許斌洋，楊旭，趙德浚，楊財(cái)容，劉松青

（成都師范學(xué)院 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，四川成都 611130）

放線菌是土壤微生物中的一個(gè)主要類群，其數(shù)量、種類及活性會(huì)影響土壤生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能，進(jìn)而影響植物的生長(zhǎng)。與此同時(shí)，放線菌還是一類具有抑菌、抗腫瘤、酶抑制等重要活性的微生物資源，具有巨大的應(yīng)用前景[1]。如臨床上常用的氨基糖苷類、四環(huán)素類、糖肽類及大環(huán)內(nèi)酯類抗生素等均來自放線菌[1-3]。放線菌還可以合成多種有用的代謝產(chǎn)物，如維生素、淀粉酶、纖維素酶和氨基酸等，與人類的生產(chǎn)生活關(guān)系緊密[4]。隨著放線菌分離研究的不斷深入，大量常見菌株已被反復(fù)研究，因此從中發(fā)現(xiàn)新化合物的概率逐漸降低。為了更高效地發(fā)現(xiàn)新的微生物資源，人們逐漸把目光投向少有研究的特殊生態(tài)環(huán)境中，如海洋、動(dòng)物共生、植物內(nèi)生、根際土壤以及極端環(huán)境等，從而尋找具有較大利用價(jià)值的放線菌資源[5-9]。

青藏高原平均海拔4 000 m，地勢(shì)高亢，生態(tài)條件復(fù)雜，這決定了青藏高原放線菌資源具有其獨(dú)特性。本研究實(shí)驗(yàn)材料選擇川西高原的垂穗披堿草根際土壤，目前對(duì)該地區(qū)較為常見的垂穗披堿草根際土壤放線菌的系統(tǒng)研究較少。而垂穗披堿草又是川西高原的優(yōu)勢(shì)草種，分布廣泛，可能是由于放線菌產(chǎn)生活性物質(zhì)，與垂穗披堿草互利共生，相互影響、相互作用。通過對(duì)放線菌的形態(tài)特征觀察、生理生化鑒定、16S rRNA基因擴(kuò)增比對(duì)以及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，篩選出拮抗病原菌的放線菌，為垂穗披堿草牧草的生長(zhǎng)生產(chǎn)提供理論依據(jù)，這對(duì)川西高原畜牧業(yè)的發(fā)展和生態(tài)環(huán)境保護(hù)具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤樣品

實(shí)驗(yàn)材料的土壤樣品共6份，分別采自川西高原的查真梁子（經(jīng)緯度為N32°67'25''、E102°11'59''，海拔4 345 m）、紅原草原（經(jīng)緯度為N32°34'22'、E102°23'12'，海拔3 920 m）、紅原草甸（經(jīng)緯度為 N32° 90'18'、E101° 15'53''，海 拔 3 595 m）、安曲鄉(xiāng)（經(jīng)緯度為 N32° 66'21'、E102° 26'17'，海拔3 455 m）、查理鄉(xiāng)（經(jīng)緯度為N32°76'34'、E102°05'49'，海拔3 299 m）以及馬塘溝（經(jīng)緯度為N31° 53'62'、E102° 37'43'，海拔 3 100 m），編號(hào)依次為1、2、3、4、5、6。采集土樣均為0～12 cm的表層土樣，分別用無菌袋裝好放于實(shí)驗(yàn)室4 ℃冰箱保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

改良高氏一號(hào)培養(yǎng)基、l/10BeIlllette agar培養(yǎng)基、腐殖酸培養(yǎng)基、改良淀粉脯氨酸培養(yǎng)基、低營(yíng)養(yǎng)礦物鹽培養(yǎng)基以及高氏一號(hào)培養(yǎng)基。

1.2 儀器

LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；BCD-248WBSV型立式冷藏箱，青島海爾股份有限公司；PYX-DHS型隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；SJ-CJ-1F型超凈工作臺(tái)，蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司；JA3003精密電子天平, 上海良平儀器儀表有限公司；SKY-100C型恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種分離

