劉阿英，張全兵*，周 云，王 華，王 鋒，黃鵬鵬，楊 帆，王婷婷

在骨科和康復科臨床工作中，膝關節(jié)伸直型攣縮是一種常見的關節(jié)攣縮類型。限制關節(jié)活動的解剖學因素可以分為肌源性因素(肌肉、肌腱和筋膜等)和關節(jié)源性因素(骨、軟骨、關節(jié)囊和韌帶等)，分別導致了肌源性和關節(jié)源性攣縮。本課題組通過對家兔研究發(fā)現(xiàn)，肌源性攣縮至固定4周基本達到穩(wěn)定狀態(tài)，關節(jié)源性攣縮在固定4周后進一步發(fā)展。低頻電刺激(low frequency electrical stimulation，LFES)作為一種安全有效的物理因子治療手段，在一定條件下具有增加肌纖維的收縮功能,改善骨骼肌萎縮的作用，但它改善關節(jié)周圍組織纖維化的作用尚無人探討。該研究觀察LFES對兔早期伸直型膝關節(jié)攣縮的治療作用，并探討其對骨骼肌和關節(jié)囊纖維化的影響。

1 材料與方法

1.1 動物

24只3～4月大的骨骼發(fā)育成熟的雄性新西蘭白兔，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，購自安徽醫(yī)科大學實驗動物中心。將家兔單獨飼養(yǎng)在60 cm×50 cm×40 cm的籠子中，環(huán)境溫度為24 ℃，光暗循環(huán)12 h，允許兔子在籠中自由活動，自由獲取水和食物。實驗開始前采用標準的家兔飲食將所有的兔子進行適應性飼養(yǎng)兩周。本實驗方案經(jīng)安徽醫(yī)科大學動物倫理委員會批準(倫理編號：LLSC20190761)。

1.2 實驗材料

電子針灸治療儀(型號：SDZ-Ⅳ型)購自蘇州華佗針灸器械總廠。家兔膝關節(jié)活動范圍(range of motion, ROM)的測量采用本課題組設計的具有實用新型專利的關節(jié)活動度測量儀(ZL201720251124.6)。BCA蛋白檢測試劑盒(貨號：P0010)購自上海碧云天生物技術有限公司；檢測α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)(貨號：bsm-33287M-HRP)和轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)(貨號：bsm-33187M-HRP)蛋白表達量的一抗購自北京博奧森生物技術有限公司。GAPDH(貨號：F2612)抗體購自美國Santa Cruz生物技術公司?；瘜W發(fā)光(ECL)檢測試劑盒(貨號：32109)購自美國Thermo Scientific公司。HE染色試劑盒(貨號：G1120)購自北京博奧森生物技術有限公司，Masson染色試劑盒(貨號：G1340)購自北京索萊寶科技有限公司；尼康倒置顯微鏡(型號：TE2000-U)購自日本東京Nikon公司，Image-Pro Plus 6.0軟件購自美國銀泉市馬里蘭州Media Cybernetics股份有限公司。

1.3 分組及干預措施

將24只家兔隨機分為對照(C)組、單純電刺激(E)組、自然恢復(NR)組和電刺激治療(EST)組，每組6只。C組允許家兔自由活動7周；E組家兔先自由活動4周，隨后進行3周每天20 min頻率為10 Hz、電流強度為5 mA的LFES治療；NR組家兔左膝關節(jié)管型石膏固定4周后建立兔膝關節(jié)伸直攣縮模型，隨后拆除石膏，自然恢復3周；EST組采用同樣的方法將家兔左膝關節(jié)用管型石膏固定4周，隨后拆除石膏進行3周每天20 min頻率為10 Hz、電流強度為5 mA的LFES治療。電子針灸儀的工作方式為斷續(xù)波，脈沖持續(xù)時間15 s，暫停時間5 s。電刺激的干預部位為兔左后肢股四頭肌。首先，將左后肢的毛發(fā)剃除，然后將2片3 cm×3 cm的電極貼在左后肢膝關節(jié)前上方的皮膚上。兩電極片之間的距離為0.5 cm。

