徐明靜，蘆東徽，高世樂(lè)，馬 歡，方 向，錢(qián)立庭

肝癌是最為常見(jiàn)的惡性腫瘤，可分為原發(fā)性和繼發(fā)性?xún)深?lèi)，其中原發(fā)性肝癌起源于肝臟的上皮或間葉組織。我國(guó)是原發(fā)性肝癌的高發(fā)地區(qū)，其死亡率僅次于胃癌、肺癌，是危害性強(qiáng)的惡性腫瘤。目前，原發(fā)性肝癌的具體發(fā)病機(jī)制尚不完全明了，可能與慢性肝炎感染、肝硬化、酒精、黃曲霉素、遺傳等因素有關(guān)。三維適形放療是臨床原發(fā)性肝癌常用的治療手段之一，但并不是所有患者都對(duì)其敏感。因此，探索相關(guān)生物學(xué)標(biāo)志物監(jiān)測(cè)放療敏感度，將有助于患者放療方案的制定與療效的預(yù)測(cè)。腫瘤細(xì)胞凋亡受多種基因、信使調(diào)控，多項(xiàng)研究表明，M2型丙酮酸激酶(M2-pyruvate kinase，PKM2)、環(huán)氧合酶2(cyclooxygenase 2，COX2)及凋亡蛋白抑制因子(inhibitor of apoptosis protein，IAPs)可能參與抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，產(chǎn)生放療抵抗，最終導(dǎo)致放療失敗。但上述蛋白表達(dá)與原發(fā)性肝癌的患者放療敏感性關(guān)系的報(bào)道較少，故本研究將檢測(cè)原發(fā)性肝癌患者肝癌組織中PKM2、COX2、X關(guān)聯(lián)凋亡抑制因子(X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP)及細(xì)胞內(nèi)凋亡抑制蛋白1(cellular inhibitor of apoptosis protein 1，cIAP-1)蛋白的表達(dá)，具體分析其與放療敏感性的關(guān)系，以探討監(jiān)測(cè)放療敏感度的潛在標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集2015年1月至2018年6月確診為原發(fā)性肝癌患者105例，其中男62例，女43例，年齡45～73(57.23±9.52)歲；病理學(xué)類(lèi)型：肝細(xì)胞癌90例，膽管細(xì)胞癌4例，混合型肝細(xì)胞-膽管細(xì)胞癌11例；臨床分期：Ⅰ期9例，Ⅱ期29例，Ⅲ期48例，Ⅳ期19例；分化程度：低分化28例，中分化40例，高分化37例；腫瘤直徑≥5 cm者91例，<5 cm者14例；合并乙型病毒性肝炎85例。本次研究已通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：患者經(jīng)肝臟穿刺活檢病理檢查確診為原發(fā)性肝癌；具有三維適形放療指征；初治病例；臨床資料完整。

排除標(biāo)準(zhǔn)：復(fù)發(fā)性或轉(zhuǎn)移性肝癌；合并有其他惡性腫瘤；伴有心、肝、腎等重要臟器功能障礙；合并全身免疫性疾?。痪癞惓?、神志不清者；存在認(rèn)知障礙者；治療依從性差。

1.3 方法

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免疫組化法檢測(cè)肝癌組織中PKM2、COX2、XIAP及cIAP-1蛋白表達(dá) 取活檢組織樣本，行常規(guī)石蠟包埋制片，脫蠟水化后滴加雙氧水，封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，水洗后滴加山羊血清室溫下封閉10 min，分別加入PKM2(1 ∶500)、COX2(1 ∶1 000)、XIAP(1 ∶1 000)及cIAP-1(1 ∶500)蛋白一抗工作液，4 ℃下孵育過(guò)夜；次日經(jīng)磷酸鹽緩沖液沖洗，在加入適量生物素標(biāo)記的蛋白二抗工作液(1 ∶4 000),37 ℃下孵育30 min；經(jīng)磷酸鹽緩沖液沖洗，加入二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色3～15 min，充分沖洗后加入蘇木精復(fù)染，最后脫水、透明、封片。

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3

放療方案 行CT掃描定位，采用三維適形放療技術(shù)，應(yīng)用瓦里安加速器6MV-X射線照射，總照射劑量為60 Gy，2 Gy/次，1次/d，每周照射5次。

