戴 瓊，張衛(wèi)平，陳 剛，王 鵬，許建明，梅 俏

抗結(jié)核藥物誘導(dǎo)肝臟產(chǎn)生適應(yīng)性反應(yīng)是藥物性肝損傷領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。課題組前期的體外研究發(fā)現(xiàn)未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)中的PERK通路介導(dǎo)了利福平(rifampicin，RFP)誘導(dǎo)的適應(yīng)性反應(yīng)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)分泌型蛋白中腦星型膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)生長因子(mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor，MANF)的表達(dá)也發(fā)生了改變。UPR由PERK、IRE1和ATF6 3條信號通路組成。有研究報(bào)道UPR 3條通路的靶蛋白分子可以調(diào)節(jié)MANF的表達(dá)，過表達(dá)ATF6后MANF表達(dá)增加，XBP1可以增加MANF的表達(dá)。但是MANF對UPR 3條通路是否具有反饋調(diào)節(jié)作用以使UPR維持在合適的強(qiáng)度未見文獻(xiàn)報(bào)道。該研究通過分子生物學(xué)技術(shù)敲低HepG2細(xì)胞的MANF基因，觀察敲低MANF對RFP誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞損傷及UPR相關(guān)基因表達(dá)的影響，探討其細(xì)胞保護(hù)作用的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料

攜帶MANF敲低序列的慢病毒以及空白慢病毒購自和元生物技術(shù)(上海)股份有限公司；DMEM高糖細(xì)胞培養(yǎng)液購自美國Hyclone公司；胰酶消化酶、胎牛血清購自美國Gibco公司；PVDF膜購自Millipore公司；蛋白Marker、ECL顯影液購自Thermo scientific公司；MANF、非剪接型X-盒結(jié)合蛋白1(non-spliced X-box binding protein 1-U, XBP1-U)抗體購自美國Abcam公司；葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose-regulated protein 78, GRP78)、蛋白酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(protein kinase R-like ER kinase, PERK)、p-PERK、真核翻譯啟動因子2α(eukaryotic translation initiation factor 2α, eIF2α)、p-eIF2α、活化轉(zhuǎn)錄因子4(activating transcription factor 4, ATF4)、CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白(C/EBP-homologous protein, CHOP)、Tribbles同源蛋白3(Tribbles homolog 3, TRIB3)、肌醇需求激酶1(inositol-requiring enzyme 1, IRE1)、p-IRE1、剪接型X-盒結(jié)合蛋白1(spliced X-box binding protein1-S, XBP1-S)、活化轉(zhuǎn)錄因子6(activating transcription factor 6, ATF6)抗體購自美國CST公司；TRIzol購自美國Thermo公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR擴(kuò)增試劑盒購自日本TaKaRa公司；GRP78、PERK、eIF2α、ATF4、CHOP、TRIB3、IRE1、XBP1-S、XBP1-U、ATF6引物購自生工生物工程(上海)股份有限公司；RFP(R3501)、DMSO購于美國Sigma公司；谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase, ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase, AST)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, AKP)、總膽紅素(total bilirubin, TBIL)測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所；人間接膽紅素(indirect bilirubin, IBIL) ELISA試劑盒購于上海易利生物科技有限公司；青霉素/鏈霉素、BCA蛋白測定試劑盒、GAPDH抗體、二抗、CCK-8試劑盒購自上海碧云天公司；PE Annexin V凋亡檢測試劑盒購自上海貝博生物公司；細(xì)胞培養(yǎng)板購于美國TrueLine公司；酶標(biāo)儀購自美國PE公司(Enspire)；流式細(xì)胞儀購于美國貝克曼公司(CytoFLEX)。

1.2 細(xì)胞分組及其培養(yǎng)

HepG2細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海分院細(xì)胞庫；利用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建MANF敲低穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株(MANF Y25)及其對照細(xì)胞株(MANF Y07)，實(shí)驗(yàn)分成4組：MANF Y07+DMSO組、MANF Y07+RFP組、MANF Y25+DMSO組、MANF Y25+RFP組。用含10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)。在含5% CO、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天半量換液，取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染時(shí)采用不含血清及雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.3 慢病毒構(gòu)建及轉(zhuǎn)染

