何婷婷， 張旭琳▲， 賈珍麗， 王 昀， 馬克濤，2， 李 玲， 張 亮，2△

（1石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)系，新疆石河子 832000；2國(guó)家衛(wèi)生健康委中亞高發(fā)病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子 832000；3石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，新疆石河子 832000）

動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）作為一種炎癥性血管疾病，其發(fā)病過(guò)程中伴隨的血管內(nèi)皮炎癥是導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷，并誘發(fā)AS 發(fā)生發(fā)展的首要環(huán)節(jié)［1-2］。近年研究表明血管內(nèi)皮細(xì)胞的炎性死亡——細(xì)胞焦亡在AS發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用［3-7］。

細(xì)胞焦亡是一種由炎癥應(yīng)答引起的新型程序性細(xì)胞死亡［5-9］，其發(fā)生的關(guān)鍵分子途徑為核苷酸結(jié)合寡聚結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）/caspase-1 介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡信號(hào)通路［10］。已有研究表明，高脂飲食及其他AS 致病危險(xiǎn)因素可引起血管內(nèi)皮細(xì)胞中NLRP3 的激活［3-6，10-15］，NLRP3 可與含caspase 募集結(jié)構(gòu)域的凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（apoptosisassociated speck-like protein containing a caspase recruitment domain，ASC）結(jié)合，進(jìn)而募集并激活細(xì)胞焦亡發(fā)生關(guān)鍵蛋白caspase-1［5，9］，使其形成由p10 和p20 亞單位構(gòu)成的四聚體［7，9］；激活的caspase-1 可裂解活化下游的gasdermin D（GSDMD）及焦亡相關(guān)炎癥介質(zhì)，如白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）和IL-18 前體，裂解激活的GSDMD 蛋白N 端結(jié)構(gòu)域（GSDMD-N）可在細(xì)胞膜表面組裝形成穿膜孔道，最終引發(fā)血管內(nèi)皮細(xì)胞焦亡［5-6］；與此同時(shí)，活化的IL-1β和IL-18還可通過(guò)GSDMD-N穿膜孔道釋放而加重血管炎癥反應(yīng)，并最終導(dǎo)致動(dòng)脈結(jié)構(gòu)功能受損及AS的發(fā)生發(fā)展［4，6，9］。已有研究表明，藥物阻斷或基因敲除上述細(xì)胞焦亡信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白可有效抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞焦亡及AS 的發(fā)生發(fā)展［4，6，11-12，14，16］。因此，以細(xì)胞焦亡及其信號(hào)通路作為重要干預(yù)靶點(diǎn)可為治療AS提供新的思路。

內(nèi)源性硫化氫（hydrogen sulfide，H2S）作為一種具有“多面手”角色的重要?dú)怏w信號(hào)分子，研究者對(duì)其在心血管疾病中的治療保護(hù)作用均已達(dá)成共識(shí)。雖然H2S對(duì)AS的防治作用及機(jī)制研究已積累了不少實(shí)驗(yàn)證據(jù)，但目前關(guān)于H2S 對(duì)AS 發(fā)生發(fā)展過(guò)程中血管內(nèi)皮細(xì)胞焦亡的調(diào)控作用及其機(jī)制尚不清楚。因此，本研究采用AS 致病關(guān)鍵因素——氧化型低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein，oxLDL）刺激人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs），構(gòu)建血管內(nèi)皮細(xì)胞焦亡模型，旨在探討緩釋型H2S 供體GYY4137 對(duì)oxLDL 誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞焦亡的抑制作用及其調(diào)控機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 細(xì)胞 HUVECs 購(gòu)自American Type Culture Collection（ATCC）。

1.2 藥物和試劑 內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)液和胎牛血清購(gòu)自Sciencell；oxLDL 購(gòu)自廣州奕源生物科技有限公司；H2S 供體GYY4137 購(gòu)自Sigma-Aldrich；CCK-8細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒購(gòu)自東仁化學(xué)科技（上海）有限公司；Hoechst 33342/碘化丙啶（propidium iodide，PI）雙染試劑盒和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；細(xì)胞蛋白抽提試劑盒和脫脂奶粉均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；NLRP3 兔多克隆抗體、procaspase-1 兔單克隆抗體、caspase-1（p20 亞單位）兔多克隆抗體、GSDMD 兔單克隆抗體和GSDMD-N 兔單克隆抗體購(gòu)自Abcam；IL-18 兔單克隆抗體購(gòu)自武漢三鷹公司；GAPDH 鼠單克隆抗體和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的II抗（HRP山羊抗兔或HRP山羊抗小鼠）均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Western blot 化學(xué)發(fā)光底物試劑盒購(gòu)自Millipore。

