趙彤彤 ，寧曉帥，楊亞婷，張雨龍，任振華，劉寰忠

精神分裂癥是一種常見的、嚴(yán)重危害人類健康的精神疾病，其中難治性精神分裂癥至少占到20%，氯氮平是治療難治性精神分裂癥的首選藥物。但其臨床應(yīng)用受到嚴(yán)重不良反應(yīng)的限制，其中就包括胰腺炎。關(guān)于氯氮平導(dǎo)致胰腺損傷的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，有研究顯示促炎性細(xì)胞因子在胰腺炎的病程進(jìn)展中起到重要作用，而血淀粉酶是臨床胰腺炎診斷的首選實(shí)驗(yàn)室檢查項(xiàng)目。該研究旨在探討氯氮平對小鼠血液以及胰腺組織中淀粉酶和促炎性細(xì)胞因子表達(dá)的影響，以期有助于初步探索氯氮平導(dǎo)致胰腺損傷的發(fā)生機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

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1

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1

實(shí)驗(yàn)動物 SPF級雄性C57BL/6小鼠，購于安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心[許可證號SCXK(皖)2017-001]，體質(zhì)量(20±2)g。分籠飼養(yǎng)于明暗周期為12 h晝夜節(jié)律，相對濕度45%左右，室溫(22±2)℃的普通設(shè)施中，普通全價(jià)鼠飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食及飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)已獲得安徽醫(yī)科大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(編號：LLSC20190743)。

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1

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2

藥品與試劑 氯氮平(上海上藥信誼藥廠有限公司, 批號: H31021152)；水合氯醛(上海生工生物工程有限公司)。RIPA裂解液和BCA蛋白檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；PVDF膜(美國Millipore公司)；ECL超敏發(fā)光試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司)；鼠一抗α-tubulin抗體(T6199)購自美國Sigma-Aldrich公司；兔一抗淀粉酶(amylase)(貨號：ab21156)、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1β(貨號：ab9722)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor α，TNF-α)(貨號：ab6671)抗體購自英國Abcam公司；兔一抗IL-6抗體(12912S)購自美國Cell Signaling Technology公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔和山羊抗小鼠IgG二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。TRIzol試劑盒(美國Life Technogies公司)；DEPC-HO(上海捷瑞生物工程有限公司)；RevertAid第一鏈 cDNA Synthesis試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司)；Novostart SYBR qPCR SuperMix Plus試劑盒(上海近岸蛋白科技有限公司)；其他試劑為分析純。

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主要儀器 電子天平(上海菁海儀器有限公司)；pH計(jì)(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)；多功能酶標(biāo)儀、高速低溫離心機(jī)、熒光定量PCR儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)；電泳儀、電泳槽和轉(zhuǎn)膜儀、化學(xué)發(fā)光成像儀(上海天能科技有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1

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2

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1

模型的制作和標(biāo)本的處理 48只雄性C57BL/6小鼠按照隨機(jī)化原則分為四組，分別為對照組、氯氮平(5、10、20 mg/kg)組。氯氮平充分研磨后加入0.9%氯化鈉溶液，分別配成濃度為0.5、1、2 mg/ml的懸濁液，每次灌胃前充分搖勻。每日在給藥前先稱重每只小鼠的體質(zhì)量，氯氮平5 mg/kg組的小鼠根據(jù)體質(zhì)量灌胃0.5 mg/ml的懸濁液，氯氮平10 mg/kg組的小鼠根據(jù)體質(zhì)量灌胃1 mg/ml的懸濁液，氯氮平20 mg/kg組的小鼠根據(jù)體質(zhì)量灌胃2 mg/ml的懸濁液，對照組小鼠根據(jù)體質(zhì)量灌胃相應(yīng)體積0.9%氯化鈉溶液。上述各組小鼠每日上午9:00灌胃1次，連續(xù)14 d給予相應(yīng)劑量藥物。期間各組小鼠飲食自由。末次給藥前禁食不禁水12 h，給藥后再禁食3 h，隨后腹腔注射4%水合氯醛麻醉小鼠，待小鼠的麻醉狀態(tài)達(dá)到最佳時(shí)，剖腹打開小鼠胸腔后完全暴露心臟，然后經(jīng)心臟穿刺采血置于惰性分離膠促凝管內(nèi)，低溫離心后分離血清置-80 ℃ 冰箱中待測；采血后立即取出小鼠胰腺組織液氮驟冷，置于-80 ℃冰箱保存待用。每組小鼠中的6個(gè)胰腺組織用于Western blot實(shí)驗(yàn)，另外6個(gè)胰腺組織用于熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)。

