買學(xué)宏,宋澤玉,趙友晨,劉鈺,馮佳麗
(蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司菌苗一室 甘肅省疫苗工程技術(shù)研究中心,甘肅蘭州 730046)
作為重要的有機(jī)化工基礎(chǔ)原料,苯酚在石油精煉、皮革制造、樹脂合成、香料生產(chǎn)等行業(yè)廣泛應(yīng)用,是一種難降解的有機(jī)物,即使低濃度也會(huì)造成環(huán)境污染及人類健康危害[1-2]。在制藥行業(yè),A群、C群腦膜炎奈瑟球菌精制多糖的制備過(guò)程中也通常采用苯酚法抽提去除細(xì)菌蛋白質(zhì),再通過(guò)超濾的方法去除苯酚殘留[3]。
超濾是一種膜分離過(guò)程,利用膜表面孔徑機(jī)械篩分作用,在壓力作用下截留溶液中相對(duì)分子質(zhì)量較高的物質(zhì),而小分子的溶質(zhì)透過(guò)膜的分離過(guò)程[4-5]。超濾技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便,成本低廉,尤其是超濾技術(shù)的實(shí)驗(yàn)條件溫和,不會(huì)引起溫度和pH的變化,可以防止生物大分子的降解[6]。苯酚及其化合物是一種有中等毒性的物質(zhì)。低濃度的苯酚可深入內(nèi)部組織,侵犯神經(jīng)中樞,刺激脊髓,最終導(dǎo)致全身中毒;而高濃度的苯酚進(jìn)入人體,會(huì)引起急性中毒,甚至造成昏迷和死亡。因此,在中國(guó)藥典中對(duì)于苯酚殘留量有嚴(yán)格的規(guī)定。
本研究通過(guò)對(duì)C群腦膜炎奈瑟球菌多糖苯酚法去蛋白后的多糖液進(jìn)行超濾,研究不同的超濾液用量對(duì)C群腦膜炎奈瑟球菌精制多糖苯酚殘留量和對(duì)多糖分子量、回收率、細(xì)菌內(nèi)毒素和精糖收率的影響。以期為超濾在多糖精制中的運(yùn)用提供借鑒依據(jù)。
氯化鈣、硫代硫酸鈉、溴酸鉀、溴化鉀、鹽酸、碘化鉀、無(wú)水碳酸鈉、淀粉等,均為分析純,購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。
Pellicon型超濾器,美國(guó)MILLIPORE;AKTA purifier10型層析系統(tǒng),美國(guó)Cytiva;BET-72M型細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)儀,天津天大天發(fā)儀器設(shè)備有限公司。
1.3.1 氯化鈣溶液的配制
氯化鈣溶液(4 mol/L)配制:稱取4 440 g無(wú)水氯化鈣加水10 L溶解。使用前,將4 mol/L氯化鈣溶液稀釋至0.5 mol/L。
1.3.2 超濾方法
使用滅菌注射用水對(duì)超濾器和管道進(jìn)行預(yù)沖洗。確定膜包已完全潤(rùn)濕,檢測(cè)膜包的完整性及水通量(NWP)。進(jìn)液管和截留管放入多糖液中,透過(guò)液管放入廢液桶。開始超濾,不斷調(diào)節(jié)泵速保持進(jìn)口壓力不大于20 psi,待多糖液濃縮至少量時(shí),加入5 L超濾液,繼續(xù)超濾。待多糖液濃縮至少量時(shí)再次加入5 L超濾液。重復(fù)上述步驟,總計(jì)加入50 L超濾液。在超濾液用量達(dá)到20 L、30 L、40 L和50 L時(shí),分別從截留管處取5 mL多糖液檢測(cè)苯酚的殘留量。
用相同的超濾方法超濾20批粗制多糖,其中10批在超濾液用量達(dá)到20 L時(shí)收獲精制多糖,剩余10批在超濾液用量達(dá)到50 L時(shí)收獲精制多糖。檢測(cè)多糖分子量、多糖回收率、細(xì)菌內(nèi)毒素等指標(biāo)。
1.4.1 苯酚殘留量測(cè)定
用移液器量取供試樣品1 mL,置具塞錐形瓶中,加去離子水50 mL,加入0.02 mol/L溴溶液15 mL,沿瓶壁加入6 mol/L鹽酸溶液10 mL,搖勻,密塞,避光放置30 min后,稍啟瓶塞,加25%碘化鉀溶液2 mL于瓶頸,使流下,密塞,搖勻。以少量去離子水洗瓶頸,用0.02 mol/L硫代硫酸鈉滴定液滴定至近終點(diǎn)時(shí),加淀粉指示液約0.5 mL,滴定至藍(lán)色消失。試驗(yàn)設(shè)置空白對(duì)照,用1 mL去離子水代替供試樣品[7]。
1.4.2 苯酚殘留量的計(jì)算
苯酚殘留量的計(jì)算公式為:
