神經(jīng)行為學評分都有所降低，說明大鼠有一定自愈能力，但各給藥組的恢復更好，見表1。

表1 角鯊烯對腦缺血再灌注損傷大鼠MCAO 術(shù)后12 和72 h 神經(jīng)行為學評分及腦組織鐵含量、ROS 熒光強度、GSH 水平和MDA水平的影響Table 1. Effects of squalene（SQU）on neurobehavioral scores 12 and 72 h after MCAO，and iron content，ROS fluorescence intensity，GSH level and MDA level in the brain tissue of rats with cerebral ischemia-reperfusion injury（Mean±SD）

2 角鯊烯對腦缺血大鼠腦梗死體積的影響

假手術(shù)組沒有梗死區(qū)，而模型組出現(xiàn)明顯的腦梗死灶，梗死體積為（24.33±3.14）mm3，與假手術(shù)組相比顯著升高（P＜0.01）；SQU 低、中、高劑量組和DFO 組的腦梗死體積分別為（20.68±2.13）mm3、（17.86±1.69） mm3、（7.42±1.49） mm3和（7.43±1.25）mm3，與MCAO 組比較，MCAO+SQU-M 組、MCAO+SQU-H 組和MCAO+DFO 組的梗死體積均降低（P＜0.05），而MCAO+SQU-L 組腦梗死體積有輕度降低，但較MCAO 組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖1。

Figure 1. Effect of squalene（SQU）on infarct volume induced by cerebral ischemia-reperfusion injury in rats. Mean±SD.n=3.**P＜0.01vs sham group；#P＜0.05vs model group.圖1 角鯊烯對腦缺血再灌注損傷大鼠腦梗死體積的影響

3 角鯊烯對腦缺血再灌注損傷大鼠氧化損傷相關(guān)指標的影響

與假手術(shù)組相比，MCAO 組損傷腦組織中鐵離子含量、ROS 熒光強度和MDA 水平明顯升高，GSH水平明顯降低（P＜0.05）；與MCAO 組比較，SQU 各劑量組鐵離子含量、ROS 熒光強度和MDA 水平逐漸降低，GSH 水平逐漸升高，基本呈濃度依賴性，MCAO+DFO組結(jié)果與MCAO+SQU-H組相接近，見表1。

4 角鯊烯對腦缺血再灌注損傷大鼠鐵死亡相關(guān)蛋白表達的影響

與假手術(shù)組相比，MCAO 組腦組織中SLC7A11、GPX4 和FPN1 表達降低，ACSL4 和TFR1 表達升高（P＜0.05）；與模型組相比，MCAO+SQU 組和MCAO+DFO 組的SLC7A11、GPX4 和FPN1 表達出現(xiàn)不同程度的增加，ACSL4 和TFR1 的表達出現(xiàn)不同程度的降低，除MCAO+SQU-L 組的FPN1 的蛋白表達較模型組差異沒有統(tǒng)計學意義外，其余組差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖2。

Figure 2. Effects of squalene（SQU）on the expression of ferroptosis-related proteins in rats with cerebral ischemia reperfusion injury.Mean±SD.n=3.*P＜0.05vs sham group；#P＜0.05vs MCAO group.圖2 角鯊烯對腦缺血再灌注損傷大鼠鐵死亡相關(guān)蛋白表達的影響

5 角鯊烯對FeCl3誘導的PC12 細胞形態(tài)學和存活率影響

與空白對照組相比，F(xiàn)eCl3組的細胞數(shù)目顯著減少，出現(xiàn)明顯損傷，細胞存活率顯著降低（P＜0.05）；與FeCl3組相比，F(xiàn)eCl3+erastin 組細胞損傷更嚴重，死亡細胞數(shù)目增加，細胞存活率進一步降低（P＜0.05），而FeCl3+SQU 組、FeCl3+Fer-1 組、FeCl3+DFO 組、Fe-Cl3+SQU+Fer-1 組存活細胞數(shù)目增加（P＜0.05），F(xiàn)e-Cl3+SQU+erastin 存活細胞數(shù)目稍有增加，但差異較FeCl3組沒有統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與FeCl3+erastin組比較，F(xiàn)eCl3+SQU+erastin 存活細胞數(shù)目有所增加，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與FeCl3+Fer-1 組比較，F(xiàn)eCl3+SQU+Fer-1 組的存活細胞數(shù)目進一步增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖3。

