吳柱，陳喬杰，羅炳，魏丹丹

（長(zhǎng)沙醫(yī)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410000）

車前草為車前科車前屬植物車前或平車前的干燥全草[1]，具有清熱利尿、通淋祛痰等功效[2]，車前草中含有大車前苷[3]、桃葉珊瑚苷、高車前苷、熊果酸、車前黃酮苷、車前草苷以及洋工香酚苷[4-5]等多種化學(xué)成分，2020版《中國(guó)藥典》中以大車前苷含量作為車前草藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。本研究通過單因素試驗(yàn)優(yōu)選車前草中大車前苷的最優(yōu)提取條件，旨在為車前草開發(fā)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器

P1202型高效液相色譜儀，大連依利特分析儀器有限公司；AL204電子天平，梅特勒-托利多公司；DF-101S恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義予華儀器有限公司；KQ300E超聲波清洗機(jī)，昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 試劑

大車前苷對(duì)照品，埃法生物科技有限公司，CAS號(hào)為104777-68-6；車前草，泰和中藥飲片有限公司，批號(hào)為19081601；乙腈、甲醇，色譜純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲醇、甲酸，分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇，分析純，天津市化學(xué)試劑廠；純化水，自制。

1.3 色譜條件

色譜柱WondaSil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相A：乙腈；流動(dòng)相B：0.1%甲酸-水溶液；梯度洗脫（0～5 min，19%A；6～10 min，19%～25%A；10～15 min，25%A；15～20 min，25%～45%A，20～30 min，45%A）；波長(zhǎng)：330 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

1.4 溶液的制備

稱取大車前苷對(duì)照品10.03 mg，放入10 mL容量瓶中，加甲醇定容，得濃度為1.003 mg/mL大車前苷對(duì)照品溶液。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取大車前苷對(duì)照品溶液，置于10 mL容量瓶中，分別制成 50.15 μg/mL、100.30 μg/mL、200.60 μg/mL、401.20 μg/mL 和 601.80 μg/mL 對(duì)照品溶液，按“1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄數(shù)據(jù)。以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)得到線性回歸方程為y=13.075x+32.838（R2=0.9992），大車前苷HPLC色譜圖如圖1所示。結(jié)果表明大車前苷在50.15～601.80 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，本方法可用于大車前苷含量測(cè)定。

圖1 大車前苷HPLC色譜圖

2 結(jié)果與分析

2.1 提取工藝單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 溶劑種類考察

取車前草粉末0.5 g，置具塞錐形瓶中，加入溶劑20 mL，稱重，超聲提取30 min，放冷至室溫，補(bǔ)足減失重量，混勻，過濾，按“1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，結(jié)果見表1。由表1可知，以甲醇作為提取溶劑，車前草中大車前苷提取量最高，達(dá)1.025%，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用甲醇為提取溶劑。

表1 溶劑種類考察

2.1.2 甲醇濃度考察

取車前草粉末0.5 g，置具塞錐形瓶中，分別加入不同濃度甲醇溶液20 mL，按“2.1.1”項(xiàng)下提取、進(jìn)樣，結(jié)果見表2。由表2可知，以60%濃度甲醇作為提取溶劑，大車前苷提取量最高，可達(dá)1.765%，采用60%濃度甲醇為提取溶劑進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)考察。

表2 甲醇濃度考察

2.1.3 提取方法考察

取車前草粉末0.5 g，置具塞錐形瓶中，加入60%甲醇20 mL，稱重，采用不同提取法提取30 min，冷卻至室溫，補(bǔ)足減失重量，混勻，過濾，按“1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，結(jié)果見表3。由表3可知，采用回流提取對(duì)大車前苷提取效率最高，因此采用回流提取法進(jìn)行下一步考察。

表3 提取方法考察

2.1.4 提取時(shí)間考察

取車前草粉末0.5 g，置具塞錐形瓶中，加入60%甲醇20 mL，稱重，回流提取一定時(shí)間后，冷卻至室溫，補(bǔ)足減失重量，過濾，按“1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，結(jié)果見表4。由表4可知，大車前苷隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，提取量逐步增多，當(dāng)提取時(shí)間為45 min時(shí)，其提取量不再隨時(shí)間延長(zhǎng)有明顯差異，結(jié)合時(shí)間效率關(guān)系，故選用45 min作為最佳提取時(shí)間。

表4 提取時(shí)間考察

2.1.5 溶劑用量考察

取車前草粉末0.5 g，分別加入不同體積的60%甲醇溶液，稱重，回流提取45 min后，冷卻至室溫，補(bǔ)足減失重量，過濾，按“1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，結(jié)果見表5。由表5可知，隨著溶劑用量的增加，大車前苷提取量也逐漸增加，當(dāng)溶劑用量為30 mL和40 mL時(shí)，大車前苷提取量無明顯差異，結(jié)合經(jīng)濟(jì)效益考慮，提取溶劑用量采用30 mL。

表5 溶劑用量考察

2.2 驗(yàn)證試驗(yàn)

取10倍量車前草粉末，置具塞錐形瓶中，按質(zhì)量體積比1∶60（g∶mL）加入300 mL 60%的甲醇溶液，稱重，回流提取45 min后，冷卻至室溫，補(bǔ)足減失重量，過濾，按“1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄數(shù)據(jù)，結(jié)果見表6。由表6可知，6批樣品大車前苷平均濃度為0.4192 mg/mL，RSD值為0.35%，表明優(yōu)化得到的提取工藝穩(wěn)定、可靠。

表6 樣品含量測(cè)定表

3 結(jié)論與討論

本次實(shí)驗(yàn)分別考察了甲醇、乙醇、水3種溶劑對(duì)車前草中大車前苷提取量的影響，提取溶劑為水時(shí)，所得到的大車前苷提取量低、雜質(zhì)多，色譜檢測(cè)結(jié)果不理想；采用甲醇作為提取溶劑時(shí)，所提取的大車前苷含量高于乙醇的提取量，故選擇甲醇作為提取溶劑。

通過考察溶劑濃度、提取方法、提取時(shí)間以及溶劑用量對(duì)車前草中大車前苷提取量的影響，確定最佳提取條件為60%的甲醇作為溶劑，樣品與溶劑質(zhì)量體積比1∶60（g∶mL），回流提取45 min。通過驗(yàn)證試驗(yàn)可知，該提取工藝穩(wěn)定、可靠。