1.3 主要儀器 CO2培養(yǎng)箱和自動(dòng)酶標(biāo)儀（Thermo Fisher Scientific）；高速低溫冷凍離心機(jī)（Eppendorf）；倒置熒光顯微鏡（SANYO）；電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀（北京六一生物科技有限公司）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將凍存復(fù)蘇的HUVECs以2×106L-1接種于25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，使用內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)液（含5%胎牛血清、1%雙抗和1%內(nèi)皮生長(zhǎng)因子）在細(xì)胞培養(yǎng)箱（37 ℃、5% CO2及飽和濕度）中培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)速度，每隔2～3 d更換細(xì)胞培養(yǎng)液并傳代，取2～4代處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVECs進(jìn)行內(nèi)皮細(xì)胞鑒定（內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)記CD31 陽(yáng)性率≥95%）及后續(xù)研究，根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)?zāi)康模{(diào)整接種時(shí)的細(xì)胞密度為（1～5）×109L-1。

2.2 藥物干預(yù)與分組

2.2.1 藥物干預(yù)濃度篩選 藥物干預(yù)之前將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（匯合率為80%～90%）的HUVECs 接種于含5%胎牛血清培養(yǎng)液的96 孔培養(yǎng)板（接種密度為每孔8×103細(xì)胞）中貼壁4 h，之后更換為無(wú)血清培養(yǎng)液饑餓培養(yǎng)12 h，最后使用不同藥物對(duì)其進(jìn)行處理。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［3，17-18］，采用不同濃度的oxLDL（0、25、50 和100 mg/L）和GYY4137（50、100 和200 μmol/L），以及指定藥物組合［GYY4137（100 和200 μmol/L）預(yù)處理4 h，再加入終濃度為100 mg/L 的oxLDL 繼續(xù)培養(yǎng)24 h］，于含1%血清的完全培養(yǎng)液中處理HUVECs 24 h，采用CCK-8 法（參見2.3）檢測(cè)不同濃度的oxLDL 和GYY4137 對(duì)HUVECs 活力的影響，從中篩選出oxLDL 與GYY4137 的最佳干預(yù)濃度；并通過(guò)LDH 釋放（參見2.4）、Hoechst 33342/PI染色（參見2.5）和Western blot（參見2.7）檢測(cè)不同濃度oxLDL對(duì)HUVECs 細(xì)胞焦亡及其信號(hào)通路標(biāo)志蛋白表達(dá)的影響。

2.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 藥物干預(yù)之前將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（匯合率為80%～90%）的HUVECs 接種于含血清培養(yǎng)液的6孔培養(yǎng)板（接種密度為每孔1×106細(xì)胞）中貼壁4 h，之后更換為無(wú)血清培養(yǎng)液饑餓培養(yǎng)12 h，最后使用不同藥物對(duì)其進(jìn)行處理，并分為以下4 組：（1）空白對(duì)照（control）組：以含1%血清的完全培養(yǎng)液培養(yǎng)HUVECs 24 h；（2）GYY4137 干預(yù)組：200 μmol/L GYY4137 處理HUVECs 24 h；（3）oxLDL 處理組：終濃度25、50 和100 mg/L 的oxLDL 處理HUVECs 24 h；（4）oxLDL+GYY4137 干預(yù)組：200 μmol/L GYY4137 預(yù)處理HUVECs 4 h，再加入終濃度為100 mg/L的oxLDL處理細(xì)胞24 h。