采用土壤懸浮液稀釋涂布平板法分離菌種。從混勻的各備用土樣中隨機(jī)稱取1 g自然風(fēng)干的垂穗披堿草根際土壤，在研缽中研磨，通過100 ℃高溫1 h烘干，在準(zhǔn)備好的帶有磁珠的99 mL無菌水中低速搖床（170 r/min，30 ℃）處理1 h，再微波處理30 s混勻后得到稀釋100倍的土壤懸浮液。取1 mL稀釋100倍的土壤懸浮液加入到9 mL無菌水的試管中，混合搖勻得到稀釋1 000倍的土壤懸浮液。取1 mL稀釋1 000倍的土壤懸浮液同樣加入到9 mL無菌水的試管中，混合搖勻后得到稀釋10 000倍的土壤懸浮液。取搖勻后的土樣懸液0.2 mL，涂布于分離平板上，28℃培養(yǎng)2周，得到單菌落。

1.3.2 菌種純化和保藏

通過28 ℃溫度條件下在15 d的培養(yǎng)皿上挑選單個(gè)菌落，在改良高氏一號(hào)培養(yǎng)基平板上接種，用平板劃線法純化菌株，并挑取純菌株的單菌落接種于改良的高氏一號(hào)培養(yǎng)基的斜面上作為菌種的初步保藏。將純化后的菌株用高氏一號(hào)液體培養(yǎng)基在28 ℃，搖床中轉(zhuǎn)速170 r/min下培養(yǎng)3～5 d，配制好濃度的50%的甘油，將甘油與菌液按體積比1∶1（V∶V）混合，保藏于-80 ℃冰箱中。

1.3.3 放線菌的形態(tài)學(xué)鑒定

將保藏于-80 ℃的菌株活化，在改良高氏一號(hào)培養(yǎng)基進(jìn)行插片培養(yǎng)法進(jìn)行觀察，并記錄肉眼可觀察的放線菌菌落特征，如基內(nèi)菌絲顏色、氣生菌絲顏色、菌落表面含水狀態(tài)以及色素產(chǎn)生情況等。

1.3.4 放線菌對(duì)病原菌的抑菌活性的測(cè)定

1.3.4.1 菌懸液的制備

將病原菌大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞桿菌、枯草芽孢桿菌4株菌接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，37 ℃活化24 h，然后液體培養(yǎng)得到菌懸液。

1.3.4.2 抑菌活性的測(cè)定

每個(gè)培養(yǎng)皿加入100 μL病原菌的菌懸液，均勻涂布，通過牛津杯法[10]，每皿內(nèi)豎放3個(gè)牛津杯，每個(gè)牛津杯加入200 μL放線菌的樣品制備液（每個(gè)重復(fù)3次）。

1.3.5 生理生化鑒定

（1）唯一碳源的利用：鑒定實(shí)驗(yàn)菌株對(duì)不同碳源的利用情況。（2）明膠液化試驗(yàn)：測(cè)定菌種產(chǎn)生蛋白酶的能力。（3）硝酸鹽還原試驗(yàn)：測(cè)定菌種對(duì)硝酸鹽的還原能力。（4）纖維素分解試驗(yàn)：測(cè)定菌種產(chǎn)生纖維素酶的能力。（5）硫化氫的產(chǎn)生：檢測(cè)菌株生長(zhǎng)過程中是否產(chǎn)生H2S[11-13]。

1.3.6 DNA的提取及16S rRNA基因PCR擴(kuò)增

采用細(xì)菌DNA抽提試劑盒（上海生工生物股份有限公司）提取基因組DNA，擴(kuò)增引物為通用引物，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，在NCBI上進(jìn)行序列比對(duì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)觀察及培養(yǎng)特征

從川西高原的6個(gè)土壤樣品中分離5株放線菌，分別命名為YX1、YX2、YX3、YX4、YX5，觀察菌落形態(tài)和菌絲形態(tài)，可以發(fā)現(xiàn)5株菌落均為圓形，有皺褶，其表面干燥，菌落周圍有輻射。菌株的菌絲粗細(xì)不一，長(zhǎng)短不同，分支多而且孢子絲不易觀察，結(jié)果如表1。

表1 土壤放線菌的菌落特征與菌絲形態(tài)

