李爽林， 張 輝， 王 洋， 高 慧， 楊應(yīng)忠， 劉永年

（青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，青海西寧 810001）

先天性心臟?。╟ongenital heart disease，CHD）的發(fā)病機(jī)制中遺傳因素占重要作用［1］，主要包括染色體異常、單基因病和多基因病等。流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示，高原地區(qū)CHD 發(fā)病率明顯高于平原地區(qū)且具有民族差異［2］。本課題組前期利用Genome-Wide Human SNP Array 6.0芯片對(duì)部分高原藏族CHD患者單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）位點(diǎn)進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析（genome-wide association study，GWAS），發(fā)現(xiàn)易感位點(diǎn)rs11187529 存在于游離脂肪酸受體4（free fatty acid receptor 4，F(xiàn)FAR4）基因上。FFAR4 是一種G 蛋白偶聯(lián)受體，在找不到配體以前被稱為G 蛋白偶聯(lián)受體120（G-protein-coupled receptor 120，GPR120）［3］，作用于長(zhǎng)鏈脂肪酸包括以二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）和二十二碳六烯酸（docosexaenoic acid，DHA）為代表的ω3 多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFAs）家族［4］。研究顯示，F(xiàn)FAR4 在大鼠心臟組織中存在表達(dá)，高脂飲食可明顯上調(diào)心臟組織中的FFAR4基因轉(zhuǎn)錄物［5］。后期研究進(jìn)一步表明，F(xiàn)FAR4 在小鼠的心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中表達(dá)，且可通過(guò)信號(hào)傳導(dǎo)介導(dǎo)EPA 而防止心臟成纖維細(xì)胞的纖維化［6］。本研究選擇了前期研究新發(fā)現(xiàn)的易感位點(diǎn)所在基因FFAR4，進(jìn)一步驗(yàn)證FFAR4基因多態(tài)性與藏族CHD的關(guān)系。

材 料 和 方 法

1 研究對(duì)象

選取2018 年9 月～2019 年9 月在青海大學(xué)附屬醫(yī)院、青海省人民醫(yī)院等就診的藏族CHD 患者103例，同期參加體檢的藏族健康對(duì)照者267 例。病例組納入標(biāo)準(zhǔn)均經(jīng)病史資料采集，臨床體格檢查診斷，心電圖、心臟彩超檢查或經(jīng)心導(dǎo)管及心血管造影檢查后臨床確診為CHD，所有病例組CHD 患者排除無(wú)其他先天性遺傳疾病。同期參加體檢的年齡、性別相匹配的健康藏族對(duì)照者，經(jīng)病史資料采集，臨床體格檢查診斷，心電圖和心臟彩超檢查證實(shí)為健康者，所有健康對(duì)照者均排除CHD 和其他先天性遺傳疾病。本研究通過(guò)青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)的審批，經(jīng)研究對(duì)象同意并簽署知情同意書。

2 候選tag SNP位點(diǎn)的篩選

研究表明，部分SNP 位點(diǎn)可提供遺傳單位單體型（haplotype）內(nèi)大部分信息，這些位點(diǎn)稱為標(biāo)簽SNP（tag SNP）。通過(guò)千人數(shù)據(jù)庫(kù)中基因數(shù)據(jù)庫(kù)查找FFAR4基因的常見SNP 位點(diǎn)，使用HaploView 4.2 軟件通過(guò)連鎖不平衡（linkage disequilibrium）分析挑選tag SNP 位點(diǎn)，設(shè)置參數(shù)最小等位基因頻率（minor allele frequency，MAF）＞0.05，重新篩選SNP 位點(diǎn)后，根據(jù)SNP 之間連鎖不平衡相關(guān)程度R2＞0.08 選擇tag SNP，單體型塊的劃分采用表示位點(diǎn)間連鎖不平衡程度的D值置信區(qū)間（confidence interval，CI）法，D值的95%CI在0.70～0.98 的相鄰SNP 歸于同一個(gè)單體型塊，根據(jù)篩選結(jié)果選擇了5 個(gè)tag SNP 位點(diǎn)，即rs12219199、rs12220062、rs77999136、rs12243124 和rs10882282，見圖1及表1。