2.3 細(xì)胞活力檢測(cè) 待HUVECs 匯合度為80%～90%時(shí)，用0.05%胰蛋白酶消化收集HUVECs，并將細(xì)胞接種于96 孔板，用含血清培養(yǎng)液于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，待細(xì)胞貼壁后更換為無(wú)血清培養(yǎng)液饑餓培養(yǎng)12 h。之后加入上述不同藥物干預(yù)24 h。干預(yù)后棄去原培養(yǎng)液并用PBS 漂洗，之后向每孔加入含10%CCK-8 試劑的培養(yǎng)液100 μL，另設(shè)空白孔（不含細(xì)胞，只含10%CCK-8的培養(yǎng)液）。在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育2 h后，使用酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的吸光度（absorbance，A）。實(shí)驗(yàn)每組設(shè)置6 個(gè)復(fù)孔，重復(fù)5次。細(xì)胞相對(duì)活力（%）=（樣品平均A值-空白孔平均A值）/（空白對(duì)照組平均A值-空白孔平均A值）×100%。

2.4 LDH 釋放率檢測(cè) 各組細(xì)胞接種于96 孔板中，經(jīng)不同藥物干預(yù)處理24 h后，首先將各組細(xì)胞培養(yǎng)液上清（25 μL）收集于96孔板中，之后向無(wú)血清培養(yǎng)液對(duì)照及含有25 μL 培養(yǎng)液上清的96 孔板中加入25 μL 反應(yīng)底物，并于37 ℃條件下孵育15 min，之后再向上述反應(yīng)樣品中加入25 μL 2，4-二硝基苯肼，并于37 ℃條件下孵育15 min 進(jìn)行顯色反應(yīng)，最后向反應(yīng)樣品中加入250 μL 反應(yīng)終止液于室溫下孵育5 min 終止反應(yīng)，最后于490 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定A值，根據(jù)公式LDH 釋放率（%）=（處理樣品吸光度-對(duì)照樣品吸光度）/（細(xì)胞最大酶活性的吸光度-對(duì)照樣品吸光度）×100%，計(jì)算出各組細(xì)胞培養(yǎng)液上清中的LDH 含量。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

2.5 Hoechst 33342/PI 染色 上述各組細(xì)胞經(jīng)不同藥物干預(yù)處理24 h 后，向含有細(xì)胞的6 孔板中加入10 μL Hoechst 33342（5 mg/L）染液于37 ℃條件下避光孵育10 min，之后再向細(xì)胞中加入5 μL PI（2 mg/L）染液于37 ℃條件下避光孵育15 min，PBS 溶液漂洗2 次后使用倒置熒光顯微鏡觀察拍照，隨機(jī)選取3個(gè)不同視野，計(jì)算每個(gè)視野中的細(xì)胞總數(shù)及紅色熒光細(xì)胞數(shù)，參照文獻(xiàn)［19］，計(jì)算PI＋細(xì)胞比例（%）=紅色熒光細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.6 H2S含量測(cè)定 各組細(xì)胞經(jīng)不同指定濃度藥物干預(yù)處理24 h 后，胰酶消化收集各組細(xì)胞并向其中加入500 μL預(yù)冷的磷酸緩沖液（50 mmol/L，pH 6.8）裂解勻漿，并測(cè)定各組細(xì)胞裂解液中的總蛋白濃度；向含有430 μL 細(xì)胞裂解液的離心管中加入含有2 mmol/L 磷酸吡哆醛和10 mmol/L L-半胱氨酸的磷酸緩沖液（pH 7.4），封口膜密封離心管后將其置于37 ℃水浴鍋中孵育30 min；然后使用注射器通過(guò)離心管管蓋向上述密封離心管中注入250 μL 1%醋酸鋅，混勻后繼續(xù)將上述反應(yīng)混合物置于37 ℃水浴鍋中孵育90 min；隨后向離心管中依次加入250 μL 三氯乙酸（0.1 g/mL）、133 μLN，N-二甲基對(duì)苯二胺（20 mmol/L）和133 μL三氯化鐵（30 mmol/L），充分混勻后于4 ℃、12 000×g條件下離心10 min；隨后吸取200 μL 各組上清及標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)液（NaHS，0～250 μmol/L）加入96 孔酶標(biāo)板中，使用酶標(biāo)儀于670 nm波長(zhǎng)測(cè)定各待測(cè)樣品及標(biāo)準(zhǔn)品的A值。最后根據(jù)蛋白濃度計(jì)算各組細(xì)胞中的H2S 含量（單位：nmol/106cells）。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.7 Western blot 實(shí)驗(yàn) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVECs接種于6孔板（每孔1×106細(xì)胞）后使用不同藥物對(duì)其進(jìn)行處理24 h。收集各組細(xì)胞，按照試劑盒操作說(shuō)明提取細(xì)胞總蛋白，測(cè)定蛋白濃度后，置于-80 ℃保存?zhèn)溆?。?0 μg 蛋白等量上樣，在8%或12%SDSPAGE 中恒壓分離。之后采用濕轉(zhuǎn)法將總蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，并將PVDF 膜置于5%脫脂奶粉溶液中于室溫下封閉1～2 h；在室溫下用1×TBST 緩沖液漂洗封閉后的PVDF 膜，并將其放入含有抗NLRP3、抗pro-caspase-1、抗caspase-1、抗GSDMD、抗GSDMDN、抗IL-18 和抗GAPDH 抗體（1∶1 000）溶液中，于4 ℃條件下孵育過(guò)夜；用TBST 緩沖液將膜上的多余Ⅰ抗漂洗干凈后，將其放入Ⅱ抗溶液（1∶10 000）中室溫孵育1～2 h。洗膜，顯色，曝光壓片，觀察結(jié)果并進(jìn)行分析。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 6 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和柱狀圖繪制。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析（oneway ANOVA）及LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 GYY4137 抑制oxLDL 誘導(dǎo)的HUVECs 活力降低

