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        超濾液用量對C群腦膜炎奈瑟球菌精制多糖質量的影響

        2021-11-08 09:50:24買學宏宋澤玉趙友晨劉鈺馮佳麗
        生物化工 2021年5期
        關鍵詞:奈瑟精制內毒素

        買學宏,宋澤玉,趙友晨,劉鈺,馮佳麗

        (蘭州生物制品研究所有限責任公司菌苗一室 甘肅省疫苗工程技術研究中心,甘肅蘭州 730046)

        作為重要的有機化工基礎原料,苯酚在石油精煉、皮革制造、樹脂合成、香料生產等行業(yè)廣泛應用,是一種難降解的有機物,即使低濃度也會造成環(huán)境污染及人類健康危害[1-2]。在制藥行業(yè),A群、C群腦膜炎奈瑟球菌精制多糖的制備過程中也通常采用苯酚法抽提去除細菌蛋白質,再通過超濾的方法去除苯酚殘留[3]。

        超濾是一種膜分離過程,利用膜表面孔徑機械篩分作用,在壓力作用下截留溶液中相對分子質量較高的物質,而小分子的溶質透過膜的分離過程[4-5]。超濾技術的優(yōu)點是操作簡便,成本低廉,尤其是超濾技術的實驗條件溫和,不會引起溫度和pH的變化,可以防止生物大分子的降解[6]。苯酚及其化合物是一種有中等毒性的物質。低濃度的苯酚可深入內部組織,侵犯神經(jīng)中樞,刺激脊髓,最終導致全身中毒;而高濃度的苯酚進入人體,會引起急性中毒,甚至造成昏迷和死亡。因此,在中國藥典中對于苯酚殘留量有嚴格的規(guī)定。

        本研究通過對C群腦膜炎奈瑟球菌多糖苯酚法去蛋白后的多糖液進行超濾,研究不同的超濾液用量對C群腦膜炎奈瑟球菌精制多糖苯酚殘留量和對多糖分子量、回收率、細菌內毒素和精糖收率的影響。以期為超濾在多糖精制中的運用提供借鑒依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 試劑

        氯化鈣、硫代硫酸鈉、溴酸鉀、溴化鉀、鹽酸、碘化鉀、無水碳酸鈉、淀粉等,均為分析純,購自國藥集團化學試劑有限公司。

        1.2 儀器

        Pellicon型超濾器,美國MILLIPORE;AKTA purifier10型層析系統(tǒng),美國Cytiva;BET-72M型細菌內毒素檢測儀,天津天大天發(fā)儀器設備有限公司。

        1.3 多糖液的超濾

        1.3.1 氯化鈣溶液的配制

        氯化鈣溶液(4 mol/L)配制:稱取4 440 g無水氯化鈣加水10 L溶解。使用前,將4 mol/L氯化鈣溶液稀釋至0.5 mol/L。

        1.3.2 超濾方法

        使用滅菌注射用水對超濾器和管道進行預沖洗。確定膜包已完全潤濕,檢測膜包的完整性及水通量(NWP)。進液管和截留管放入多糖液中,透過液管放入廢液桶。開始超濾,不斷調節(jié)泵速保持進口壓力不大于20 psi,待多糖液濃縮至少量時,加入5 L超濾液,繼續(xù)超濾。待多糖液濃縮至少量時再次加入5 L超濾液。重復上述步驟,總計加入50 L超濾液。在超濾液用量達到20 L、30 L、40 L和50 L時,分別從截留管處取5 mL多糖液檢測苯酚的殘留量。

        用相同的超濾方法超濾20批粗制多糖,其中10批在超濾液用量達到20 L時收獲精制多糖,剩余10批在超濾液用量達到50 L時收獲精制多糖。檢測多糖分子量、多糖回收率、細菌內毒素等指標。

        1.4 苯酚殘留量檢測方法

        1.4.1 苯酚殘留量測定

        用移液器量取供試樣品1 mL,置具塞錐形瓶中,加去離子水50 mL,加入0.02 mol/L溴溶液15 mL,沿瓶壁加入6 mol/L鹽酸溶液10 mL,搖勻,密塞,避光放置30 min后,稍啟瓶塞,加25%碘化鉀溶液2 mL于瓶頸,使流下,密塞,搖勻。以少量去離子水洗瓶頸,用0.02 mol/L硫代硫酸鈉滴定液滴定至近終點時,加淀粉指示液約0.5 mL,滴定至藍色消失。試驗設置空白對照,用1 mL去離子水代替供試樣品[7]。

