買學(xué)宏，宋澤玉，趙友晨，劉鈺，馮佳麗

（蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司菌苗一室 甘肅省疫苗工程技術(shù)研究中心，甘肅蘭州 730046）

作為重要的有機(jī)化工基礎(chǔ)原料，苯酚在石油精煉、皮革制造、樹脂合成、香料生產(chǎn)等行業(yè)廣泛應(yīng)用，是一種難降解的有機(jī)物，即使低濃度也會(huì)造成環(huán)境污染及人類健康危害[1-2]。在制藥行業(yè)，A群、C群腦膜炎奈瑟球菌精制多糖的制備過(guò)程中也通常采用苯酚法抽提去除細(xì)菌蛋白質(zhì)，再通過(guò)超濾的方法去除苯酚殘留[3]。

超濾是一種膜分離過(guò)程，利用膜表面孔徑機(jī)械篩分作用，在壓力作用下截留溶液中相對(duì)分子質(zhì)量較高的物質(zhì)，而小分子的溶質(zhì)透過(guò)膜的分離過(guò)程[4-5]。超濾技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便，成本低廉，尤其是超濾技術(shù)的實(shí)驗(yàn)條件溫和，不會(huì)引起溫度和pH的變化，可以防止生物大分子的降解[6]。苯酚及其化合物是一種有中等毒性的物質(zhì)。低濃度的苯酚可深入內(nèi)部組織，侵犯神經(jīng)中樞，刺激脊髓，最終導(dǎo)致全身中毒；而高濃度的苯酚進(jìn)入人體，會(huì)引起急性中毒，甚至造成昏迷和死亡。因此，在中國(guó)藥典中對(duì)于苯酚殘留量有嚴(yán)格的規(guī)定。

本研究通過(guò)對(duì)C群腦膜炎奈瑟球菌多糖苯酚法去蛋白后的多糖液進(jìn)行超濾，研究不同的超濾液用量對(duì)C群腦膜炎奈瑟球菌精制多糖苯酚殘留量和對(duì)多糖分子量、回收率、細(xì)菌內(nèi)毒素和精糖收率的影響。以期為超濾在多糖精制中的運(yùn)用提供借鑒依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑

氯化鈣、硫代硫酸鈉、溴酸鉀、溴化鉀、鹽酸、碘化鉀、無(wú)水碳酸鈉、淀粉等，均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器

Pellicon型超濾器，美國(guó)MILLIPORE；AKTA purifier10型層析系統(tǒng)，美國(guó)Cytiva；BET-72M型細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)儀，天津天大天發(fā)儀器設(shè)備有限公司。

1.3 多糖液的超濾

1.3.1 氯化鈣溶液的配制

氯化鈣溶液（4 mol/L）配制：稱取4 440 g無(wú)水氯化鈣加水10 L溶解。使用前，將4 mol/L氯化鈣溶液稀釋至0.5 mol/L。

1.3.2 超濾方法

使用滅菌注射用水對(duì)超濾器和管道進(jìn)行預(yù)沖洗。確定膜包已完全潤(rùn)濕，檢測(cè)膜包的完整性及水通量（NWP）。進(jìn)液管和截留管放入多糖液中，透過(guò)液管放入廢液桶。開始超濾，不斷調(diào)節(jié)泵速保持進(jìn)口壓力不大于20 psi，待多糖液濃縮至少量時(shí)，加入5 L超濾液，繼續(xù)超濾。待多糖液濃縮至少量時(shí)再次加入5 L超濾液。重復(fù)上述步驟，總計(jì)加入50 L超濾液。在超濾液用量達(dá)到20 L、30 L、40 L和50 L時(shí)，分別從截留管處取5 mL多糖液檢測(cè)苯酚的殘留量。

用相同的超濾方法超濾20批粗制多糖，其中10批在超濾液用量達(dá)到20 L時(shí)收獲精制多糖，剩余10批在超濾液用量達(dá)到50 L時(shí)收獲精制多糖。檢測(cè)多糖分子量、多糖回收率、細(xì)菌內(nèi)毒素等指標(biāo)。

1.4 苯酚殘留量檢測(cè)方法

1.4.1 苯酚殘留量測(cè)定

用移液器量取供試樣品1 mL，置具塞錐形瓶中，加去離子水50 mL，加入0.02 mol/L溴溶液15 mL，沿瓶壁加入6 mol/L鹽酸溶液10 mL，搖勻，密塞，避光放置30 min后，稍啟瓶塞，加25%碘化鉀溶液2 mL于瓶頸，使流下，密塞，搖勻。以少量去離子水洗瓶頸，用0.02 mol/L硫代硫酸鈉滴定液滴定至近終點(diǎn)時(shí)，加淀粉指示液約0.5 mL，滴定至藍(lán)色消失。試驗(yàn)設(shè)置空白對(duì)照，用1 mL去離子水代替供試樣品[7]。