為篩選并優(yōu)化所使用藥物的最佳濃度，我們首先評(píng)估了oxLDL 或（和）H2S 緩釋型供體GYY4137 對(duì)HUVECs 活力的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，與空白對(duì)照組相比，低濃度（25 mg/L）的oxLDL及中、高濃度（50 和100 μmol/L）的GYY4137 對(duì)HUVECs 活力無(wú)顯著影響（P＞0.05），50 mg/L 和100 mg/L oxLDL 可使HUVECs 活力顯著降低（P＜0.05 或P＜0.01），見圖1A；而200 μmol/L GYY4137 則可使HUVECs 活力顯著增加（P＜0.05），見圖1B；此外，與oxLDL 處理組相比，200 μmol/L 的GYY4137 還可使oxLDL 處理的HUVECs活力顯著升高（P＜0.05），見圖1C。

Figure 1. The effect of different concentrations of oxLDL or/and GYY4137 on the viability of HUVECs. A：the HUVECs were treated with different concentrations of oxLDL for 24 h；B：the HUVECs were treated with different concentrations of GYY4137 for 24 h；C：the HUVECs were pretreated with GYY4137（100 and 200 μmol/L）for 4 h，and then incubated with oxLDL（100 mg/L）for 24 h. Mean±SD.n=5.*P＜0.05，**P＜0.01vs control group；#P＜0.05vs oxLDL group.圖1 不同濃度oxLDL和GYY4137對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞活力的影響

2 oxLDL誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞焦亡模型的建立

為進(jìn)一步證實(shí)oxLDL 對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞焦亡的促進(jìn)作用，本研究檢測(cè)了不同濃度oxLDL 對(duì)HUVECs焦亡及焦亡標(biāo)志蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，低濃度（25 mg/L）oxLDL 對(duì)HUVECs中PI+染色比例和LDH 釋放率均無(wú)顯著影響（P＞0.05），而50 mg/L和100 mg/L的oxLDL可使HUVECs的PI+染色比例及LDH 釋放率顯著升高（P＜0.05 或P＜0.01），見圖2；此外，與空白對(duì)照組相比，50 mg/L和100 mg/L 的oxLDL 可顯著上調(diào)HUVECs 中細(xì)胞焦亡標(biāo)志蛋白NLRP3、caspase-1（具有活性的p20 亞單位）、GSDMD、GSDMD-N 及IL-18 蛋白水平（P＜0.05或P＜0.01），但oxLDL 對(duì)pro-caspase-1 的表達(dá)較空白對(duì)照組則無(wú)顯著影響（P＞0.05），見圖3。

Figure 2. The effect of different concentrations of oxLDL on pro-inflammatory programmed death of HUVECs. A：representative double staining of Hoechst 33342（blue）and PI（red）in HUVECs（scale bar=100 μm）and the percentage of the PI positive cells to total cells；B：LDH release rate in the media. Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01vs control group.圖2 不同濃度的oxLDL對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞焦亡的影響