Figure 3. Effect of squalene（SQU）combined with erastin and Fer-1 on morphological change and viability of PC12 cells induced by FeCl3. The scale bar=100 μm. Mean±SD.n=3.*P＜0.05vs control group；#P＜0.05vs FeCl3 group；△P＜0.05vs FeCl3+erastin group；▲P＜0.05vs FeCl3+Fer-1 group.圖3 角鯊烯與erastin和Fer-1聯(lián)合用藥對FeCl3誘導的PC12細胞形態(tài)和存活率的影響

6 角鯊烯對FeCl3誘導的PC12 細胞模型氧化損傷相關(guān)指標的影響

與空白對照組比較，F(xiàn)eCl3誘導的PC12細胞模型組鐵離子含量、ROS熒光強度和MDA水平升高，GSH水平降低（P＜0.05）；與FeCl3組比較，F(xiàn)eCl3+erastin 組的鐵離子含量、ROS熒光強度和MDA水平升高，GSH水平降低（P＜0.05），其余各組鐵離子含量、ROS熒光強度和MDA 水平出現(xiàn)不同程度的降低，GSH 水平出現(xiàn)不同程度的升高，其中FeCl3+SQU+Fer-1 組變化最明顯（P＜0.05）；與FeCl3+erastin 組比較，F(xiàn)eCl3+SQU+erastin 組鐵離子含量、ROS 熒光強度和MDA 水平降低，GSH 水平升高（P＜0.05）；與FeCl3+Fer-1 組比較，F(xiàn)eCl3+SQU+Fer-1 組鐵離子含量、ROS 熒光強度和MDA 水平進一步降低，GSH 水平進一步升高（P＜0.05），見表2。

表2 角鯊烯與erastin和Fer-1聯(lián)合用藥對FeCl3誘導的PC12細胞鐵含量、ROS熒光強度、GSH水平和MDA水平的影響Table 2. Effect of squalene（SQU）combined with erastin and Fer-1 on iron content，ROS fluorescence intensity，GSH level and MDA level in the PC12 cells induced by FeCl3（Mean±SD. n=3）

7 角鯊烯對FeCl3誘導的PC12 細胞線粒體跨膜電位的影響

與空白對照組相比，模型組的線粒體跨膜電位明顯下降，說明FeCl3對PC12細胞的損傷可以顯著降低線粒體跨膜電位；與FeCl3模型組相比，除FeCl3+erastin 組線粒體膜電位下降更為明顯，其他組的線粒體膜電位均有不同程度的升高，說明SQU 和DFO的給藥減輕了FeCl3誘導的PC12細胞的損傷，且鐵死亡誘導劑erastin 的使用降低了SQU 的修復能力，而與抑制劑Fer-1 的聯(lián)合用藥對損傷恢復的效果更好，見圖4。

Figure 4. Effect of squalene（SQU）combined with erastin and Fer-1 on mitochondrial transmembrane potential in PC12 cells induced by FeCl3（×200）.圖4 角鯊烯與erastin、Fer-1聯(lián)合用藥對FeCl3誘導的PC12細胞線粒體膜電位的影響

8 角鯊烯對FeCl3誘導的PC12 細胞鐵死亡相關(guān)蛋白表達的影響

在PC12 細胞實驗中，與空白對照組相比，F(xiàn)eCl3模型組SLC7A11、GPX4 和FPN1 表達水平降低，ACSL4和TFR1表達水平升高（P＜0.05）；與FeCl3模型組比較，F(xiàn)eCl3+SQU 組、FeCl3+DFO 組和FeCl3+Fer-1 組的SLC7A11、GPX4 和FPN1 表達水平升高，ACSL4 和TFR1 表達水平降低（P＜0.05），而FeCl3+erastin 組SLC7A11、GPX4 和FPN1 表達水平降低，ACSL4 和TFR1 表達水平升高，除GPX4 和TFR1 蛋白外，其他蛋白的差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與FeCl3+erastin 組比較，F(xiàn)eCl3+SQU+erastin 組SLC7A11、GPX4和FPN1 表達水平升高，ACSL4 和TFR1 表達水平降低（P＜0.05）；與FeCl3+Fer-1 組比較，F(xiàn)eCl3+SQU+Fer-1 組SLC7A11、GPX4 和FPN1 表達水平進一步升高，ACSL4 和TFR1 表達水平進一步降低（P＜0.05），見圖5。