將生長至對數(shù)生長期的目的細(xì)胞胰酶消化后，以每孔5×10個細(xì)胞的密度均勻鋪在12孔板上，當(dāng)細(xì)胞生長至匯合度30%～40%時(shí)感染慢病毒，同時(shí)將培養(yǎng)基更換成不含血清和雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基，培養(yǎng)8～12 h后，更換成含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，48～72 h后用嘌呤霉素篩選陽性克隆細(xì)胞2周左右。

1.4 Western blot檢測蛋白表達(dá)水平

將生長至對數(shù)生長期的MANF Y07、MANF Y25細(xì)胞胰酶消化后，以每孔2.0×10個細(xì)胞的密度均勻接種在6孔板上，當(dāng)細(xì)胞生長至匯合度達(dá)到70%～80%時(shí)，加入100 μmol/L RFP誘導(dǎo)24 h，然后收集各組細(xì)胞。用蛋白提取試劑盒提取蛋白，用BCA蛋白測定試劑盒進(jìn)行蛋白定量，上樣后于SDS-PAGE凝膠上進(jìn)行電泳、分離，再轉(zhuǎn)入PVDF膜上轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉TBST溶液室溫封閉1 h，再分別加入GAPDH(1 ∶5 000)、MANF、GRP78、p-PERK、PERK、p-eIF2α、eIF2α、ATF4、CHOP、TRIB3、p-IRE1、IRE1、XBP1-S、XBP1-U、ATF6抗體(1 ∶1 000)，4 ℃孵育過夜。次日PVDF膜恢復(fù)室溫后用TBST洗膜5次，每次8 min，分別加入二抗(1 ∶5 000)，于室溫下孵育1 h，再次用TBST洗膜5次，每次8 min，最后加ECL顯影液顯影。GAPDH作為內(nèi)參，采用Image J軟件分析結(jié)果。蛋白表達(dá)水平以與內(nèi)參比值的平均灰度表示。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測MANF及UPR相關(guān)基因表達(dá)水平

收集100 μmol/L RFP處理后的各組細(xì)胞，用TRIzol提取各組細(xì)胞中的總RNA。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作說明將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄條件：37 ℃，15 min(逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng))，85 ℃，5 s(逆轉(zhuǎn)錄酶失活)，4 ℃，然后用PCR擴(kuò)增試劑盒擴(kuò)增PCR。擴(kuò)增條件：變性 95 ℃ 5 s，退火 60 ℃ 30 s，延伸 60 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。讀取每個反應(yīng)的Ct值，以2表示基因相對表達(dá)量。所用qRT-PCR引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.6 Annexin V-PE/7-AAD雙染法檢測細(xì)胞凋亡率

將生長至對數(shù)生長期的MANF Y07、MANF Y25細(xì)胞胰酶消化后，以每孔2.0×10個細(xì)胞的密度均勻接種在6孔板上，當(dāng)細(xì)胞生長至匯合度達(dá)到70%～80%時(shí)，加入100 μmol/L RFP誘導(dǎo)24 h，然后收集各組細(xì)胞。預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，再加入5 μl Annexin V-PE 和 7-AAD避光孵育15 min，最后加入200 μl結(jié)合緩沖液，1 h內(nèi)流式細(xì)胞儀檢測。

1.7 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖

取對數(shù)生長期的MANF Y07、MANF Y25細(xì)胞胰酶消化后，以每孔2.5×10個細(xì)胞的密度均勻接種在96孔板上，邊緣孔用無菌PBS填充。當(dāng)細(xì)胞生長至匯合度達(dá)到70%～80%時(shí)，加入100 μmol/L RFP誘導(dǎo)24 h后，每個孔中分別加入10 μl CCK-8溶液和90 μl的純DMEM培養(yǎng)液，輕輕敲擊培養(yǎng)板，使兩者充分混勻，于37 ℃培養(yǎng)箱中避光孵育1～4 h。使用酶標(biāo)儀測定450 nm波長處的吸光度(optical density,OD)值。

1.8 細(xì)胞培養(yǎng)上清液中細(xì)胞損傷標(biāo)志物相對含量檢測

收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液(約2 ml)，以3 000 r/min離心10 min。立即測定上清液或儲存在-80 ℃冰箱以備用，注意避免反復(fù)凍融以及含有RFP的樣本注意避光保存。分別根據(jù)ALT、AST、AKP、TBIL、IBIL檢測試劑盒的操作說明，設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)孔、樣品孔、對照孔和空白孔，將各組樣品與試劑盒里的試劑按照要求加到標(biāo)準(zhǔn)孔、樣品孔、對照孔和空白孔中，輕輕敲擊96孔板，使之充分混勻，于37 ℃培養(yǎng)箱中避光孵育一定時(shí)間，最后根據(jù)各自所要求的波長，用酶標(biāo)儀測定各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液所對應(yīng)的吸光度，根據(jù)計(jì)算公式或者標(biāo)準(zhǔn)曲線得出各組細(xì)胞損傷標(biāo)志物(ALT、AST、AKP、TBIL、IBIL)的相對含量。