        1.4.2 苯酚殘留量的計算

        苯酚殘留量的計算公式為:

        式(1)中:V0為空白試驗消耗硫代硫酸鈉滴定液的體積,mL;V1為供試樣品消耗硫代硫酸鈉滴定液的體積,mL;C為硫代硫酸鈉滴定液的濃度,mol/L;15.69為苯酚相對分子質量的1/6;1.0為供試樣品取樣量,mL。

        1.5 分子量檢測

        取供試品1 mL,加至已標定的色譜柱中,用0.2 mol/L的氯化鈉洗脫,流速為0.35 mL/min,檢測波長為206 nm,通過分析206 nm的保留時間(第二峰保留時間)得出精制多糖的分子量及回收率。

        1.6 細菌內毒素檢測

        將樣品稀釋成無干擾的濃度,加入內毒素測定儀專用試管,立即放入反應器中開始檢測。待最后一個濃度點的反應曲線超過限值后,停止檢測,計算數(shù)據(jù),得出樣品的細菌內毒素值。

        2 結果與分析

        2.1 超濾液用量對苯酚殘留量的影響

        連續(xù)對6批C群腦膜炎奈瑟球菌多糖粗制品進行超濾精制,每批對超濾液用量達到20 L、30 L、40 L和50 L時的多糖液進行取樣并檢測其苯酚殘留量,檢測結果見表1。

        表1 超濾液用量對苯酚殘留量的影響(單位:g/L)

        對表1的實驗結果進行統(tǒng)計整理得圖1。由圖1可知,隨超濾液用量從20 L增加至50 L,精制多糖中的苯酚殘留量從0.01283 g/L降至0 g/L。經(jīng)單因素方差分析(ANOVA)發(fā)現(xiàn),超濾液用量的改變對精制多糖苯酚殘留量的影響為極顯著水平。經(jīng)組間多重比較分析可知,超濾液用量20 L與40 L、50 L之間存在顯著性差異;30 L與50 L之間存在顯著性差異。

        圖1 隨超濾液用量增加苯酚殘留量的變化趨勢

        2.2 超濾液用量對精制多糖的影響

        用20 L超濾液和50 L超濾液各純化10批粗制多糖,收獲精制多糖后對其多糖分子量、多糖回收率、細菌內毒素和收率等指標進行檢測,檢測結果見表2。

        表2 超濾液用量對精制多糖的影響

        利用配對t檢驗研究超濾液用量對各生產指標的影響[8-9]。從表3可以看出,除內毒素指標外,其余4組指標之間均有顯著差異(p<0.05),其中超濾液20 L處理的多糖分子量和回收率顯著高于50 L處理組;而50 L超濾液處理后,苯酚殘留量顯著降低,精糖收率則顯著提高。

        表3 超濾液用量對多糖影響的t檢驗結果

        配對t檢驗顯示各生產指標在超濾量為20 L和50 L時呈現(xiàn)出顯著性差異(p<0.05),因此使用效應量(Effect size)研究差異幅度情況。使用Cohen'sd值表示效應量大小,Cohen's d值越大說明差異越大,效應量小、中、大的區(qū)分臨界點分別是0.20、0.50和0.80[8-9]。從表3的Cohen'sd值可以得出:除內毒素之外,50 L超濾處理組在多糖分子量、多糖回收率、苯酚殘留量和精糖收率4個生產指標與20 L超濾處理組均體現(xiàn)出大效應量。

        3 討論與結論

        以往在C群腦膜炎奈瑟球菌精制多糖純化過程中,超濾液用量為20 L的0.5 mol/L氯化鈣溶液,純化后精多糖的苯酚殘留量控制在可接受水平。但隨著《中國藥典 三部》(2020版)的頒布,對于苯酚殘留量的規(guī)定更為嚴格(不高于6.0 mg/g)。

        本次試驗表明,超濾液用量的改變對多糖液中苯酚殘留量有顯著性影響。當超濾液用量達到50 L時,多糖液中的苯酚殘留量降為0 g/L,獲得的精制多糖分子量升高;精制多糖收率略有升高,說明增大超濾液的使用量不會對精制多糖造成損失。綜合分析,當超濾液使用量為50 L時,完全消除了苯酚殘留對精制多糖質量影響,同時多糖分子量增大且不影響精制多糖收率,對提升產品質量及保障生產的平穩(wěn)運行是大有裨益的。

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