Figure 5. Effect of squalene（SQU）combined with erastin and Fer-1 on the expression of ferroptosis-related proteins in the PC12 cells induced by FeCl3. Mean±SD.n=3.*P＜0.05vs control group；#P＜0.05vs FeCl3 group；△P＜0.05vs FeCl3+erastin group；▲P＜0.05vs FeCl3+Fer-1 group.圖5 角鯊烯與erastin、Fer-1聯(lián)合用藥對FeCl3誘導的PC12細胞鐵死亡相關(guān)蛋白表達的影響

討論

本次實驗結(jié)果顯示，給予SQU 的大鼠與模型組大鼠比較，其神經(jīng)行為學評分降低，梗死體積均減小，神經(jīng)元細胞的損傷減輕，并存在劑量依耐性，說明SQU 對CIRI 大鼠腦組織有保護作用。有研究報道，因為CIRI 與脂質(zhì)過氧化和細胞內(nèi)高水平鐵含量等鐵死亡相關(guān)信號密切相關(guān)［13--14］，本次實驗又設(shè)計了FeCl3誘導鐵死亡細胞模型，進一步研究SQU 對CIRI 過程中鐵死亡相關(guān)通路的影響，了解其可能的調(diào)控機制。

鐵死亡涉及多條通路，其中包括鐵代謝失調(diào)、脂質(zhì)代謝異常和氧化損傷等，其過程為CIRI 改變腦內(nèi)相關(guān)分子，導致了鐵的負載，鐵累積使細胞內(nèi)不穩(wěn)定鐵池的鐵含量升高，這些增加的二價鐵通過Fenton反應(yīng)產(chǎn)生羥基自由基和脂氧合酶途徑催化脂質(zhì)過氧化，導致氧化應(yīng)激水平的增加；脂代謝增加膜磷脂上的多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFAs），使其易受ROS攻擊導致脂質(zhì)過氧化；當細胞無法通過抗氧化機制有效清除胞內(nèi)ROS，導致脂質(zhì)過氧化物質(zhì)積累，從而使細胞死亡［2，15-18］。以鐵和PUFAs 為原料推動了鐵死亡的發(fā)生，同時以GSH 為底物的GPX4則反向調(diào)控鐵死亡［2，15］。

在鐵死亡相關(guān)的各通路中有各自的關(guān)鍵分子，鐵代謝中TFR1蛋白與Fe3+進入細胞，而FPN1負責將細胞內(nèi)多余的鐵釋放入細胞間隙［19］。脂質(zhì)過氧化相關(guān)機制主要是Xc-/GPX4系統(tǒng)，系統(tǒng)Xc-是存在于膜表面的胱氨酸/半胱氨酸-谷氨酸的轉(zhuǎn)運蛋白，其輕鏈亞基（SLC7A11）是活性指標，GPX4 是谷胱甘肽過氧化物酶系的一員，在保護細胞免受脂質(zhì)過氧化、抑制鐵死亡的過程中起著關(guān)鍵作用［20］，GSH與GPX4結(jié)合發(fā)揮清除脂質(zhì)過氧化的作用，是鐵死亡的特異性指標［21］。脂質(zhì)代謝過程中，ACSL4 和溶血卵磷脂?；D(zhuǎn)移酶3（lysophosphatidylcholine acyltransferase 3，LPCAT3）通過調(diào)控不飽和脂肪酸（如花生四烯酸和腎上腺酸）的轉(zhuǎn)化，改變膜磷脂的穩(wěn)態(tài)，是脂肪酸代謝的關(guān)鍵因素［16，22］。本研究中，TFR1 表達增加，F(xiàn)PN1 表達降低，鐵含量增加，產(chǎn)生大量ROS，SLC7A11 表達降低，谷氨酸半胱氨酸交換減少，使GSH 含量減少，進而使得GPX4 的活性下降，細胞清除脂質(zhì)過氧化物能力不足，而ACSL4表達增加，增加了神經(jīng)元膜磷脂的多不飽和脂肪酸的磷脂含量，使膜更易受到氧化攻擊，產(chǎn)生了更多的氧化產(chǎn)物如MDA等，這些脂質(zhì)過氧化累積在線粒體膜，使線粒體膜電位下降，發(fā)生細胞鐵死亡，進而使神經(jīng)功能受損。