表1 候選tag SNP位點(diǎn)信息表Table 1. Information about candidate tag SNP loci

Figure 1. Selection of candidate tag SNP loci. The black triangle box in the figure represents the enclosed monomer block，the red panel shows that there is a strong linkage balance between adjacent SNPs，and the white panel indicates that the linkage disequilibrium is weak or non-existent.圖1 候選tag SNP位點(diǎn)的篩選

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 基因提取 使用用乙二胺四乙酸二鉀抗凝管采集CHD 患者和健康對(duì)照者外周靜脈血5 mL，1 788.8×g離心10 min 后吸取血漿層至凍存管，置冰箱保存（-80 ℃）；提取白細(xì)胞層至15 mL 的離心管中，加入紅細(xì)胞裂解液至12 mL，混勻后1 788.8×g離心10 min 倒掉紅細(xì)胞層，重復(fù)上述步驟充分去除紅細(xì)胞，最后加入1.5 mL白細(xì)胞裂解液室溫保存。

使用Gentra Puregene Blood Kit（Qiagen）按照標(biāo)準(zhǔn)步驟提取基因組DNA，提取后的DNA 經(jīng)瓊脂糖凝膠（1.5%～2.0%）電泳40 min 后，在凝膠成像曝光儀中觀察提取的DNA 結(jié)果。從全部研究對(duì)象的血液標(biāo)本中提取了基因組DNA 后，使用核酸定量分析儀測(cè)定其濃度和純度，DNA純度結(jié)果均在1.8＜A260/A280＜2.0，代表純度高符合使用要求，濃度稀釋至50 μg/L后凍存于冰箱（-20 ℃）備用，見圖2。

Figure 2. Image of agarose gel electrophoresis of some DNA.The PCR products were exposed by gel imaging system，and the results showed that the bands were clear and bright，without heterobands and tails，indicating that the extracted DNA was in ideal condition.圖2 部分DNA樣本瓊脂糖凝膠電泳圖

3.2 引物設(shè)計(jì) 采用Genotyping Tools 及MassARRAY Assay Design 軟件（Agena）為每個(gè)候選tag SNP位點(diǎn)自動(dòng)設(shè)計(jì)PCR 擴(kuò)增引物及單堿基延伸引物，由北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司合成，序列見表2。

表2 候選tag SNP位點(diǎn)的引物序列Table 2. The sequences of the primers for candidate tag SNP loci

3.3 PCR 擴(kuò)增 將反應(yīng)體系［DNA 1 μL 和反應(yīng)混合物4 μL（HotStarTaq DNA 聚合酶0.1 μL，引物1 μL，dNTPs 0.1 μL，緩沖液0.5 μL，MgCl20.4 μL，滅菌雙蒸水1.9 μL 補(bǔ)齊）］共5 μL 加至384 孔PCR 反應(yīng)板中。在PCR 擴(kuò)增儀上將設(shè)置反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性4 min，循環(huán)1 次；94 ℃變性20 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)45次；72 ℃復(fù)延伸。

3.4 PCR 產(chǎn)物的蝦堿性磷酸酶（shrimp alkaline phosphatase，SAP）處理 在PCR 產(chǎn)物中加入SAP 處理以去除擴(kuò)增產(chǎn)物中剩余的、非結(jié)合的dNTPs，SAP通過(guò)切斷5'端的磷酸基，使未結(jié)合的DNA 磷酸化。將反應(yīng)體系［PCR 產(chǎn)物5 μL 和SAP 混合液2 μL（包括SAP 0.5 U 和緩沖液0.17 μL）］共7 μL分配到384孔PCR 反應(yīng)板的每個(gè)孔中。將處理過(guò)的培養(yǎng)板放置在37 ℃的培養(yǎng)箱中40 min，然后再放置在85 ℃的培養(yǎng)箱中5 min（反應(yīng)條件為：37 ℃預(yù)變性40 min；85 ℃變性5 min；4 ℃復(fù)延伸），以使SAP失活。

3.5 單堿基延伸反應(yīng) 反應(yīng)體系（9 μL）包含SAP處理后PCR 產(chǎn)物7 μL 和延伸反應(yīng)混合物2 μL（引物0.94 μL，iPLEX 酶0.041 μL，iPLEX 緩沖液0.2 μL，iPLEX 終止液0.2 μL，滅菌雙蒸水0.619 μL 補(bǔ)齊），加入到PCR 反應(yīng)孔上。將反應(yīng)程序設(shè)置為：94 ℃預(yù)變性30 s，循環(huán)1 次；52 ℃變性5 s，80 ℃退火5 s，循環(huán)4 次；94 ℃預(yù)變性5 s，循環(huán)1 次；52 ℃變性5 s，80 ℃退火5 s，循環(huán)39次；延伸3 min，4 ℃維持。

