潘彩霞

（中國刑事警察學(xué)院警犬技術(shù)學(xué)院，遼寧沈陽 110000）

犬精液冷凍保存技術(shù)是將經(jīng)過處理的犬精液長期保存在-196℃液氮中。將冷凍精液解凍后，通過人工授精可以實現(xiàn)以一配多、隔世代的育種等目的。為提高冷凍-解凍后的精液品質(zhì)，大量研究圍繞冷凍稀釋液的成分[1-2]、冷凍程序[3]、解凍程序等展開，但對解凍后和使用前孵育階段的研究甚少。精液經(jīng)歷冷凍損傷后比鮮精脆弱很多，不當?shù)姆跤龡l件可能會給解凍后的精液造成進一步損害，降低受精率。Str?m 等[4]將解凍后的精液按1:1添加解凍稀釋液，并在37℃水浴溫度下繼續(xù)孵育直至使用；Pe?a 等[5]按1:4 添加解凍稀釋液，多數(shù)研究未提及解凍后的孵育溫度[6-7]。本研究旨在比較解凍后解凍稀釋液的不同添加比例對精液品質(zhì)的影響，并比較不同溫度下孵育30 min 和2 h 后精液品質(zhì)的差異，進而篩選出最佳的孵育條件。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑 實驗選擇相貌體型好、3～5 歲、有過配種經(jīng)驗的5 條優(yōu)秀德國牧羊犬種公犬，由公安部沈陽警犬基地提供。采精前后保證其正常日糧供應(yīng)及飲水。Tris、檸檬酸、葡萄糖等試劑均為生工生物工程（上海）股份有限公司產(chǎn)品。

1.2 采精及精液品質(zhì)檢測 采用手握按摩法對德國牧羊犬進行精液采集。先用酒精浸泡的濕毛巾擦拭公犬外陰部，手握住公犬外陰進行前后按摩，當公犬陰莖勃起時，采精人員一手抓住龜頭球狀部位，一手拿著漏斗離心管相連的容器收集富含精子段精液。注意采集精液時要避免器具接觸犬龜頭，否則會造成犬應(yīng)激，導(dǎo)致射精停止。采精結(jié)束后，及時將采集的鮮精置37℃水浴鍋中待用。

將鮮精輕輕搖動，取適量用犬精液密度檢測儀測定精液密度。用移液器或玻璃棒取一小滴精液放在經(jīng)37℃恒溫載物臺預(yù)熱過的載玻片上，蓋上載玻片，于400 倍相差顯微鏡下觀察精子活力。鮮精樣本精子密度需達到1.0×108mL，精子活力需達到90%，否則不予采用。

1.3 稀釋液的配制 冷凍稀釋液的配制：Tris 2.4 g，檸檬酸1.4 g，葡萄糖0.8 g，鏈霉素0.1 g，青霉素0.06 g（0.3 mL雙蒸水中），甘油7 mL，卵黃20 mL，用雙蒸水定容至100 mL[8]。

解凍稀釋液的配制：Tris 2.4 g，檸檬酸1.4 g，葡萄糖0.8 g，鏈霉素0.1 g，青霉素0.06 g（0.3 mL 蒸餾水中），用雙蒸水定容至100 mL。

1.4 精液的冷凍與解凍 將檢測合格的鮮精混合，在37℃下700 r/min 離心10 min，去除上層精清，然后加入等溫的冷凍稀釋液，調(diào)整精液密度至1.0×108個/mL。用自動化細管灌裝機將稀釋后的精液灌注到0.5 mL 精液細管中并封口，在4℃冰箱內(nèi)平衡2 h。將平衡好的細管精液置于距液氮面4 cm 處，蓋蓋熏蒸10 min 后，直接投入液氮中。解凍時，將細管精液取出，迅速投入37℃水浴鍋中，輕輕晃動30 s，使精液快速溶解。擦拭干凈細管表面的水分，剪去細管兩端，把精液倒入離心管中，進行精液品質(zhì)檢測。

1.5 解凍稀釋液的添加比例 按精液∶稀釋液為1:0、1:1、1:2 的比例將解凍稀釋液添加到解凍后精液中。均勻緩慢搖晃，混勻后25℃下靜置，30 min 后對各組精子活力、活率、質(zhì)膜完整率、頂體完整率進行測定。

1.6 解凍后精液孵育溫度 按精液:解凍稀釋液1:1 的比例將解凍稀釋液添加到解凍后精液中。均勻緩慢搖晃，混勻后分成4 組，分別置與37、34、25、4℃溫度條件下孵育，30 min 和2 h 后對各組精子活力、活率、質(zhì)膜完整率、頂體完整率進行測定。

1.7 精子活力、活率測定 精子活率指活動精子占精子總數(shù)的比例。精子活力為向前運動精子占精子總數(shù)的比例。用移液器或玻璃棒取10 μL 精液放在經(jīng)37℃恒溫載物臺預(yù)熱過的載玻片上，蓋上載玻片，于400 倍相差顯微鏡下觀察。相差顯微鏡配備北昂醫(yī)學(xué)圖像軟件（BEION V4.20），對精子活力、活率進行分析計算。每塊載玻片觀察至少3個視野，精子數(shù)量至少達到300個。