式(1)中:V0為空白試驗(yàn)消耗硫代硫酸鈉滴定液的體積,mL;V1為供試樣品消耗硫代硫酸鈉滴定液的體積,mL;C為硫代硫酸鈉滴定液的濃度,mol/L;15.69為苯酚相對(duì)分子質(zhì)量的1/6;1.0為供試樣品取樣量,mL。
取供試品1 mL,加至已標(biāo)定的色譜柱中,用0.2 mol/L的氯化鈉洗脫,流速為0.35 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)為206 nm,通過(guò)分析206 nm的保留時(shí)間(第二峰保留時(shí)間)得出精制多糖的分子量及回收率。
將樣品稀釋成無(wú)干擾的濃度,加入內(nèi)毒素測(cè)定儀專用試管,立即放入反應(yīng)器中開始檢測(cè)。待最后一個(gè)濃度點(diǎn)的反應(yīng)曲線超過(guò)限值后,停止檢測(cè),計(jì)算數(shù)據(jù),得出樣品的細(xì)菌內(nèi)毒素值。
連續(xù)對(duì)6批C群腦膜炎奈瑟球菌多糖粗制品進(jìn)行超濾精制,每批對(duì)超濾液用量達(dá)到20 L、30 L、40 L和50 L時(shí)的多糖液進(jìn)行取樣并檢測(cè)其苯酚殘留量,檢測(cè)結(jié)果見表1。
表1 超濾液用量對(duì)苯酚殘留量的影響(單位:g/L)
對(duì)表1的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)整理得圖1。由圖1可知,隨超濾液用量從20 L增加至50 L,精制多糖中的苯酚殘留量從0.01283 g/L降至0 g/L。經(jīng)單因素方差分析(ANOVA)發(fā)現(xiàn),超濾液用量的改變對(duì)精制多糖苯酚殘留量的影響為極顯著水平。經(jīng)組間多重比較分析可知,超濾液用量20 L與40 L、50 L之間存在顯著性差異;30 L與50 L之間存在顯著性差異。
圖1 隨超濾液用量增加苯酚殘留量的變化趨勢(shì)
用20 L超濾液和50 L超濾液各純化10批粗制多糖,收獲精制多糖后對(duì)其多糖分子量、多糖回收率、細(xì)菌內(nèi)毒素和收率等指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果見表2。
表2 超濾液用量對(duì)精制多糖的影響
利用配對(duì)t檢驗(yàn)研究超濾液用量對(duì)各生產(chǎn)指標(biāo)的影響[8-9]。從表3可以看出,除內(nèi)毒素指標(biāo)外,其余4組指標(biāo)之間均有顯著差異(p<0.05),其中超濾液20 L處理的多糖分子量和回收率顯著高于50 L處理組;而50 L超濾液處理后,苯酚殘留量顯著降低,精糖收率則顯著提高。
表3 超濾液用量對(duì)多糖影響的t檢驗(yàn)結(jié)果
配對(duì)t檢驗(yàn)顯示各生產(chǎn)指標(biāo)在超濾量為20 L和50 L時(shí)呈現(xiàn)出顯著性差異(p<0.05),因此使用效應(yīng)量(Effect size)研究差異幅度情況。使用Cohen'sd值表示效應(yīng)量大小,Cohen's d值越大說(shuō)明差異越大,效應(yīng)量小、中、大的區(qū)分臨界點(diǎn)分別是0.20、0.50和0.80[8-9]。從表3的Cohen'sd值可以得出:除內(nèi)毒素之外,50 L超濾處理組在多糖分子量、多糖回收率、苯酚殘留量和精糖收率4個(gè)生產(chǎn)指標(biāo)與20 L超濾處理組均體現(xiàn)出大效應(yīng)量。
以往在C群腦膜炎奈瑟球菌精制多糖純化過(guò)程中,超濾液用量為20 L的0.5 mol/L氯化鈣溶液,純化后精多糖的苯酚殘留量控制在可接受水平。但隨著《中國(guó)藥典 三部》(2020版)的頒布,對(duì)于苯酚殘留量的規(guī)定更為嚴(yán)格(不高于6.0 mg/g)。
本次試驗(yàn)表明,超濾液用量的改變對(duì)多糖液中苯酚殘留量有顯著性影響。當(dāng)超濾液用量達(dá)到50 L時(shí),多糖液中的苯酚殘留量降為0 g/L,獲得的精制多糖分子量升高;精制多糖收率略有升高,說(shuō)明增大超濾液的使用量不會(huì)對(duì)精制多糖造成損失。綜合分析,當(dāng)超濾液使用量為50 L時(shí),完全消除了苯酚殘留對(duì)精制多糖質(zhì)量影響,同時(shí)多糖分子量增大且不影響精制多糖收率,對(duì)提升產(chǎn)品質(zhì)量及保障生產(chǎn)的平穩(wěn)運(yùn)行是大有裨益的。