3.6 樹脂純化 這一清理步驟對(duì)于優(yōu)化延長(zhǎng)反應(yīng)產(chǎn)物的質(zhì)譜分析非常重要。將6 mg Clean Resin樹脂平鋪到樹脂板中，在單堿基延伸反應(yīng)的產(chǎn)物對(duì)應(yīng)孔內(nèi)加入16 μL的水，將干燥后的樹脂添加到引物擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物中，使樹脂與反應(yīng)物充分接觸，離心使樹脂沉入孔底部。經(jīng)過(guò)酸性試劑預(yù)處理的陽(yáng)離子樹脂，去除Na+、K+和Mg2+等鹽類，如果不去除，這些離子會(huì)在質(zhì)譜中產(chǎn)生高背景噪聲。

3.7 芯片點(diǎn)樣 通過(guò)基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）技術(shù)，檢測(cè)延伸產(chǎn)物分子量的大小，將SNP 引起的堿基差異通過(guò)分子量的差異而體現(xiàn)。將樹脂純化后的延伸產(chǎn)物移至芯片上，將芯片放入質(zhì)譜計(jì)中，然后用真空下的激光通過(guò)基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間方法對(duì)每個(gè)點(diǎn)進(jìn)行拍攝，在MALDI-TOF 質(zhì)譜中，激光束作為解吸和電離源，基質(zhì)吸收了激光的光能，并導(dǎo)致部分被照亮的基質(zhì)汽化，迅速膨脹的基質(zhì)羽狀物將一些分析物帶入真空中，基質(zhì)分子吸收大部分入射激光能量，使樣品分子被汽化和電離，它們就被靜電轉(zhuǎn)移到飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（time-of-flight mass spectrometer，TOF-MS）中，在那里它們從基質(zhì)離子中分離出來(lái)，根據(jù)它們的質(zhì)量-電荷比（m/z）單獨(dú)檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果使用TYPER 4.0軟件（Agena）進(jìn)行基因分型。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0 軟件。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料兩組間比較采用χ2檢驗(yàn)。使用Hardy-Weinberg 平衡檢驗(yàn)樣本的群體代表性，以P＞0.05 代表樣本基因型符合遺傳平衡，具有群體代表性。兩組間基因型和等位基因頻率的比較使用χ2檢驗(yàn)或Fisher 精確概率檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。連鎖不平衡和單體型通過(guò)SHEsis（http：//analysis.bio-x.cn）在線網(wǎng)站分析，分析結(jié)果使用P值、優(yōu)勢(shì)比（odds ratio，OR）及其95%CI 表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，OR=1表示該因素對(duì)疾病的發(fā)生不起作用，OR＞1表示該因素可能為危險(xiǎn)因素，OR＜1表示該因素可能為保護(hù)因素。

結(jié)果

1 病例組和對(duì)照組一般資料比較

樣本資料包括CHD 患者103 例和健康對(duì)照者267例，病例組平均年齡為（22.0±17.0）歲，對(duì)照組為（22.2±12.3）歲，組間年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。病例組男性42例，女性61例，對(duì)照組男性99例，女性168 例，χ2檢驗(yàn)分析結(jié)果顯示組間性別構(gòu)成差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2 Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)結(jié)果

使用Hardy-Weinberg 平衡定律檢驗(yàn)Excel 小軟件在線檢驗(yàn)樣本的基因多態(tài)性是否符合遺傳平衡。結(jié)果顯示，F(xiàn)FAR4基因篩選的5 個(gè)候選tag SNP 位點(diǎn)rs12219199、rs12220062、rs77999136、rs12243124 和rs10882282 在病例組和對(duì)照組均符合Hardy-Weinberg 平衡定律（P＞0.05），所選位點(diǎn)具有樣本代表性，可進(jìn)行下一步分析，見表3。

表3 候選tag SNP位點(diǎn)的Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)Table 3. Hardy-Weinberg equilibrium test for candidate tag SNP loci