2 結(jié)果

2.1 MANF在HepG2穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株中的表達(dá)及敲低MANF對GRP78表達(dá)的影響

MANF基因敲低效率通過Western blot和qRT-PCR檢測。與對照細(xì)胞株(MANF Y07)相比，在MANF敲低穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株(MANF Y25)中，MANF蛋白表達(dá)減少了約40%(

F

=18.44，

P

<0.05),MANF 基因表達(dá)減少了約90%(

F

=1 067.41，

P

<0.01),見圖1，表明MANF敲低穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株構(gòu)建成功。100 μmol/L RFP給藥24 h后可增加MANF的蛋白及基因表達(dá)(

P

<0.01)。本研究首先觀察了RFP處理的HepG2細(xì)胞中GRP78蛋白及基因表達(dá)的變化。Western blot和qRT-PCR分析均表明，RFP處理可上調(diào)GRP78蛋白及基因的表達(dá)(

P

<0.05，

P

<0.01)，見圖2。MANF敲低前后對比發(fā)現(xiàn)，敲低后GRP78蛋白(

F

=15.12，

P

<0.05)及基因(

F

=359.32，

P

<0.01)表達(dá)水平進(jìn)一步升高，表明RFP可以激活GRP78，而在敲低MANF后這種激活效應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)。

圖1 MANF在HepG2穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株中的表達(dá)A：各組MANF蛋白表達(dá)水平；B：MANF的擴(kuò)增曲線；C：各組MANF基因表達(dá)水平；1：MANF Y07+DMSO組；2：MANF Y07+RFP組；3：MANF Y25+DMSO組；4：MANF Y25+RFP組；與MANF Y07+DMSO組比較：*P<0.05，**P<0.01；與MANF Y07+RFP組比較： △△P<0.01

圖2 敲低MANF對GRP78表達(dá)的影響A：各組GRP78蛋白表達(dá)水平；B：GRP78的擴(kuò)增曲線；C：各組GRP78基因表達(dá)水平；1：MANF Y07+DMSO組；2：MANF Y07+RFP組；3：MANF Y25+DMSO組；4：MANF Y25+RFP組；與MANF Y07+DMSO組比較：*P<0.05，**P<0.01；與MANF Y25+RFP組比較：##P<0.01；與MANF Y07+RFP組比較：△P<0.05，△△P<0.01

2.2 MANF敲低對HepG2細(xì)胞UPR 3條信號通路的影響

2

.

2

.

1

MANF敲低對HepG2細(xì)胞PERK-ATF4-CHOP信號通路的影響 用RFP處理HepG2細(xì)胞24 h后，結(jié)果如圖3所示，在MANF敲低前，RFP可以誘導(dǎo)p-eIF2α/eIF2α、ATF4的蛋白表達(dá)(

P

<0.01)以及PERK(

P

<0.05)、eIF2α(

P

<0.01)、ATF4(

P

<0.01)、CHOP(

P

<0.05)、TRIB3(

P

<0.01)基因表達(dá)，MANF基因敲低后發(fā)現(xiàn)p-PERK/PERK(

F

=349.3，

P

<0.01)、p-eIF2α/eIF2α(

F

=626.0，

P

<0.01)、ATF4(

F

=87.38，

P

<0.01)的蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步升高，同時(shí)發(fā)現(xiàn)PERK(

F

=121.50，

P

<0.01)、eIF2α(

F

=49.02，

P

<0.01)、ATF4(

F

=48.96，

P

<0.01)、CHOP(

F

=92.99，

P

<0.01)、TRIB3(

F

=35.14，

P

<0.01)的基因表達(dá)水平也進(jìn)一步升高。說明RFP可以激活PERK-ATF4-CHOP信號通路，在敲低MANF后這種激活效應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)。

圖3 MANF敲低對HepG2細(xì)胞PERK-ATF4-CHOP信號通路的影響A-E：各組PERK、eIF2α、ATF4、CHOP、TRIB3蛋白和基因表達(dá)水平；1：MANF Y07+DMSO組；2：MANF Y07+RFP組；3：MANF Y25+DMSO組；4：MANF Y25+RFP組；與MANF Y07+DMSO組比較：*P<0.05，**P<0.01；與MANF Y25+RFP組比較：##P<0.01；與MANF Y07+RFP組比較：△△P<0.01

2

.