Figure 3. The effect of different concentrations of oxLDL on the expression of pyroptosis-related proteins in HUVECs. The protein levels of NLRP3，pro-caspase-1，caspase-1，GSDMD，GSDMD-N and IL-18 in HUVECs were detected by Western blot.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01vs control group.圖3 不同濃度oxLDL對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 GYY4137 抑制oxLDL 誘導(dǎo)的HUVECs 焦亡及焦亡標(biāo)志蛋白的表達(dá)

我們選取100 mg/L 的oxLDL 和200 μmol/L 的GYY4137 單獨(dú)或聯(lián)合干預(yù)HUVECs，并檢測(cè)了各組細(xì)胞中的H2S 水平、LDH 釋放率、PI+染色細(xì)胞比例及焦亡標(biāo)志蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，oxLDL 可顯著抑制HUVECs 中H2S 的合成（P＜0.05），并上調(diào)細(xì)胞LDH 釋放率（P＜0.05）、PI+染色的細(xì)胞比例（P＜0.05），以及焦亡信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白NLRP3、caspase-1（p20）、GSDMD、GSDMD-N 及IL-18的表達(dá)（P＜0.05）；而與oxLDL 組相比，GYY4137 和oxLDL 聯(lián)合干預(yù)則可顯著提高HUVECs 中的H2S 含量（P＜0.05），并使PI+染色細(xì)胞比例和LDH 釋放率顯著下降（P＜0.05），且GYY4137 還可顯著抑制oxLDL誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡關(guān)鍵蛋白NLRP3、caspase-1（p20）、GSDMD、GSDMD-N 及IL-18 的表達(dá)上調(diào)（P＜0.05），見圖4～6。

Figure 4. The effect of GYY4137 on the concentration of H2S in oxLDL-treated HUVECs. Mean±SD.n=4.*P＜0.05vs control group；#P＜0.05vs oxLDL group.圖4 GYY4137 對(duì)oxLDL 處理的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中硫化氫含量的影響

Figure 5. The effect of GYY4137 on oxLDL-induced pro-in fl ammatory programmed death of HUVECs. A：representative double staining of Hoechst 33342（blue）and PI（red）in HUVECs（scale bar=100 μm）and the percentage of the PI positive cells to total cells；B：LDH activity in the media. Mean±SD.n=3.*P＜0.05vs control group；#P＜0.05vs oxLDL group.圖5 GYY4137對(duì)oxLDL誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞焦亡的影響

Figure 6. The effect of GYY4137 on the expressions of pyroptosis-related proteins in oxLDL incubated HUVECs. The protein levels of NLRP3，pro-caspase-1，caspase-1，GSDMD，GSDMD-N and IL-18 in HUVECs were detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P＜0.05vs control group；#P＜0.05vs oxLDL group.圖6 GYY4137對(duì)oxLDL處理的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

討論

血管內(nèi)皮炎癥反應(yīng)及其誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞死亡是AS 發(fā)生發(fā)展的始動(dòng)環(huán)節(jié)［1，20］，而oxLDL 作為導(dǎo)致血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)功能損傷和AS 發(fā)生發(fā)展的重要直接致病因素，其可使血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)［4-6，9］，并會(huì)導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞活力降低及死亡［21］。本研究中采用不同濃度的oxLDL處理HUVECs，同樣觀察到中、高濃度的oxLDL 可使HUVECs 的活力顯著降低，此結(jié)果與相關(guān)研究報(bào)道相一致［3，22-23］。因此，抑制oxLDL 誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮炎癥及其損傷是AS防治的重要治療策略。研究表明oxLDL 引起的血管炎癥可導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞焦亡［3］，其發(fā)生的最終結(jié)果為膜穿孔的形成以及細(xì)胞的滲透性裂解［5-6，9］。而本研究采用鑒定細(xì)胞焦亡發(fā)生的常用檢測(cè)方法——Hoechst33342/PI 染色和LDH 釋放率測(cè)定［1，5，19］初步證實(shí)了oxLDL 可顯著誘導(dǎo)HUVECs 的焦亡。