3 候選tag SNP位點(diǎn)基因型和等位基因型頻率分析

FFAR4基因SNP分型結(jié)果如表4所示，rs1221919的3 種基因型CC、CT 和TT 在病例組分別是51.5%、36.9%和11.7%，在對(duì)照組分別是50.2%、42.7%和7.1%，CT 和TT 基因型頻率分布在兩組間無(wú)顯著差異（P＞0.05）；等位基因C 和T 在病例組分別是66.9%和30.1%，在對(duì)照組分別是71.5%和28.5%，兩組間T 等位基因頻率分布無(wú)顯著差異（P＞0.05）。rs1220062的3種基因型GG、GA 和AA 在病例組分別是46.6%、38.8% 和14.6%，在對(duì)照組分別是51.3%、38.6%和10.1%，GA 和AA 基因型頻率分布在兩組間無(wú)顯著差異（P＞0.05）；等位基因G 和A 在病例組分別是66.0%和34.0%，在對(duì)照組分別是70.6%和29.4%，兩組間A 等位基因頻率分布無(wú)顯著差異（P＞0.05）。rs77999136 的3 種基因型CC、CT和TT在病例組分別是89.3%、9.7%和1.0%，在對(duì)照組分別是90.6%、9.4%和0.0%，CT 和TT 基因型頻率分布在兩組間無(wú)顯著差異（P＞0.05）；等位基因C和T 在病例組分別是94.2%和5.8%，在對(duì)照組分別是95.3%和4.7%，兩組間T 等位基因頻率分布無(wú)顯著差異（P＞0.05）。rs12243124 的3 種基因型TT、TC和CC 在病例組分別是33.0%、7.6%和19.4%，在對(duì)照組分別是33.7%、51.3%和15.0%，TC 和CC 基因型頻率分布在兩組間無(wú)顯著差異（P＞0.05）；等位基因T和C在病例組分別是56.8%和43.2%，在對(duì)照組分別是59.4%和40.6%，兩組間C 等位基因頻率分布無(wú)顯著差異（P＞0.05）。rs10882282 的3 種基因型GG、GC 和CC 在病例組分別是26.2%、46.6% 和27.2%，在對(duì)照組分別是30.7%、51.3%和18.0%，GC 和CC 基因型頻率分布在兩組間無(wú)顯著差異（P＞0.05）；等位基因T 和C 在病例組分別是68.0%和32.0%，在對(duì)照組分別是68.7%和31.3%，兩組間C等位基因頻率分布有顯著差異（P＜0.05）。

表4 候選tag SNP位點(diǎn)在CHD組和健康對(duì)照組中基因型及等位基因頻率的分布Table 4. Distribution of the genotypic and allelic frequencies of the candidate tag SNP loci between congenital heart disease（CHD）group and healthy control group

4FFAR4 基因候選tag SNP 位點(diǎn)的連鎖不平衡和單體型分析結(jié)果

候選tag SNP 位點(diǎn)按rs12219199-rs12220062-rs-77999136-rs12243124-rs10882282在染色體上的先后順序進(jìn)行排序，這些SNP位點(diǎn)間的遺傳連鎖程度以D值表示，F(xiàn)FAR4基因非編碼區(qū)候選tag SNP 位點(diǎn)連不平衡圖顯示，這些SNP位點(diǎn)之間存在較強(qiáng)的連鎖不平衡，見圖3。

單體型分析結(jié)果顯示有7 類常見單體型，其中單體型CACCC 在兩組間無(wú)顯著差異（P＞0.05），OR=1.463（95% CI：0.915～2.340）；單體型CGCCC 在兩組間無(wú)顯著差異（P＞0.05），OR=0.918（95% CI：0.445～1.896）；單體型CGCTC 在兩組間有顯著差異（P＜0.05），OR=2.849（95%CI：1.400～5.798），可能為CHD 的危險(xiǎn)因素；單體型CGCTG 在兩組間有顯著差異（P＜0.05），OR=0.702（95%CI：0.506～0.974），可能為CHD 的保護(hù)因素；單體型TACCC 在兩組間無(wú)顯著差異（P＞0.05），OR=1.054（95% CI：0.695～1.598）；單體型TGCCC 在兩組間無(wú)顯著差異（P＞0.05），OR=0.640（95% CI：0.281～1.457）；單體型TGTTG 在兩組間無(wú)顯著差異（P＞0.05），OR=1.223（95%CI：0.586～2.549），見表5。