2

.

2

MANF敲低對HepG2細(xì)胞IRE1-XBP1信號通路的影響 如圖4所示，MANF敲低前后對比發(fā)現(xiàn)，MANF敲低后RFP誘導(dǎo)IRE1(

F

=56.04，

P

<0.01)、XBP1-S/XBP1-U(

F

=40.38，

P

<0.01)基因表達(dá)水平升高，表明RFP可以激活I(lǐng)RE1-XBP1信號通路，在敲低MANF后這種激活效應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)。

圖4 MANF敲低對HepG2細(xì)胞IRE1-XBP1信號通路的影響A、B：各組IRE1、XBP1-S、XBP1-U蛋白和基因表達(dá)水平；1：MANF Y07+DMSO組；2：MANF Y07+RFP組；3：MANF Y25+DMSO組；4：MANF Y25+RFP組；與MANF Y07+DMSO組比較：**P<0.01；與MANF Y25+RFP組比較：#P<0.05，##P<0.01；與MANF Y07+RFP組比較：△△P<0.01

2

.

2

.

3

MANF敲低后對ATF6信號通路的影響 如圖5所示，在MANF敲低前，RFP誘導(dǎo)ATF6蛋白的表達(dá)，MANF基因敲低后發(fā)現(xiàn)ATF6的蛋白(

F

=364.7，

P

<0.01)和基因(

F

=29.90，

P

<0.01)表達(dá)

圖5 MANF敲低后對ATF6蛋白和基因表達(dá)的影響1：MANF Y07+DMSO組；2：MANF Y07+RFP組；3：MANF Y25+DMSO組；4：MANF Y25+RFP組；與MANF Y07+DMSO組比較：**P<0.01；與MANF Y25+RFP組比較：#P<0.05，##P<0.01：與MANF Y07+RFP組比較：△△P<0.01

水平均進(jìn)一步升高。說明RFP可以激活A(yù)TF6信號通路，在敲低MANF后這種激活效應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)。

2.3 MANF敲低后對HepG2細(xì)胞損傷的影響

Annexin V-PE/7-AAD雙染法結(jié)果顯示：與MANF Y07+RFP組(11.64±0.99)%比較，MANF Y25+RFP組(16.48±1.14)%細(xì)胞凋亡率升高(

F

=35.80，

P

<0.01)，見圖6A；CCK-8檢測結(jié)果顯示：MANF Y25+RFP組(1.96±0.08)細(xì)胞OD值較MANF Y07+RFP組(2.29±0.04)降低(

F

=56.59，

P

<0.01)，見圖6B；細(xì)胞培養(yǎng)上清液結(jié)果顯示：與MANF Y07+RFP組[(12.87±0.85)、(4.27±0.17)、(2.08±0.02)、(11.53±0.64)、(2.77±0.53)U/L]比較，MANF Y25+RFP組[(29.81±0.85)、(6.58±0.93)、(2.43±0.05)、(15.49±0.59)、(5.97±0.53)U/L]細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的細(xì)胞損傷標(biāo)志物ALT(

F

=27.97，

P

<0.01)、AST(

F

=14.41，

P

<0.05)、AKP(

F

=46.17，

P

<0.01)、TBIL(

F

=378.58，

P

<0.01)、IBIL(

F

=32.71，

P

<0.01)均升高，見圖6C-6G。表明MANF敲低后加重了RFP誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞損傷。

圖6 MANF敲低后對HepG2細(xì)胞損傷的影響A：MANF敲低后對HepG2細(xì)胞凋亡的影響；B：MANF敲低后對HepG2細(xì)胞增殖的影響；C-G：MANF敲低后各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中細(xì)胞損傷標(biāo)志物ALT、AST、AKP、TBIL、IBIL的變化；H：各組HepG2細(xì)胞凋亡的流式圖；1：MANF Y07+DMSO組；2：MANF Y07+RFP組；3：MANF Y25+DMSO組；4：MANF Y25+RFP組；與MANF Y07+DMSO組比較：*P<0.05，**P<0.01；與MANF Y25+RFP組比較：##P<0.01；與MANF Y07+RFP組比較：△P<0.05，△△P<0.01

