劉 會，郭若文，徐 恰，劉力偉，劉 蕓，秦宜德

卵巢癌是婦科惡性腫瘤中最致命的惡性腫瘤，目前臨床上使用的治療方法仍然是手術結合化療，但是由于卵巢癌極易復發(fā)和容易產生耐藥性，所以其預后很差，患者的5年生存率只有30%左右，降低卵巢癌對化療藥物的耐藥性是當前針對卵巢癌治療的主要研究方向。乳鐵蛋白六肽(lactoferrin hexapeptide，LfcinB 4-9)來源于牛乳鐵蛋白抗菌肽(bovine lactoferricin，LfcinB)，是乳鐵蛋白抗菌肽的活性中心，具有多種生物學活性，其序列為RRWQWR。前期研究顯示LfcinB 4-9具有抗卵巢癌的作用，雖然作用效果不及目前臨床上一線抗癌藥物-順鉑(cis-dichlorodiammine platinum，DDP)，但其沒有副作用和耐藥性而廣受關注。LfcinB 4-9和DDP聯(lián)合使用能否降低卵巢癌細胞的耐藥性，增強卵巢癌對DDP的敏感性仍有待探討。該研究在前期研究的基礎上，通過LfcinB 4-9和DDP聯(lián)合作用對卵巢癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響來探索LfcinB 4-9能否改善卵巢癌細胞對DDP的耐藥性。

1 材料與方法

1.1 材料

純度為99.8%的LfcinB 4-9由上海生工公司合成；RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM 培養(yǎng)基(美國HyClone公司)；胎牛血清(FBS，上海四季青公司)；DDP(江蘇南通諾欣藥業(yè)公司)；Olaparib(D1810190，上海阿拉丁公司)；逆轉錄試劑盒(K1622，美國Thermo Fisher公司);qRT-PCR試劑盒(A6001，美國Promega公司)；Transwell板(美國Costar公司)。

1.2 細胞培養(yǎng)

人卵巢癌細胞株SKOV3、SKOV3/DDP、CI3K、CI3K/DDP均購于中科院細胞庫。SKOV3、SKOV3/DDP使用FBS濃度為10%的DMEM培養(yǎng)基，加入1%的雙抗，置于37 ℃、5% CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。CI3K、CI3K/DDP使用FBS濃度為10%的RPMI-1640培養(yǎng)基，加入1%的雙抗，置于37 ℃、5% CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 細胞增殖實驗

將細胞接種于96孔板，每組6個復孔，培養(yǎng)過夜后。分為8組：對照組、5 μmol/L LfcinB 4-9組、DDP(IC)組、DDP(IC)+0.5 μmol/L LfcinB 4-9組、DDP(IC)+5 μmol/L LfcinB 4-9組、DDP(IC)+ 50 μmol/L LfcinB 4-9組，Olaparib(IC)組、DDP(IC)+Olaparib(IC)組，分別培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔加入20 μl MTT置于培養(yǎng)箱中孵育4 h。使用酶標儀檢測吸光度(optical density,OD)值，以空白為對照組，按照計算公式：增殖抑制率(%)=(1-OD/OD)×100%，計算卵巢癌細胞增殖抑制率。

1.4 HE細胞染色觀察細胞形態(tài)

將爬片用高錳酸鉀浸泡過夜、滅菌、烘干置于6孔板底部，將細胞消化成細胞懸液，鋪在6孔板底部制成細胞爬片，過夜。按照分組加藥培養(yǎng)48 h，棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌3遍，4%多聚甲醛固定細胞20 min,PBS洗滌3遍，加入0.7% Triton X-100通透10 min后，PBS洗滌3遍。去離子水洗滌2遍，蘇木精染色7 min，50 ℃水藍化4 min,伊紅溶液染色5 min，最后清水洗滌干凈，烘干封片拍照。

1.5 平板克隆形成實驗

將細胞以1 000個每孔鋪于6孔板中，每組設置3個復孔，按照分組加藥培養(yǎng)，每2 d更換1次培養(yǎng)基，培養(yǎng)2周。將培養(yǎng)基棄去，用PBS洗滌3遍，用4%的多聚甲醛固定20 min，結晶紫染色，清水洗滌干凈拍照，以對照組計算克隆抑制率，公式為：用藥組克隆抑制率(%)=1-(用藥組形成的克隆數(shù)/空白對照組形成的克隆數(shù))×100%。