表5FFAR4基因非編碼區(qū)單體型分析Table 5. Haplotype analysis of noncoding area of theFFAR4 gene

討論

CHD 是國(guó)內(nèi)外新生兒發(fā)病率最高的先天性出生缺陷，占所有先天性畸形的25%［8］，也是圍產(chǎn)期和嬰兒死亡的主要原因［9］，在活產(chǎn)新生兒中CHD 的發(fā)病率約為0.8%～0.9%，死產(chǎn)或流產(chǎn)胎兒中的發(fā)病率達(dá)1%［10］。CHD 的確切發(fā)病機(jī)制目前仍沒有完全闡明，研究表明遺傳因素和環(huán)境因素的相互作用是其主要的致病危險(xiǎn)因素［11］。流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)調(diào)查顯示高原地區(qū)的CHD 發(fā)病率較平原地區(qū)升高，且發(fā)病率與海拔高度成正相關(guān)［12］，海拔4 000 米以上的藏族兒童患病率0.874%［13］，明顯高于國(guó)內(nèi)低海拔地區(qū)［14-15］，且患病率在不同民族存在差異性，青海省黃南洲兒童CHD在藏族患病率高于漢族［16］，可能與長(zhǎng)期生活環(huán)境引起的遺傳差異有關(guān)。

FFAR4基因位于人類第10 號(hào)染色體上，最初是從人類基因數(shù)據(jù)庫(kù)的DNA 片段中克隆所認(rèn)識(shí)，被命名為GPR120；隨著研究發(fā)展揭示了其可以作為長(zhǎng)鏈脂肪酸的受體，重新命名為FFAR4基因［17］。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)FAR4基因有兩個(gè)受體序列，既可以形成對(duì)應(yīng)BC-101175 受體序列，編碼361 個(gè)氨基酸蛋白質(zhì)的包含1 086 個(gè)核苷酸的短轉(zhuǎn)錄物，稱為FFAR4短序列（FFAR4-S）［18］，也可以交替剪接形成對(duì)應(yīng)NM-181745受體序列，包含361 個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)FFAR4-S 和含有一個(gè)額外外顯子3 的377 個(gè)氨基酸（包含1 134個(gè)核苷酸）的獨(dú)特較長(zhǎng)同工型，稱為FFAR4長(zhǎng)序列（FFAR4-L）［19］。FFAR4-L 中編碼的額外16 個(gè)氨基酸間隙，位于FFAR4-L 異構(gòu)體的第3 個(gè)細(xì)胞內(nèi)環(huán)，這是一個(gè)對(duì)G 蛋白偶聯(lián)以及拮抗劑誘導(dǎo)的受體磷酸化和隨后的脫敏都至關(guān)重要的受體結(jié)構(gòu)域［20］。這個(gè)額外的間隙含有4 個(gè)磷酸不穩(wěn)定的絲氨酸/蘇氨酸殘基，在沒有激動(dòng)劑的情況下，較短的變異體表現(xiàn)出更明顯的基礎(chǔ)磷酸化，表明FFAR4-S 和FFAR4-L 可能具有不同的激動(dòng)劑刺激的磷酸化譜，F(xiàn)FAR4-L 中的額外間隙可能有助于掩蓋結(jié)構(gòu)性磷酸化位點(diǎn)［21］。至今的研究表明，小鼠和大鼠中只存在FFAR4-S 序列［22］，且非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物恒河猴和食蟹猴研究模型顯示，同樣只存在較短的361 個(gè)氨基酸蛋白質(zhì)的受體序列，與人類FFAR4-S 的同源性為97.5%［23］，F(xiàn)FAR4-L序列只存在于人類。因此，人類FFAR4基因的分子研究具有特異性。

Figure 3. Linkage disequilibrium among the 5 candidate SNP loci ofFFAR4 gene. The sequencing of SNP loci is in the order of chromosome position from small to large，and the degree of genetic linkage between these SNPs is estimated asD values. The red panel indicates that there is a strong linkage balance between adjacent SNPs，while the white panel indicates that the connection imbalance is weak.圖3FFAR4基因5個(gè)候選tag SNP位點(diǎn)的連鎖不平衡圖