1.4.2 苯酚殘留量的計(jì)算

苯酚殘留量的計(jì)算公式為：

式（1）中：V0為空白試驗(yàn)消耗硫代硫酸鈉滴定液的體積，mL；V1為供試樣品消耗硫代硫酸鈉滴定液的體積，mL；C為硫代硫酸鈉滴定液的濃度，mol/L；15.69為苯酚相對(duì)分子質(zhì)量的1/6；1.0為供試樣品取樣量，mL。

1.5 分子量檢測(cè)

取供試品1 mL，加至已標(biāo)定的色譜柱中，用0.2 mol/L的氯化鈉洗脫，流速為0.35 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為206 nm，通過(guò)分析206 nm的保留時(shí)間（第二峰保留時(shí)間）得出精制多糖的分子量及回收率。

1.6 細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)

將樣品稀釋成無(wú)干擾的濃度，加入內(nèi)毒素測(cè)定儀專用試管，立即放入反應(yīng)器中開始檢測(cè)。待最后一個(gè)濃度點(diǎn)的反應(yīng)曲線超過(guò)限值后，停止檢測(cè)，計(jì)算數(shù)據(jù)，得出樣品的細(xì)菌內(nèi)毒素值。

2 結(jié)果與分析

2.1 超濾液用量對(duì)苯酚殘留量的影響

連續(xù)對(duì)6批C群腦膜炎奈瑟球菌多糖粗制品進(jìn)行超濾精制，每批對(duì)超濾液用量達(dá)到20 L、30 L、40 L和50 L時(shí)的多糖液進(jìn)行取樣并檢測(cè)其苯酚殘留量，檢測(cè)結(jié)果見表1。

表1 超濾液用量對(duì)苯酚殘留量的影響（單位：g/L）

對(duì)表1的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)整理得圖1。由圖1可知，隨超濾液用量從20 L增加至50 L，精制多糖中的苯酚殘留量從0.01283 g/L降至0 g/L。經(jīng)單因素方差分析（ANOVA）發(fā)現(xiàn)，超濾液用量的改變對(duì)精制多糖苯酚殘留量的影響為極顯著水平。經(jīng)組間多重比較分析可知，超濾液用量20 L與40 L、50 L之間存在顯著性差異；30 L與50 L之間存在顯著性差異。

圖1 隨超濾液用量增加苯酚殘留量的變化趨勢(shì)

2.2 超濾液用量對(duì)精制多糖的影響

用20 L超濾液和50 L超濾液各純化10批粗制多糖，收獲精制多糖后對(duì)其多糖分子量、多糖回收率、細(xì)菌內(nèi)毒素和收率等指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見表2。

表2 超濾液用量對(duì)精制多糖的影響

利用配對(duì)t檢驗(yàn)研究超濾液用量對(duì)各生產(chǎn)指標(biāo)的影響[8-9]。從表3可以看出，除內(nèi)毒素指標(biāo)外，其余4組指標(biāo)之間均有顯著差異（p＜0.05），其中超濾液20 L處理的多糖分子量和回收率顯著高于50 L處理組；而50 L超濾液處理后，苯酚殘留量顯著降低，精糖收率則顯著提高。

表3 超濾液用量對(duì)多糖影響的t檢驗(yàn)結(jié)果

配對(duì)t檢驗(yàn)顯示各生產(chǎn)指標(biāo)在超濾量為20 L和50 L時(shí)呈現(xiàn)出顯著性差異（p＜0.05），因此使用效應(yīng)量（Effect size）研究差異幅度情況。使用Cohen'sd值表示效應(yīng)量大小，Cohen's d值越大說(shuō)明差異越大，效應(yīng)量小、中、大的區(qū)分臨界點(diǎn)分別是0.20、0.50和0.80[8-9]。從表3的Cohen'sd值可以得出：除內(nèi)毒素之外，50 L超濾處理組在多糖分子量、多糖回收率、苯酚殘留量和精糖收率4個(gè)生產(chǎn)指標(biāo)與20 L超濾處理組均體現(xiàn)出大效應(yīng)量。

3 討論與結(jié)論

以往在C群腦膜炎奈瑟球菌精制多糖純化過(guò)程中，超濾液用量為20 L的0.5 mol/L氯化鈣溶液，純化后精多糖的苯酚殘留量控制在可接受水平。但隨著《中國(guó)藥典 三部》（2020版）的頒布，對(duì)于苯酚殘留量的規(guī)定更為嚴(yán)格（不高于6.0 mg/g）。

本次試驗(yàn)表明，超濾液用量的改變對(duì)多糖液中苯酚殘留量有顯著性影響。當(dāng)超濾液用量達(dá)到50 L時(shí)，多糖液中的苯酚殘留量降為0 g/L，獲得的精制多糖分子量升高；精制多糖收率略有升高，說(shuō)明增大超濾液的使用量不會(huì)對(duì)精制多糖造成損失。綜合分析，當(dāng)超濾液使用量為50 L時(shí)，完全消除了苯酚殘留對(duì)精制多糖質(zhì)量影響，同時(shí)多糖分子量增大且不影響精制多糖收率，對(duì)提升產(chǎn)品質(zhì)量及保障生產(chǎn)的平穩(wěn)運(yùn)行是大有裨益的。