1.6 Transwell實驗

將BD基質膠按照比例配置好加入小室中，置于細胞培養(yǎng)箱中待凝固，將2×10個細胞重懸于100 μl無血清培養(yǎng)基中加至Transwell小室膜上，在小室下方加入含10% FBS的培養(yǎng)基500 μl，每組設置3個復孔，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，用PBS洗滌小室2次，用4%的多聚甲醛固定20 min，結晶紫染色，清水洗滌干凈拍照。

1.7 qRT-PCR實驗

按照分組處理細胞48 h，消化收集、裂解細胞，提取細胞中的總RNA。按照逆轉錄試劑盒中操作步驟采用兩步法將RNA逆轉錄成cDNA，包括總RNA 2 μl、Oligo(DT) 2 μl、水9 μl，65 ℃反應5 min,置于冰上。加入5×RB 4 μl、RI 1 μl、dNTP(10 mmol/L) 2 μl、RT 1 μl,最終體積為20 μl，逆轉錄反應條件為42 ℃、60 min，70 ℃、5 min，生成cDNA，并以cDNA為模板，按照qRT-PCR試劑盒配置反應體系加入到八連管中，按照3步進行反應：95 ℃預變性300 s，以95 ℃變性20 s、56 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s進行40個循環(huán)。每組設置3個復孔，以β-actin引物為內參，目的引物序列見表1，根據(jù)實驗結果獲得Ct值,以2公式計算基因的相對表達量。

表1 qRT-PCR 引物序列

2 結果

2.1 LfcinB 4-9對DDP抑制卵巢癌細胞增殖作用的影響

DDP、Olaparib作用于4種細胞各時間段的IC見表2。通過不同濃度的LfcinB 4-9和DDP IC聯(lián)合作用于人卵巢癌細胞，以Olaparib作為陽性對照，結果表明細胞的增殖抑制率隨著LfcinB 4-9濃度增大而顯著增高，表現(xiàn)出與時間呈依賴關系(

F

=841.1、

F

=474.5、

F

=614.2、

F

=290.5)。LfcinB4-9聯(lián)合DDP組與單獨使用DDP組比較差異有統(tǒng)計學意義(

P

<0.05或

P

<0.01)。見圖1。

圖1 MTT檢測聯(lián)合用藥對4種細胞增殖能力的影響A：SKOV3；B：SKOV3/DDP；C：CI3K；C：CI3K/DDP；a：對照組；b：5 μmol/L LfcinB 4-9組；c：DDP(IC50)組；d：DDP(IC50)+0.5 μmol/L LfcinB 4-9組；e：DDP(IC50)+5 μmol/L LfcinB 4-9組；f：DDP(IC50)+ 50 μmol/L LfcinB 4-9組；g：Olaparib(IC50)組；h：DDP(IC50)+Olaparib(IC50)組；與對照組比較：**P<0.01;與DDP(IC50)組比較：#P<0.05，##P<0.01

表2 DDP、Olaparib作用于4種細胞各時間段的IC50(mmol/L)

2.2 LfcinB4-9對DDP誘導卵巢癌細胞的凋亡和壞死的影響

通過HE細胞染色切片觀察細胞形態(tài)變化，實驗結果顯示LfcinB4-9聯(lián)合DDP組與單獨使用DDP組相比，更能誘導細胞凋亡和壞死。LfcinB4-9聯(lián)合DDP組的SKOV3、SKOV3/DDP、CI3K、CI3K/DDP人卵巢癌細胞經(jīng)染色均表現(xiàn)為核藍漿紅, 核大深染, 細胞核/細胞質比值增大。其中CI3K、CI3K/DDP細胞的胞核及胞質著色較于SKOV3、SKOV3/DDP細胞深, 耐藥株細胞較于不耐藥株細胞染色顏色更偏紫紅，見圖2。

圖2 HE細胞切片實驗檢測聯(lián)合用藥對人卵巢細胞形態(tài)的影響 ×100A:SKOV3 ;B:SKOV3/DDP ;C:CI3K ;D:CI3K/DDP； a：對照組；b：5 μmol/L LfcinB 4-9組；c：DDP(IC50)組；d：DDP(IC50)+0.5 μmol/L LfcinB 4-9組；e：DDP(IC50)+5 μmol/L LfcinB 4-9組；f：DDP(IC50)+ 50 μmol/L LfcinB 4-9組；g：Olaparib(IC50)組；h：DDP(IC50)+ Olaparib(IC50)組