1.4 組織準備和關節(jié)活動度測量

耳緣靜脈注射過量3%的戊巴比妥鈉將各組家兔安樂死后，將兔左后肢于左髖關節(jié)處離斷，并切斷髖關節(jié)處大腿肌群的起始點，完全分離左下肢。使用本課題組前期研究設計的關節(jié)活動度測量儀測量各組家兔左膝關節(jié)在肌切開前后的活動范圍(range of motion，ROM)。將股骨近端、脛骨近端和脛骨遠端用金屬鉗固定在表盤上。所有的膝關節(jié)在施加力量前均從0 °屈曲位開始。在之前的實驗中，通過測量正常家兔的ROM，發(fā)現(xiàn)扭矩為0.077 N.m可使家兔膝關節(jié)屈曲140 °左右。在此之后，即使繼續(xù)增加扭矩，膝關節(jié)彎曲角度也很難增加。因此，以0.077 N.m為標準扭矩測量膝關節(jié)ROM, ROM測量由3名檢查人員進行，每個人重復測量2次。測量結果對彼此保密，每只家兔的左膝關節(jié)活動度用重復測量結果的平均值表示。隨后，分離股直肌并從中間切取2個肌肉組織樣品，大小約為1 cm×1 cm×0.5 cm，一份樣品用于組織學染色，另一個樣品保存在-80 ℃的冰箱中用于骨骼肌纖維化蛋白的檢測。最后，剔除膝關節(jié)周圍的骨骼肌，再次測量兔膝關節(jié)ROM。分離兔膝關節(jié)的關節(jié)囊保存在-80 ℃的冰箱中用于關節(jié)囊纖維化蛋白的檢測。肌切開前，實驗組膝關節(jié)屈曲ROM較正常對照組的減少值稱為總攣縮，肌切開術后屈曲ROM較對照組肌切開后ROM的減少值稱為關節(jié)源性攣縮。肌源性攣縮為總攣縮和關節(jié)源性攣縮的差值。

1.5 組織學檢測

兔股直肌先用4%多聚甲醛(paraformaldehyde，PFA)固定，隨后包埋在石蠟中。取包埋股直肌的蠟塊，于肌肉中間部分垂直于肌纖維方向切片，切片層厚10 μm，每個股直肌標本取8張切片，隨后各取4張切片分別按HE染色和Masson染色試劑盒說明書上的操作步驟進行染色。使用尼康倒置顯微鏡(型號：TE2000-U)于200倍下對切片進行觀察拍攝，每張切片在200倍下隨機拍攝4個視野，使用Image-Pro Plus 6.0軟件測量各組兔股直肌橫截面中膠原沉積百分比。

1.6 Western blot

在裂解緩沖液中將兔股直肌(70～80 mg)進行勻漿、離心，取上清液進行BCA蛋白定量。用12.5%SDS-PAGE電泳凝膠分離總的溶解產(chǎn)物(每孔8～20 μg)，然后將凝膠中分離的目的蛋白轉移到PVDF膜上。用5%的脫脂牛奶(溶解于由Tris和Tween-20配制的TBST緩沖液)室溫孵育90 min后，將膜分別用TGF-β1(1 ∶10 000)、α-SMA(1 ∶10 000)或GAPDH(1 ∶50 000)一抗孵育1～2 h。隨后用TBST每8 min洗1遍，共3遍。再用辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠IgG二抗(bs-0296G，1 ∶10 000，bioss)孵育90 min。最后，再用TBST將膜洗滌3遍。將ECL化學發(fā)光液滴加到目的條帶的位置，用數(shù)字成像設備檢測該信號。Western blot結果重復3遍。用Image J軟件對各個條帶灰度值進行半定量分析。將目的條帶與各組間內(nèi)參條帶(GAPDH)的灰度值的比值進行比較，最終確定Western blot結果差異是否有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 關節(jié)活動度測量儀檢測肌肉切開前后兔左膝關節(jié)ROM