1.4 療效評(píng)估

參照實(shí)體瘤療效判定標(biāo)準(zhǔn)，將患者劃分為完全緩解、部分緩解、穩(wěn)定及進(jìn)展，其中治療有效率=(完全緩解+部分緩解+穩(wěn)定)/總例數(shù)×100%，完全緩解和部分緩解為放療敏感組，穩(wěn)定和進(jìn)展者為放療不敏感組，比較不同放療效果和敏感性患者癌組織中PKM2、COX2、XIAP及cIAP-1蛋白表達(dá)的差異。

1.5 隨訪

隨訪至2020年6月30日，通過(guò)門(mén)診復(fù)查形式，隨訪頻率為3個(gè)月/次，記錄患者復(fù)發(fā)率、轉(zhuǎn)移率和生存率。

2 結(jié)果

2.1 肝癌組織中PKM2、COX2、XIAP及cIAP-1蛋白的表達(dá)

本組105例患者肝癌組織中PKM2蛋白陽(yáng)性86例，陰性19例，陽(yáng)性率為81.90%；COX2蛋白陽(yáng)性78例，陰性27例，陽(yáng)性率為74.28%；XIAP蛋白陽(yáng)性90例，陰性15例，陽(yáng)性率為85.71%；cIAP-1陽(yáng)性表達(dá)87例，陰性18例，陽(yáng)性率為82.86%。免疫組化檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 肝癌組織中PKM2、COX2、XIAP及cIAP-1蛋白的表達(dá) ×400A：女性，60歲，PKM2陰性表達(dá)(-)；B：男性，76歲，PKM2陽(yáng)性表達(dá)(3+)；C：男性，59歲，Ⅲ期，COX-2蛋白陰性(-)；D：男性，70歲，IV期，COX-2蛋白陽(yáng)(3+)；E：男性，71歲，Ⅱ期，XIAP蛋白陽(yáng)性(1+)；F：女性，55歲，Ⅲ期，XIAP蛋白陽(yáng)性(3+)；G：女性，46歲，Ⅳ期，cIAP蛋白陽(yáng)性(1+)；H：男性，66歲，Ⅳ期，cIAP蛋白陽(yáng)性(3+)

2.2 PKM2、COX2、XIAP及cIAP-1蛋白表達(dá)與放療治療效果的關(guān)系

COX2、XIAP蛋白陽(yáng)性表達(dá)者治療有效率與陰性者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

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<0.05)，但不同PKM2、cIAP-1蛋白表達(dá)者治療有效率的比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

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>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 不同放療效果患者PKM2、COX2、XIAP及cIAP-1蛋白表達(dá)的比較

2.3 PKM2、COX2、XIAP及cIAP-1蛋白表達(dá)與放療敏感性的關(guān)系

放療敏感患者臨床分期、分化程度、腫瘤直徑、肝癌組織中PKM2、COX2、XIAP及cIAP-1蛋白表達(dá)情況與放療不敏感者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)；但兩組患者年齡、性別、病理學(xué)類(lèi)型及是否合并乙型病毒性肝炎情況的比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

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>0.05)，見(jiàn)表2。

表2 患者放療不敏感的單因素分析(n)

2.4 患者放療不敏感的多因素分析

以患者是否放療敏感(敏感=0，不敏感=1)為因變量，上述有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的因素作為自變量，臨床分期(Ⅰ期=1，Ⅱ期=2，Ⅲ期=3，Ⅳ期=4)、分化程度(高分化=1，中分化=2，低分化=3)、腫瘤直徑(<5 cm=1，≥5 cm=2)、肝癌組織中PKM2、COX2、XIAP及cIAP-1蛋白表達(dá)(陰性表達(dá)=1，陽(yáng)性表達(dá)=2)分別賦分后納入Logistic回歸模型，結(jié)果顯示高臨床分期、低分化程度、COX2、XIAP陽(yáng)性表達(dá)是患者放療不敏感的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(

P

<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 患者放療不敏感的多因素分析

2.5 PKM2、COX2、XIAP及cIAP-1蛋白表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系

截止至隨訪日期，105例患者中22例復(fù)發(fā)，27例轉(zhuǎn)移，88例存活；XIAP陽(yáng)性表達(dá)者復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率與陰性表達(dá)者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)；但不同PKM2、COX2、cIAP-1蛋白表達(dá)者復(fù)發(fā)率、轉(zhuǎn)移率、死亡率及不同XIAP表達(dá)患者的死亡率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

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>0.05)，見(jiàn)表4。

表4 PKM2、COX2、XIAP及cIAP-1蛋白表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系