2.3 LfcinB 4-9對DDP抑制卵巢癌細胞克隆形成的影響

實驗結果顯示與對照組比較，加藥組細胞克隆形成能力顯著降低，且LfcinB4-9聯(lián)合DDP組與單獨使用DDP組比較差異有統(tǒng)計學意義(

P

<0.01)，見圖3。

圖3 平板克隆實驗檢測聯(lián)合用藥對人卵巢細胞細胞克隆形成能力的影響 ×100A：對照組；b：5 μmol/L LfcinB 4-9組；c：DDP(IC50)組；d：DDP(IC50)+0.5 μmol/L LfcinB 4-9組；e：DDP(IC50)+5 μmol/L LfcinB 4-9組；f：DDP(IC50)+ 50 μmol/L LfcinB 4-9組；g：Olaparib(IC50)組；h：DDP(IC50)+Olaparib(IC50)組；與對照組比較：**P<0.01;與DDP(IC50)組比較：#P<0.05，##P<0.01

2.4 LfcinB 4-9對DDP抑制卵巢癌細胞侵襲能力的影響

通過Transwell實驗檢測細胞侵襲能力，結果顯示加藥培養(yǎng)細胞48 h后，和單獨使用DDP組比較，LfcinB4-9聯(lián)合DDP組細胞侵襲能力明顯下降(

P

<0.01)，見圖4。

圖4 Transwell實驗檢測聯(lián)合用藥對人卵巢細胞侵襲能力的影響 ×100A：對照組；b：5 μmol/L LfcinB 4-9組；c：DDP(IC50)組；d：DDP(IC50)+0.5 μmol/L LfcinB 4-9組；e：DDP(IC50)+5 μmol/L LfcinB 4-9組；f：DDP(IC50)+ 50 μmol/L LfcinB 4-9組；g：Olaparib(IC50)組；h：DDP(IC50)+ Olaparib(IC50)組；與對照組比較：**P<0.01;與DDP(IC50)組比較：#P<0.05，##P<0.01

2.5 LfcinB 4-9對人卵巢癌細胞的OPTN、HSF1、HSP70基因表達的影響

用qRT-PCR檢測人卵巢細胞中OPTN、HSF1、HSP70的mRNA水平。結果顯示，OPTN基因在聯(lián)合用藥組的表達水平低于單獨使用DDP組(

P

<0.05或

P

<0.01)，HSF1和HSP70在聯(lián)合用藥處理后表達量明顯降低且低于單獨使用DDP組，表明在聯(lián)合處理后相關基因表達均被抑制。在SKOV3、SKOV3/DDP細胞株中基因表達量比在CI3K、CI3K/DDP細胞株中略高。見圖5。

圖5 聯(lián)合用藥后四種細胞中OPTN、HSF1、HSP70基因的表達情況A:SKOV3;B:SKOV3/DDP;C:CI3K;D:CI3K/DDP； a：對照組；b：5 μmol/L LfcinB 4-9組；c：DDP(IC50)組；d：DDP(IC50)+0.5 μmol/L LfcinB 4-9組；e：DDP(IC50)+5 μmol/L LfcinB 4-9組；f：DDP(IC50)+50 μmol/L LfcinB 4-9組；g：Olaparib(IC50)組；h：DDP(IC50)+Olaparib(IC50)組；與對照組比較：*P<0.05,**P<0.01;與DDP(IC50)組比較：#P<0.05，##P<0.01

3 討論

DDP是目前臨床上治療卵巢癌通用的一線藥物，但由于耐藥性的出現(xiàn)，使得治療效果降低，臨床上卵巢癌病死率逐年遞增。所以急需降低卵巢癌對順鉑的耐藥性，提高患者生存率。

本實驗顯示不同濃度的LfcinB 4-9與DDP的IC聯(lián)合作用于人卵巢癌細胞，結果表明，LfcinB 4-9可以增強DDP對人卵巢癌細胞的作用，提高卵巢癌細胞對DDP的敏感性，但相關的具體機制比較復雜，還需要進一步探索。化療耐藥是一種多基因多水平多種因素共同作用的過程，有多種細胞信號傳導分子和途徑涉及藥物耐藥性，其中包括多藥耐藥基因(