1

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2

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2

小鼠血清amylase、IL-1β、IL-6和TNF-α的測定 血清amylase采用比色分析試劑盒(ab102523)測定，血清IL-1β、IL-6、TNF-α采用ELISA試劑盒(ab197742、ab222503、ab46105)測定。上述試劑盒均購自英國Abcam公司，嚴(yán)格按照制造商的說明書操作。

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3

Western blot測定小鼠胰腺組織amylase、IL-1β、IL-6和TNF-α的蛋白表達(dá) 從每組小鼠各取6個(gè)胰腺組織，每個(gè)胰腺組織加入含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液后冰上勻漿提取蛋白，在冷凍離心機(jī)中以12 000 r /min離心15 min，使用BCA蛋白檢測試劑盒檢測蛋白濃度。根據(jù)蛋白濃度計(jì)算每個(gè)樣本的上樣量，蛋白樣品與上樣緩沖液體積比4 ∶1混合, 總體積不超過20 μl，用10%SDS-PAGE分離蛋白, 電泳轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜后用4%BSA室溫封閉2 h。再將膜溶于含4%BSA中的一抗4 ℃緩慢搖動孵育過夜。洗膜后將膜浸入用二抗稀釋液稀釋的二抗中, 室溫下孵育2 h。參考ECL發(fā)光試劑盒說明書，使用化學(xué)發(fā)光儀進(jìn)行底物顯影曝光拍照，采用ImageJ圖像分析軟件分析灰度值，所有蛋白條帶灰度值均以對應(yīng)的a-tubulin為基準(zhǔn)進(jìn)行校正, 計(jì)算相對灰度值。

1

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2

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4

熒光定量PCR測定小鼠胰腺組織amylase、IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表達(dá) 從每組小鼠各取6個(gè)胰腺組織，剪碎，液氮研磨后，加入TRIzol核酸提取液裂解，冰上勻漿, 按操作說明提取總RNA。室溫干燥RNA沉淀，加入DEPC水, -80 ℃保存?zhèn)溆谩０茨孓D(zhuǎn)錄試劑盒說明書在PCR儀上進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，制成cDNA。RT反應(yīng)條件為：42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min。取出所得的cDNA作為熒光定量的模板，構(gòu)建反應(yīng)體系，PCR反應(yīng)條件為：95 ℃變性1 min, 95 ℃變性20 s, 60 ℃退火1 min，40個(gè)循環(huán)。讀取目的基因amylase、IL-1β、IL-6和TNF-α及對應(yīng)內(nèi)參基因β-actin的閾值循環(huán)數(shù)(Ct值), 再采用比較ΔCt值的相對定量法計(jì)算目的基因表達(dá)水平。PCR引物序列均由上海生工生物工程公司合成(表1)。

表1 引物序列

2 結(jié)果

2.1 氯氮平對小鼠外周血amylase、IL-1β、IL-6和TNF-α表達(dá)的影響

如表2所示，氯氮平給藥后小鼠血清amylase水平升高(

F

=7.890,

df

=3,

P

<0.001)；與對照組相比，氯氮平10 mg/kg和20 mg/kg 組血清amylase水平明顯升高(

P

<0.01,

P

<0.001)。氯氮平給藥后小鼠血清IL-1β水平升高(

F

=6.976,

df

=3,

P

<0.01)；與對照組相比，氯氮平5 mg/kg和10 mg/kg組血清IL-1β水平明顯升高(

P

<0.01)；氯氮平20 mg/kg組與對照組相比升高更加明顯(

P

<0.001)。氯氮平給藥后也影響了小鼠血清IL-6的水平(

F

=4.033,

df

=3,

P

<0.05)；與對照組相比，氯氮平5 mg/kg組的IL-6水平有所下降(

P

<0.05)。氯氮平給藥后對小鼠血清TNF-α水平無影響，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=0.272,

df

=3,

P

>0.05)。

表2 四組小鼠血清amylase、IL-1β、IL-6和TNF-α水平的比較

2.2 氯氮平對小鼠胰腺組織amylase、IL-1β、IL-6和TNF-α表達(dá)的影響

如圖1、表3所示，氯氮平能上調(diào)小鼠胰腺組織amylase、IL-1β、IL-6和TNF-α蛋白表達(dá)水平(

F

=95.042,

df

=3,

P

<0.001；

F

=184.349,

df

=3,

P

<0.001；

F

=332.945,

df

=3,

P

<0.001；

F

=219.696,

df

=3,

P

<0.001)。與對照組相比，氯氮平5、10、20 mg/kg組的胰腺組織中amylase、IL-1β、IL-6和TNF-α的蛋白表達(dá)水平明顯升高(

P

<0.01)。氯氮平給藥后小鼠胰腺組織中amylase、IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表達(dá)水平與它們各自的蛋白表達(dá)水平基本一致(