1.8 精子質(zhì)膜完整率測定 精子質(zhì)膜完整性的測定采用低滲腫脹試驗方法（Hypoosmotic Swelling Test，HOST）[9]。取50 μL 精液于1 mL150 mOsm/kg 的低滲溶液（7.35 g 檸檬酸鈉，13.51 g 果糖溶于1 L 去蒸餾水）中，置于37℃水浴鍋中孵育1 h。后取15 μL 上述混合溶液于載玻片上，400 倍下顯微鏡觀察。每塊載玻片觀察至少3 個視野，精子數(shù)量至少達到300 個。精子的尾部彎曲表示精子質(zhì)膜的完整，如圖1 所示。記錄下觀察到的總精子及彎尾精子數(shù)量，精子彎尾率即精子質(zhì)膜完整率為彎尾精子數(shù)占總精子數(shù)的比例。

圖1 在低滲液中質(zhì)膜完整的精子示意圖

1.9 精子頂體完整率測定 采用吉姆薩染色法進行染色。取1 滴精液滴于載玻片一端，用邊緣光滑的載玻片呈35°角接觸液滴，拉向另一側(cè)，制成抹片。風(fēng)干后，福爾馬林固定15 min，水洗，風(fēng)干，2 h 后顯微鏡下（400×）檢測，計數(shù)200 個精子，計算出頂體完整精子數(shù)占總精子數(shù)的比例，頂體完整精子如圖2 所示。1.10 統(tǒng)計分析 采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件，利用獨立樣本t檢驗和單因素方差分析對統(tǒng)計數(shù)據(jù)進行分析，結(jié)果采用平均值±標準誤表示，P＜0.05 時差異顯著。

圖2 吉姆薩染色法染色后頂體完整的精子示意圖

2 結(jié)果

2.1 解凍后稀釋液添加比例對精液品質(zhì)影響 表1 結(jié)果顯示，解凍后立即進行精液品質(zhì)檢測，精子活率為47.5%，活力為31.3%，質(zhì)膜完整率為54.2%，頂體完整率為56.5%。解凍后25℃孵育30 min，3 組精子活率、活率、質(zhì)膜完整率、頂體完整率都有所下降，但組間差異不顯著。

表1 解凍稀釋液對精液品質(zhì)的影響 %

2.2 解凍后孵育溫度對精液品質(zhì)的影響 表2結(jié)果顯示，解凍后，在不同溫度下孵育30 min，4 組的活率和質(zhì)膜完整率均無顯著差異，而在4℃孵育溫度下的精子活力和頂體完整率高于37℃（P＜0.05）。解凍后孵育2 h，4℃孵育溫度下的精子活率、精子活力、質(zhì)膜完整率、頂體完整率均為最佳（P＜0.05）；34℃和25℃組差異不顯著，37℃組的精液品質(zhì)最差。

表2 孵育溫度對解凍后精液品質(zhì)的影響 %

3 討論

為防止精子在冷凍過程中受到損傷，在冷凍前一般會添加含有冷凍保護劑的冷凍稀釋液。如本研究所用的甘油、卵黃都是常用的冷凍保護劑。冷凍保護劑對保護精子免受冷凍損傷至關(guān)重要，但冷凍保護劑的毒性和引起的滲透壓改變也會對精子造成損害[10-11]。因此在解凍后嘗試添加解凍稀釋液來降低解凍后精液中CPA 濃度，并增大精液量，便于人工授精。但本研究結(jié)果顯示，解凍后的精液中添加解凍稀釋液并未改善精液品質(zhì)，3 個試驗組的精子活力、活率、質(zhì)膜完整率及頂體完整率均無顯著差異，這與Silva 等[12]的結(jié)果相似，其結(jié)果顯示解凍后按1:4 的稀釋組與不稀釋組差異不顯著。但與Pe?a 等[5]的結(jié)果有異，其實驗表明按1:4 的比例添加解凍稀釋液能有效延長解凍后精子壽命。這種差異可能與冷凍前所使用的冷凍稀釋液的成分不同有關(guān)。Pe?a 等[5]使用的冷凍稀釋液中添加了Equex（Nova Chemical Sale Inc.，Sicuate，MA，USA）成分，而Rota 等[13]研究表明Equex 有延長精子壽命的作用?？傊?，本研究結(jié)果表明，解凍后的精液中添加解凍稀釋液對精液品質(zhì)沒有改善作用，但也無損害作用，因此是否添加稀釋液可以根據(jù)實際需要進行選擇。

本實驗所用的是僅添加了甘油和卵黃2 種冷凍保護劑的Tris-卵黃稀釋液，解凍初期的精子活率為47.5%，活力為31.3 %，與Martins 等[14]用Tris-卵黃稀釋液冷凍解凍后的精子活率和活力相似。本研究結(jié)果顯示，解凍后精液在4℃下孵育效果最佳，其次為25℃和34℃下，而37℃下效果最差，37℃下孵育2 h 后活力僅為5.8%，與4℃組（21.6%）差異顯著。這可能是因為較高的孵育溫度會加快精子代謝，使精子的能量提前耗盡，而較低的孵育溫度有效降低了精子的代謝活動，延長了精子壽命。這與鮮精的保存原理相似，雖然37℃為鮮精孵育的最適溫度，但該溫度下鮮精只能存活幾小時，為延長鮮精壽命需降低保存溫度，4℃下鮮精能存活幾天[15]。除此之外，犬精液在冷凍過程中抗氧化機能失衡，精液中已有過量活性氧（ROS）[16]，解凍后37℃孵育情況下精液代謝旺盛，進一步增加ROS 含量，加速精子死亡。

綜上表明，解凍后精液中添加解凍稀釋液對精液品質(zhì)無影響，但解凍后的孵育溫度不宜過高，置于4℃環(huán)境下待用最佳。