如表1所示，經(jīng)過4周石膏固定，解除固定自然恢復3周，C組、E組、NR組和EST組總的關節(jié)攣縮角度相比差異有統(tǒng)計學意義(

F

=52.780，

P

<0.05);4組肌源性攣縮角度相比差異有統(tǒng)計學意義(

F

=69.061，

P

<0.05)；4組關節(jié)源性攣縮角度相比差異有統(tǒng)計學意義(

F

=45.889，

P

<0.05)。其中，NR組的總攣縮、肌源性攣縮和關節(jié)源性攣縮相對于C組和E組均有所增加(

P

<0.01)；經(jīng)過4周石膏固定和3周LFES治療后，EST組的總攣縮、肌源性攣縮和關節(jié)源性攣縮相對于C組和E組均增加(

P

<0.01)；與NR組相比，EST組的總攣縮和肌源性攣縮減輕(

P

<0.01)，關節(jié)源性攣縮未見改善。

表1 4組新西蘭白兔攣縮角度測量比較

2.2 各組骨骼肌纖維間間質(zhì)表達和膠原沉積情況

與C組相比，HE染色結果提示，NR組和EST組中均出現(xiàn)了不同程度的間質(zhì)增多，間質(zhì)中可見細胞核呈梭形的成纖維細胞，其中NR組較EST組增多的較為明顯。Masson染色結果進一步表明，經(jīng)過4周固定處理的家兔骨骼肌樣品中，即使經(jīng)過3周的自然恢復或電刺激治療，骨骼肌纖維間仍存在不同程度的膠原纖維沉積。但NR組和EST組相比，EST組的膠原纖維沉積更少。骨骼肌Masson染色的定量分析結果顯示，4組骨骼肌膠原沉積水平相比差異有統(tǒng)計學意義(

F

=66.436，

P

<0.05)(圖1)，與C組相比，NR組和EST組的股直肌中纖維化面積增高(

P

<0.01)，但EST組的骨骼肌纖維化面積低于NR組(

P

<0.01)。

圖1 組織學檢測結果比較 × 200與C組比較：**P<0.01；與E組比較：##P<0.01；與NR組比較：&&P<0.01

2.3 各組股直肌中TGF-β1 和α-SMA的蛋白表達

4組股直肌中TGF-β1、α-SMA蛋白的相對表達量差異有統(tǒng)計學意義(

F

=13.985，

P

<0.05；

F

=15.030，

P

<0.05)。如圖2所示，與C組比較,E組的股直肌中TGF-β1和α-SMA蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義；與C組比較，NR組的TGF-β1和α-SMA的蛋白表達升高(

P

<0.05)；與C組相比，EST組的TGF-β1蛋白表達升高(

P

<0.01)，α-SMA蛋白表達也相應升高(

P

<0.05)；與E組比較，NR組的TGF-β1 蛋白表達升高(

P

<0.05)，α-SMA蛋白表達升高(

P

<0.05)；EST組和E組相比，TGF-β1的蛋白表達未見差異，α-SMA蛋白表達升高(

P

<0.05)；與NR組比較，EST組的TGF-β1和α-SMA蛋白表達降低(

P

<0.05)。

圖2 各組股直肌纖維化蛋白檢測與C組比較：*P<0.05, **P<0.01；與E組比較：#P<0.05；與NR組比較：&P<0.05

2.4 各組關節(jié)囊中TGF-β1 和α-SMA的蛋白表達

4組關節(jié)囊中TGF-β1蛋白的相對表達量差異有統(tǒng)計學意義(

F

=33.580，

P

<0.05)，4組關節(jié)囊中α-SMA蛋白的相對表達量差異有統(tǒng)計學意義(

F

=17.307，

P

<0.05)。如圖3所示，與C組比較,E組關節(jié)囊中TGF-β1和α-SMA蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義；與C組比較，NR組的TGF-β1和α-SMA蛋白表達升高(

P

<0.01)；與C組比較，EST組的TGF-β1蛋白表達升高(

P

<0.01)，α-SMA蛋白表達也升高(

P

<0.05)；與E組比較，NR組的TGF-β1 蛋白表達升高(

P

<0.01)，α-SMA蛋白表達升高(

P

<0.01)；與E組比較，EST組的TGF-β1蛋白表達升高(

P

<0.01)，α-SMA蛋白表達也升高(

P

<0.05)；與NR組比較，EST組的TGF-β1和α-SMA蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義。