F

=121.605,

df

=3,

P

<0.001；

F

=125.620,

df

=3,

P

<0.001；

F

=70.350,

df

=3,

P

<0.001；

F

=74.281,

df

=3,

P

<0.001)，與對照組相比，氯氮平5、10和20 mg/kg組的胰腺組織中amylase、IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表達(dá)水平明顯升高(

P

<0.01)。見表4。

圖1 四組小鼠胰腺組織amylase、IL-1β、IL-6和TNF-α的相對表達(dá)量1:對照組；2:氯氮平5 mg/kg組；3:氯氮平10 mg/kg組；4:氯氮平20 mg/kg組

表3 四組小鼠胰腺組織amylase、IL-1β、IL-6和TNF-α蛋白表達(dá)水平的比較

表4 四組小鼠胰腺組織amylase、IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA表達(dá)水平的比較

3 討論

近年來隨著非典型抗精神病藥物的廣泛使用，由抗精神病藥引起的藥物性胰腺炎逐漸引起關(guān)注，據(jù)美國FDA統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明抗精神病藥中導(dǎo)致胰腺炎報(bào)道最多的藥物是氯氮平。氯氮平的用藥起始時(shí)間與胰腺炎的發(fā)病進(jìn)一步支持了因果關(guān)系，所有患者均表現(xiàn)為血清amylase水平的升高。有研究顯示患者在氯氮平治療初期即會引起免疫介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)為外周血細(xì)胞因子的升高。在這期間內(nèi)，患者被懷疑具有藥物相關(guān)副作用的風(fēng)險(xiǎn)達(dá)到最高。值得注意的是，對于氯氮平一些其他潛在危及生命的副作用已經(jīng)提出了免疫介導(dǎo)機(jī)制。氯氮平治療后對細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)作用并可能伴隨著炎癥副作用的發(fā)生，提示免疫機(jī)制可能參與氯氮平副作用的發(fā)生。

血amylase是臨床胰腺炎診斷的首選實(shí)驗(yàn)室檢查，本研究結(jié)果顯示，氯氮平可導(dǎo)致小鼠血清amylase呈劑量依賴性升高。目前關(guān)于非典型抗精神病藥對血amylase影響的動物實(shí)驗(yàn)較少，國外僅有1項(xiàng)奧氮平口服給藥的大鼠實(shí)驗(yàn)，研究結(jié)果顯示奧氮平導(dǎo)致大鼠血清amylase明顯升高。奧氮平的化學(xué)結(jié)構(gòu)和藥理作用與氯氮平類似，是抗精神病藥物中報(bào)告胰腺炎發(fā)生率僅次于氯氮平的藥物。國內(nèi)的一項(xiàng)對氯氮平急性中毒患者的研究顯示，一次性大劑量服用氯氮平導(dǎo)致患者的血amylase明顯升高乃至出現(xiàn)高淀粉酶血癥，這進(jìn)一步提供了藥物本身致病作用的證據(jù)并支持了亞臨床性胰腺炎的可能。

胰腺炎作為一種炎癥性疾病，活化的巨噬細(xì)胞先誘導(dǎo)胰腺腺泡細(xì)胞發(fā)生損傷并產(chǎn)生炎癥介質(zhì)的，其中TNF-α和IL-1β是一階段促炎性因子，它們通過再激活巨噬細(xì)胞并調(diào)節(jié)其他炎癥介質(zhì)如IL-6的釋放來增強(qiáng)炎癥反應(yīng)，因此促炎性細(xì)胞因子的檢測為評估胰腺損傷的嚴(yán)重程度提供了客觀依據(jù)。該研究結(jié)果顯示氯氮平不僅使小鼠胰腺組織中amylase的表達(dá)顯著升高，而且小鼠胰腺組織中促炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的水平也呈劑量依賴性地升高。這些結(jié)果與經(jīng)典酒精性胰腺炎小鼠模型中的結(jié)果一致，更加支持了胰腺組織中炎性介質(zhì)的逐漸積累直至胰腺炎癥的發(fā)生，從而表現(xiàn)為臨床上有癥狀的急性胰腺炎。

本研究表明氯氮平顯著升高了血清IL-1β的水平，這與胰腺組織中IL-1β的表達(dá)趨勢一致。IL-1β已被證實(shí)在胰腺炎病程進(jìn)展中起到核心作用，有研究表明通過使用IL-1β轉(zhuǎn)化酶抑制劑，可以改善急性重癥胰腺炎損傷的嚴(yán)重程度。但氯氮平對小鼠血清IL-6和TNF-α表達(dá)的影響卻與胰腺組織中的趨勢不一致，氯氮平在低劑量組使血清IL-6降低了，而氯氮平三組對血清TNF-α均無明顯影響。實(shí)際上，一直以來關(guān)于氯氮平對外周血細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)作用并沒有得出一致趨勢的結(jié)論，這有待進(jìn)一步的研究。