3 討論

原發(fā)性肝癌的臨床治療中，常對(duì)病灶處使用局部放射療法，以快速殺滅局部癌細(xì)胞及鄰近侵染細(xì)胞，但是實(shí)際治療過(guò)程中，不同的患者對(duì)放射治療表現(xiàn)出不同的敏感性，除了病理特征的影響外，還與患者自身個(gè)體化差異有關(guān)。因此，在原發(fā)性肝癌的治療中，有效監(jiān)測(cè)患者的放療敏感性對(duì)于患者的個(gè)性化治療尤為重要。

PKM2是人體有氧糖酵解中的關(guān)鍵限速酶，其高水平代表糖酵解途徑可為腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖提供更多的能量和物質(zhì)，這為腫瘤細(xì)胞的惡性增殖創(chuàng)造了有利條件。Liu et al研究顯示，PKM2甲基化激活有氧糖酵解后，將促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。Long et al研究發(fā)現(xiàn)，PKM2在肺癌組織中高表達(dá)，并對(duì)患者預(yù)后有一定的預(yù)測(cè)能力。COX2是催化花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素的重要限速酶，正常生理狀態(tài)下，COX2處于較低水平，當(dāng)細(xì)胞接受某些細(xì)胞因子、內(nèi)毒素、癌基因等刺激時(shí)，會(huì)大量產(chǎn)生COX2，介導(dǎo)多種蛋白酶、炎性介質(zhì)等引起炎癥反應(yīng)，參與多種疾病的發(fā)生。另外，COX2還可通過(guò)前列腺素途徑促進(jìn)腫瘤的增殖，并抑制其凋亡。近年來(lái)研究證實(shí)，COX2在多種腫瘤組織中呈高表達(dá)，如肺癌、胃癌等，并與患者病理特征、預(yù)后有關(guān)。IAPs可抑制多種刺激觸發(fā)的凋亡，包括XIAP、cIAP-1、cIAP-2等8個(gè)成員，其特殊的桿狀病毒IAP重復(fù)區(qū)序列，可有效抑制細(xì)胞凋亡蛋白酶半胱天冬酶(caspase)。汪靈 等研究指出，XIAP、cIAP-1和caspase-3在乳腺癌組織中高表達(dá)，XIAP和caspase-3可作為潛在的預(yù)后評(píng)估指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，肝癌組織中PKM2、COX2、XIAP及cIAP-1蛋白表達(dá)陽(yáng)性率分別為81.90%、74.28%、85.71%及82.86%，與既往研究結(jié)果基本相符。

細(xì)胞凋亡不僅與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，還與治療敏感性密切相關(guān)。馬歡 等回顧性分析80例肝癌患者臨床資料，發(fā)現(xiàn)PKM2在肝癌組織中陽(yáng)性率高，且與放療敏感性密切相關(guān)。Cheki et al研究顯示，COX2在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞對(duì)放療抵抗中有重要作用，可能是放療防護(hù)和放療增敏的潛在靶點(diǎn)。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)也表明，XIAP、cIAP-1表達(dá)與腫瘤細(xì)胞放療敏感性有關(guān)。本研究中，COX2、XIAP蛋白陽(yáng)性表達(dá)者治療有效率明顯低于陰性者，PKM2、COX2、XIAP及cIAP-1蛋白陽(yáng)性表達(dá)者放療敏感率也低于陰性者，表明肝癌組織中PKM2、COX2、XIAP及cIAP-1陽(yáng)性表達(dá)可能放療效果不佳。探究原發(fā)性肝癌患者放療不敏感的影響因素發(fā)現(xiàn)，高臨床分期、低分化程度、COX2、XIAP陽(yáng)性表達(dá)均是患者放療不敏感的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，可能是COX2高表達(dá)影響前列腺素代謝，加快細(xì)胞分裂，促進(jìn)新生血管的形成，有利于腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)；而XIAP是最具有潛在抑制活性的IAPs成員，可直接抑制凋亡蛋白酶活性，抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，因此，COX2、XIAP陽(yáng)性表達(dá)患者放療不敏感的風(fēng)險(xiǎn)也越高。另外，隨訪結(jié)果顯示，肝癌組織中XIAP表達(dá)還與患者復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移有關(guān)。故放療前COX2、XIAP表達(dá)的評(píng)估對(duì)于原發(fā)性肝癌患者有重要的臨床意義。同時(shí)，對(duì)于COX2、XIAP陽(yáng)性表達(dá)者，可在放療前應(yīng)用COX2、XIAP抑制劑，這可能是增加放療敏感性和改善患者預(yù)后的新思路。