細(xì)胞焦亡發(fā)生的關(guān)鍵分子機(jī)制是NLRP3炎癥小體和caspase-1 的激活［4］，激活的caspase-1（p10/p20四聚體）可裂解GSDMD 蛋白，使其N 端結(jié)構(gòu)域形成膜穿孔，最終導(dǎo)致細(xì)胞焦亡并向胞外釋放出由caspase-1 裂解激活的IL-1β 和IL-18 等炎癥介質(zhì)而引起更為嚴(yán)重的炎癥應(yīng)答［4-6］。目前體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)研究已充分表明高脂飲食和其他AS 發(fā)病危險(xiǎn)因素如ox-LDL［3，6］、膽固醇結(jié)晶［5，13］、高同型半胱氨酸［9，15］和尼古丁［24］均可上調(diào)并激活NLRP3、caspase-1、IL-18 和GSDMD 而引發(fā)血管內(nèi)皮細(xì)胞的焦亡及AS 的發(fā)生發(fā)展；而藥物阻斷或基因敲除NLRP3或caspase-1則可抑制AS 致病危險(xiǎn)因素誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞焦亡及AS 動(dòng)物模型主動(dòng)脈中AS 斑塊的發(fā)生發(fā)展［4，6，11-12，14，16］。在本研究中，我們也觀察到中、高濃度的oxLDL 可通過(guò)上調(diào)HUVECs 中NLRP3、caspase-1（p20）、GSDMD、GSDMD-N 和促炎細(xì)胞因子IL-18的表達(dá)而激活細(xì)胞焦亡信號(hào)通路。因此，本研究結(jié)果進(jìn)一步表明NLRP3 炎癥小體/caspase-1 信號(hào)通路的激活直接參與了oxLDL 誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞焦亡，并且oxLDL 誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞焦亡對(duì)于探討AS發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵機(jī)制、尋求AS防治策略具有重要意義。

H2S作為一種重要的內(nèi)源性氣體信號(hào)分子，可通過(guò)調(diào)節(jié)不同生物學(xué)過(guò)程發(fā)揮心血管保護(hù)、抗炎、抗AS 及抗高血壓作用［25］，然而，H2S 是否可調(diào)控NLRP3炎癥小體/caspase-1 介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡尚不完全清楚。在本研究中，我們采用H2S 供體GYY4137 深入研究了其對(duì)oxLDL 誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞焦亡和焦亡標(biāo)志蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果顯示oxLDL 可抑制HUVECs中H2S 的合成，并激活細(xì)胞焦亡信號(hào)通路、上調(diào)細(xì)胞焦亡相關(guān)標(biāo)志蛋白的表達(dá)，從而誘導(dǎo)HUVECs 發(fā)生焦亡。而GYY4137 干預(yù)則可通過(guò)提高細(xì)胞內(nèi)H2S 水平而使血管內(nèi)皮細(xì)胞活力顯著升高，并對(duì)oxLDL 誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡具有顯著抑制作用。通過(guò)Western blot進(jìn)一步表明GYY4137可通過(guò)下調(diào)HUVECs中細(xì)胞焦亡信號(hào)通路標(biāo)志蛋白（NLRP3、caspase-1、GSDMD、GSDMD-N和IL-18）的表達(dá)而抑制oxLDL誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡信號(hào)通路的激活及細(xì)胞焦亡。雖然已有研究表明H2S 或其供體藥物可通過(guò)抑制細(xì)胞焦亡信號(hào)通路標(biāo)志蛋白（NLRP3、ASC 和caspase-1）的表達(dá)而發(fā)揮治療急性腎損傷、抗炎、抗AS 及抗高血壓作用［26-29］，但以上研究的目的主要針對(duì)H2S 對(duì)NLRP3 激活的調(diào)控作用，且因缺乏細(xì)胞焦亡相關(guān)指標(biāo)（LDH 釋放率、Hoechst 33342/PI 染色和細(xì)胞焦亡執(zhí)行者GSDMD 蛋白的表達(dá)）檢測(cè)而未能充分闡明H2S對(duì)細(xì)胞焦亡的調(diào)控作用。而本研究結(jié)果不僅顯示出H2S 對(duì)oxLDL 誘導(dǎo)的NLRP3 激活的抑制作用，且還通過(guò)細(xì)胞焦亡相關(guān)指標(biāo)及GSDMD 蛋白的表達(dá)檢測(cè)進(jìn)一步闡明了H2S對(duì)細(xì)胞焦亡的抑制作用及其調(diào)控機(jī)制。

綜上所述，H2S供體GYY4137可通過(guò)下調(diào)NLRP3炎癥小體/caspase-1細(xì)胞焦亡信號(hào)通路而抑制oxLDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞焦亡。