許多天然產(chǎn)物對抑制細胞鐵死亡有明顯效果，如黃芩素、遠志皂苷元［22-23］可抑制鐵累積，降低脂質(zhì)過氧化水平，抑制鐵死亡。SQU 作為海洋生物鯊魚肝臟的天然物，因其獨特的結(jié)構(gòu)而具備很多生理功能［24］。本研究結(jié)果顯示，SQU 可以降低缺血再灌注損傷腦組織中鐵離子含量，因為SQU 可以降低腦組織TFR1表達來降低鐵的來源，增加FPN1表達，增加鐵的排出，使細胞內(nèi)不穩(wěn)定鐵池的鐵含量降低；SQU抑制了氧自由基引起的腦突觸體釋放谷氨酸，改善腦損傷后胞外高谷氨酸濃度的微環(huán)境，從而減弱谷氨酸對天冬氨酸的刺激，導致天冬氨酸蛋白表達相應(yīng)下調(diào)，進一步降低細胞的鐵攝取。因為天冬氨酸受體刺激可通過TFR1 和二價金屬轉(zhuǎn)運蛋白1 誘導分子級聯(lián)反應(yīng)，導致神經(jīng)元鐵攝取增加［25-27］。本次實驗在鐵死亡細胞模型中給予SQU 也獲得與動物實驗相同的降低鐵死亡的結(jié)果，另外，在細胞實驗中，還增加了鐵死亡誘導劑erastin，結(jié)果顯示erastin增加了TFR1 的表達，加重了鐵死亡模型細胞的死亡，但SQU 對TFR1 的抑制作用，減輕了erastin 加重的細胞鐵死亡，證明了SQU對鐵代謝的調(diào)控作用。

SQU 可使腦組織中脂肪酸代謝的關(guān)鍵分子ACSL4蛋白的表達水平下降，使易氧化損傷的膜磷脂減少，使膜的穩(wěn)定性增加［28］，本次實驗中也觀察到SQU使鐵死亡模型細胞的線粒體跨膜電位增加，細胞存活增加，但SQU 調(diào)節(jié)ACSL4 蛋白表達的具體機制還不清楚，將在下一步研究。

SQU 在細胞和動物實驗中，表現(xiàn)出強的抗氧化能力，SLC7A11 和GPX4 表達水平上調(diào)、GSH 含量增加及MDA 水平降低，其機制可能與SQU 的化學結(jié)構(gòu)類有似β-胡蘿卜素的異戊間二烯化合物，含有多個不飽和烴，能結(jié)合多種自由基，發(fā)揮抗氧化作用有關(guān)［29］。SQU 上調(diào)SLC7A11 蛋白表達，增加了半胱氨酸的交換，有利于GSH 生成，從而上調(diào)了GPX4 的活性，促進毒性脂質(zhì)過氧化氫轉(zhuǎn)化為無毒脂醇的效率，降低MDA 含量，達到降低脂質(zhì)過氧化水平，改善神經(jīng)元損傷的作用［30］。本課題組在細胞實驗中使用鐵死亡拮抗劑Fer-1 發(fā)現(xiàn)，SQU 可和Fer-1 有相互促進的抗鐵死亡作用，主要表現(xiàn)二者合用比單獨用任意一種藥物更能降低鐵死亡模型細胞MDA 水平，增加線粒體跨膜電位，進一步增加細胞存活率。

本研究結(jié)果證實了SQU 對CIRI 大鼠腦組織有保護作用，而其保護作用與調(diào)控鐵死亡相關(guān)的3 條通路（鐵代謝、脂質(zhì)代謝和氧化損傷）密切相關(guān)，具體表現(xiàn)為為降低細胞內(nèi)鐵含量，改善脂肪酸代謝，增加細胞抗氧化作用。