圖3 各組關節(jié)囊纖維化蛋白檢測與C組比較：*P<0.05, **P<0.01；與E組比較：#P<0.05，##P<0.01

3 討論

已有的膝關節(jié)攣縮研究所使用的動物模型大多為屈曲型關節(jié)攣縮模型，屈曲固定使動物膝關節(jié)伸直活動受限，但這不符合膝關節(jié)伸直位固定的臨床實際。為了更接近于臨床，本研究使用管型石膏外固定建立了伸直型兔膝關節(jié)攣縮模型。

既往研究表明，關節(jié)周圍組織纖維化，尤其是骨骼肌和關節(jié)囊的纖維化在關節(jié)攣縮形成過程中發(fā)揮著重要作用，但具體哪種組織纖維化在關節(jié)攣縮形成中作用更為顯著，以及康復干預后對哪種組織纖維化的影響更為明顯，研究比較匱乏。本研究探討了早期LFES對骨骼肌纖維化和關節(jié)囊纖維化的各自影響，以明確LFES是通過抑制骨骼肌纖維化還是關節(jié)囊纖維化來改善關節(jié)攣縮。實驗顯示，膝關節(jié)固定4周后即使經(jīng)過3周的自然恢復或LFES治療，仍存在不同程度的肌源性和關節(jié)源性攣縮。經(jīng)過3周LFES治療后總攣縮和肌源性攣縮角度均減小，關節(jié)源性攣縮角度未見改善。提示早期LFES主要通過減輕肌源性攣縮來改善兔膝關節(jié)攣縮。HE染色結果顯示，經(jīng)過固定處理后NR組和EST組股直肌肌纖維間均出現(xiàn)不同程度的間質(zhì)增多，間質(zhì)中可見細胞核呈梭形的成纖維細胞。Masson染色的結果進一步證實，EST組的股直肌纖維化較NR組明顯減輕，提示早期LFES可能是通過減輕骨骼肌纖維化來改善兔膝關節(jié)攣縮。

TGF-β1與組織纖維化的關系密切。組織在創(chuàng)傷修復的早期階段大量分泌TGF-β1，促進局部間質(zhì)組織的增殖和分化。本課題組前期研究顯示，在關節(jié)攣縮的形成過程中，TGF-β1的表達增高，在關節(jié)攣縮的形成過程中發(fā)揮著重要作用。在復雜的纖維化信號網(wǎng)絡中，TGF-β1/α-SMA通路已被廣泛認為可誘導組織肥厚和纖維化。肌成纖維細胞可在細胞內(nèi)表達α-SMA，α-SMA是細胞的一種骨架蛋白，在創(chuàng)傷后組織的修復過程中，有增加組織張力、促進傷口收縮愈合的作用。α-SMA的高表達可以增加纖維組織的黏著程度，是纖維組織收縮過程中重要的分子學因素。α-SMA可通過細胞膜上的整合素作用于細胞外基質(zhì)，從而影響細胞外基質(zhì)的構成，導致關節(jié)周圍組織的纖維化，促進了關節(jié)攣縮的形成。本研究顯示，經(jīng)過固定處理后NR組和EST組骨骼肌和關節(jié)囊中纖維化蛋白TGF-β1和α-SMA均發(fā)生不同程度的升高，提示TGF-β1/α-SMA通路的激活可能是導致關節(jié)攣縮的分子機制。經(jīng)過3周的LFES處理后，EST組的骨骼肌中TGF-β1和α-SMA的表達量相對于NR組降低，但EST組關節(jié)囊中TGF-β1和α-SMA的蛋白表達量相對于NR組未見差異。提示早期LFES主要是通過降低骨骼肌纖維化水平進而改善關節(jié)攣縮。

本研究存在一定的局限性：首先，本實驗僅進行了TGF-β1/α-SMA纖維化信號通路的研究，沒有做其他相關信號通路的研究。其次，本實驗僅研究了固定早期LFES對膝關節(jié)攣縮角度的影響，膝關節(jié)攣縮形成后期(4周以后)的康復干預對關節(jié)攣縮的長期愈后具有更重要的臨床意義。因此，本課題未來的研究將著重于對關節(jié)源性攣縮的探索，以期找到治療關節(jié)攣縮更為有效的方法。