MDR

1)、Bcl-2蛋白家族、AKT等凋亡相關基因。相關研究表明

MDR

1在腫瘤細胞中的高表達是產生腫瘤耐藥性以致化療失敗的重要原因，

MDR

1編碼一種跨膜相關的糖蛋白，類似于ATP依賴性的外排泵能夠將細胞內的藥物泵出體外，從而提高細胞耐藥性，而

OPTN

基因的表達下降或不表達能夠影響

MDR

1基因的表達上升。Bcl-2蛋白家族可以通過抑制毒性刺激后的細胞凋亡來誘導化學療法的耐藥性，從而防止細胞死亡。相關研究顯示，Bcl-2-a1在細胞系中的過度表達可增強對不同癌癥藥物的耐藥性，而

OPTN

基因的表達下降或不表達能夠影響B(tài)cl-2基因的表達上升。

AKT

基因參與線粒體介導的各種途徑的細胞凋亡, 通過磷酸化或者直接作用于細胞死亡因子來調節(jié)細胞凋亡。而相關研究表明

OPTN

基因可能通過抑制AKT蛋白表達, 從而借助于PI3K/AKT途徑促進腫瘤細胞的凋亡。其具體機制有待進一步研究。人

OPTN

基因位于10號染色體上，由5′UTR中的3個非編碼外顯子和13個外顯子組成，其表達的蛋白OPTN有577個氨基酸，大小為66 ku。OPTN具有膜運輸、維護高爾基體、胞吐作用和蛋白質分泌、細胞分裂控制等多種作用，在有關研究中OPTN被鑒定為選擇性自噬受體，可與多泛素化的底物結合，并將它們帶到和微管相關蛋白1的輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light 3，LC3)相互作用區(qū)的自噬體，可用于清除藥物、受損的線粒體和在ER處降解蛋白簇等功能。從公開可用的人類癌癥數(shù)據(jù)中查找到，

OPTN

基因在癌細胞均高表達，這與患者的生存率降低有關，同時也可能使

OPTN

成為有吸引力的治療靶標，對于腫瘤發(fā)生或腫瘤干性，在Ser177處OPTN的磷酸化起著關鍵作用，并在有絲分裂中起到巨大作用且誘導OPTN易位進入核，從而克服耐藥性和更具攻擊性的癌癥，本實驗中研究

OPTN

基因對卵巢癌細胞的增殖與耐藥機制的影響，并從實驗結果中可以看出

OPTN

基因的表達抑制了腫瘤細胞的增殖，降低了腫瘤細胞的耐藥性，將為臨床上的治療提供重要理論依據(jù)。

熱休克蛋白家族(heat shock proteins，HSP)是轉錄程序中主要的調控因子，作為分子伴侶，促進其他蛋白質的折疊、組裝、運輸和降解。相關研究表明熱休克因子1(heat shock transcription factor1，HSF1)、熱休克蛋白70(heat shock protein70，HSP70)在卵巢癌細胞中的高表達可能與癌癥的形成與轉移密切相關，HSF1、HSP70在癌細胞中的高表達可能通過提供對化學療法的抗性而導致腫瘤發(fā)生和轉移，在相關研究中表明HSF1不僅借助于保護癌癥中的蛋白質穩(wěn)態(tài)而起著一般促癌因子的作用，并且還起到破壞蛋白質穩(wěn)態(tài)和引起淀粉樣蛋白生成，可能是對抗惡性腫瘤的一種新型治療策略。HSP則可以通過外泌體被分泌到細胞外。胞外的HSP不僅可以通過外切體介導的傳輸誘導促炎性細胞因子，也可以抑制蛋白質錯誤折疊和聚集在受體細胞，通過HSP的非細胞自主作用，HSF1可通過產生炎性微環(huán)境并維持腫瘤的整體蛋白質組學穩(wěn)定性來促進腫瘤進展。

由于LfcinB 4-9對正常細胞無毒性且來源廣泛，因而在臨床上有廣闊的應用前景，也為卵巢癌化療輔助藥物研發(fā)提供了新的方向。