研究表明，F(xiàn)FAR4 通過(guò)介導(dǎo)受體EPA，抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1 誘導(dǎo)的小鼠心臟成纖維細(xì)胞纖維化，從而預(yù)防心力衰竭［24］，且不會(huì)在心肌細(xì)胞或成纖維細(xì)胞中積累［25］。FFAR4 的小分子激動(dòng)劑GW9508 以濃度依賴的方式在心臟成纖維細(xì)胞中阻止了轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1 促纖維化信號(hào)傳導(dǎo)，敲除FFAR4后GW9508的抗纖維化作用被阻斷，間接證明了FFAR4 在心臟保護(hù)中的介導(dǎo)作用［26］。FFAR4 與ω3 PUFAs 的多種作用相一致。ω3 PUFAs 的有益作用首次被認(rèn)識(shí)到是當(dāng)時(shí)流行病學(xué)顯示的富含ω3 PUFAs 飲食人群的心肌梗死發(fā)生率較低，隨后幾項(xiàng)大規(guī)模隨機(jī)臨床試驗(yàn)證明了ω3 PUFAs 對(duì)心臟的保護(hù)作用。許多動(dòng)物研究也表明，ω3 PUFAs 對(duì)心血管系統(tǒng)具有多效有益作用，包括抗心律失常、降低血漿甘油三酯、抗血栓形成、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗炎和抗纖維化作用［27］。多個(gè)研究結(jié)果表明，ω3 PUFAs 在包括缺血再灌注［28］、心力衰竭［29］和心律失常［30］在內(nèi)的多種病理生理情況下具有心臟保護(hù)作用。其中EPA 的心臟保護(hù)作用是最明顯的［31］。EPA 的增加可減少線粒體基質(zhì)的氧化應(yīng)激，通過(guò)保護(hù)線粒體極大地保護(hù)了心臟［32］。內(nèi)源性生成的ω3 脂肪酸脂可通過(guò)激活FFAR4 形成ω3 PUFAs-FFAR4通路，減輕血管炎癥［33］、動(dòng)脈血栓形成和血管內(nèi)膜增生［34］，從而發(fā)揮有益的心臟保護(hù)作用。FFAR4與心臟的直接作用機(jī)制目前研究較少。

本研究提取了無(wú)血緣關(guān)系的100 例藏族CHD 患者和100 例藏族健康對(duì)照者的基因組DNA 信息，篩選了FFAR4基因非編碼區(qū)的5 個(gè)tag SNP 位點(diǎn)，通過(guò)分析基因型和等位基因型頻率在CHD 病例組和健康對(duì)照組的分布差異發(fā)現(xiàn)，rs10882282的等位基因C在兩組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示rs10882282 位點(diǎn)的等位基因C與藏族CHD 相關(guān)。在多因素復(fù)雜疾病CHD 中，多個(gè)變異位點(diǎn)組合構(gòu)成的單體型分析同樣具有重要的意義。連鎖不平衡分析顯示，篩選的5個(gè)候選tag SNP 位點(diǎn)之間存在連鎖不平衡。單體型分析結(jié)果顯示，常見單體型CGCTC 在兩組間的頻率有顯著差異（P＜0.05），OR=2.849（95% CI：1.400～5.798）表明CGCTC 可能為CHD 的危險(xiǎn)因素；單體型CGCTG 也與CHD 顯著相關(guān)（P＜0.05），OR=0.702（95% CI：0.506～0.974）表明CGCTG 可能為CHD 的保護(hù)因素。單體型CGCTG 這幾個(gè)基因型均為FFAR4基因的野生基因型，提示FFAR4基因突變后可能導(dǎo)致CHD 的發(fā)病，且單體型CGCTG 中易感等位基因G 突變?yōu)榈任换駽 后，單體型CGCTC 即變成了CHD 的危險(xiǎn)因素，再次表明FFAR4基因中攜帶等位基因C 可能是藏族CHD 的致病因素，F(xiàn)FAR4可能為藏族CHD的易感基因。

明確CHD 的遺傳病因?qū)膊〉念A(yù)防和預(yù)后非常重要，早發(fā)現(xiàn)、早診斷是治療CHD的關(guān)鍵。FFAR4基因多態(tài)性與CHD 的研究之前并未開展，本課題首次選擇人類FFAR4基因多態(tài)性與高原藏族CHD 的關(guān)系研究進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果提示FFAR4有可能是CHD的易感基因。不過(guò)本研究樣本量有限，存在一定局限性，有待進(jìn)一步進(jìn)行深入研究。