3 討論

當(dāng)機(jī)體在毒性藥物、感染、低氧、氧應(yīng)激等條件誘導(dǎo)下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未折疊或錯誤折疊的蛋白質(zhì)聚集導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)。ERS可以觸發(fā)適應(yīng)性保護(hù)機(jī)制-UPR，旨在清除未折疊或錯誤折疊的蛋白質(zhì)來恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)平衡。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白GRP78，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)的主要調(diào)節(jié)因子，對于ERS的啟動非常重要。在非應(yīng)激條件下，GRP78與跨膜應(yīng)激傳感器PERK、IRE1和ATF6結(jié)合；在應(yīng)激條件下，錯誤折疊的蛋白質(zhì)與這些傳感器競爭與GRP78結(jié)合，釋放PERK、IRE1和ATF6應(yīng)激傳感器以激活UPR。隨著ERS時(shí)間的延長，PERK多聚化并激活eIF2α磷酸化，促進(jìn)ATF4的翻譯，從而激活包括CHOP和TRIB3在內(nèi)的特異性UPR靶基因的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。持續(xù)應(yīng)激下，IRE1可以通過激活c-jun氨基末端激酶(JNK)通路和招募凋亡信號調(diào)節(jié)激酶(ASK1)來觸發(fā)細(xì)胞凋亡。ATF6是UPR的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，既可以通過誘導(dǎo)CHOP的表達(dá)，驅(qū)動細(xì)胞凋亡機(jī)制；也可以通過調(diào)節(jié)ERS期間的蛋白質(zhì)折疊能力促進(jìn)細(xì)胞存活。本研究結(jié)果提示RFP可以激活GRP78以及PERK-ATF4-CHOP、IRE1-XBP1、ATF6 3條UPR信號通路，并且MANF敲低后，上述激活效應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)，同時(shí)細(xì)胞損傷加重。這說明MANF可能通過調(diào)節(jié)UPR，恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)，來發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用。有文獻(xiàn)報(bào)道MANF可以通過抑制ERS的凋亡信號通路來介導(dǎo)細(xì)胞保護(hù)作用，本研究結(jié)果與之一致。

MANF是ERS最敏感的基因，具有獨(dú)特的三維結(jié)構(gòu)，N端saposin樣結(jié)構(gòu)域和C端SAP(SAF-A/B，Acinus and PIAS，SAP)結(jié)構(gòu)域，MANF的C末端與Ku70的SAP結(jié)構(gòu)域同源，Ku70是促凋亡Bax蛋白的抑制劑，發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡的作用，因此推測MANF的SAP結(jié)構(gòu)域與其抗凋亡作用有關(guān)。遇到炎癥和ERS時(shí)，MANF通過C端SAP結(jié)構(gòu)域與核因子-κB(NF-κB)p65亞基的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域相互作用而負(fù)調(diào)控NF-κB通路，從而起到抑制炎癥反應(yīng)的作用。本次體外研究顯示：RFP可以誘導(dǎo)MANF的蛋白及基因表達(dá)；敲低MANF后，HepG2細(xì)胞凋亡率升高，細(xì)胞增殖能力降低。此研究結(jié)果可以證明ERS增加了MANF的表達(dá)和分泌以及MANF在RFP誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞損傷中發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用，這可能和MANF有抗細(xì)胞凋亡與抑制炎癥反應(yīng)作用有關(guān)。Yang et al研究發(fā)現(xiàn)：MANF基因缺失激活了ATF4/CHOP和JNK/c-JUN/CHOP信號通路，并且加重了肝缺血再灌注誘導(dǎo)的肝損傷，本研究得出的結(jié)論與之基本一致。

ALT、AST、AKP、TBIL、IBIL是臨床上反映肝功能狀態(tài)的重要指標(biāo)，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中ALT、AST、AKP、TBIL、IBIL的含量與細(xì)胞損傷程度密切相關(guān)。本研究觀察到RFP可以誘導(dǎo)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中細(xì)胞損傷標(biāo)志物ALT、AST、AKP、TBIL、IBIL水平升高，并且MANF敲低后這些指標(biāo)進(jìn)一步升高，間接說明敲低MANF加重了RFP對HepG2細(xì)胞的損傷。與敲低MANF升高了HepG2細(xì)胞凋亡率及降低了細(xì)胞增殖能力這些結(jié)果相結(jié)合，可以進(jìn)一步說明MANF有細(xì)胞保護(hù)作用。