2.2 土壤放線菌的抑菌活性的測(cè)定

通過牛津杯法測(cè)定菌株發(fā)酵液的抑菌活性，結(jié)果見表2。5株菌中，YX1、YX2和YX5的抑菌效果較突出，YX1能夠抑制大腸桿菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)，其中對(duì)大腸桿菌的抑制效果較好；YX2能夠抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌，其中對(duì)大腸桿菌的抑制效果較好；YX3只對(duì)枯草芽孢桿菌有抑菌效果；YX4只對(duì)銅綠假單胞菌有抑菌效果；YX5能夠抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)，其中對(duì)大腸桿菌的抑制效果較好，對(duì)枯草芽孢桿菌抑菌效果較低敏。

表2 土壤放線菌發(fā)酵液對(duì)4種病原菌抑制效果

2.3 土壤放線菌的生理生化鑒定

參照放線菌生理生化鑒定方法對(duì)5株放線菌進(jìn)行生理生化鑒定，鑒定結(jié)果如表3。

表3 各菌株生理生化鑒定結(jié)果

由表3可以看出，所有的菌株均能使淀粉水解，都不能產(chǎn)生H2S和黑色素，均能使明膠液化和牛奶胨化，均能利用葡萄糖，均不能利用蔗糖，只有菌株YX3可以使纖維素分解，只有菌株YX5不能利用果糖，只有YX1和YX3能使硝酸鹽還原。

2.4 土壤放線菌16S rRNA基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

用試劑盒法提取菌株的DNA，經(jīng)過PCR擴(kuò)增，得到菌株16S rRNA基因序列片段，用瓊脂糖凝膠電泳儀對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，凝膠成像儀進(jìn)行觀察拍照，發(fā)現(xiàn)1 500 bp相應(yīng)位置都有均一、明亮條帶出現(xiàn)，擴(kuò)增結(jié)果如圖1，這表明PCR擴(kuò)增成功，低溫保存。

圖1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳

2.5 土壤放線菌系統(tǒng)發(fā)育分析

將PCR產(chǎn)物純化后直接送至上海生工生物股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。根據(jù)16S rRNA測(cè)序結(jié)果，登陸NCBI在線查詢，對(duì)YX1～YX5的序列進(jìn)行Blast分析（采用16S rRNA序列對(duì) GenBank中的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜索），找到其中序列相似性最高的序列（表4），在菌株的16S rRNA序列同源性高達(dá)95%時(shí)可以認(rèn)為屬同一屬，當(dāng)序列同源性高達(dá)97%以上可認(rèn)為屬于同一種[14]。通過5株分離菌株的16S rRNA序列測(cè)序結(jié)果及其同源菌株在GenBank 中公布的16S rRNA 序列，利用Mega 5軟件采用Neighbor-joining法構(gòu)建出系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖2。由系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析可以看出，YX1、YX2、YX4與Streptomyces rishiriensis（NR_044141.1）和Streptomyces rishiriensis（NR_112392.1）親緣關(guān)系較近；YX3與Streptomyces sindenensis（NR_115441.1）聚在一起，可能屬于該菌株；YX5與Streptomyces alboviridis（NR_115374.1）親緣關(guān)系較近。

表4 5株菌株16S rRNA基因序列比對(duì)結(jié)果

圖2 基于鄰接法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

根據(jù)16S rRNA序列同源性分析結(jié)果顯示，結(jié)合生理生化特征和系統(tǒng)發(fā)育分析，將YX1、YX2、YX4鑒 定為Streptomyces rishiriensis；YX3鑒 定 為Streptomyces sindenensis；YX5鑒定為Streptomyces alboviridis；YX1～YX5均為鏈霉菌屬（Streptomyces）。

3 討論

本次實(shí)驗(yàn)從川西高原地區(qū)6份土壤中分離純化得到了5株放線菌，通過對(duì)5株放線菌的形態(tài)特征觀察、生理生化鑒定和16S rRNA基因擴(kuò)增比對(duì)以及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，最終鑒定出這5株菌的屬，均為鏈霉菌屬（Streptomyces）。鏈霉菌是產(chǎn)生抗生素活性物質(zhì)最多的一類放線菌，由前人的研究可知，迄今已知的抗生素中，有51%是由鏈霉菌產(chǎn)生的[15]。不少抗生素已用于防治植物上的有害病菌，如井岡霉素、春雷霉素等用于防治植物真菌性病害[16]。在本研究中可以發(fā)現(xiàn)，在川西高原地區(qū)存在重要的具有進(jìn)一步研究開發(fā)價(jià)值的放線菌資源，尤其是鏈霉菌資源，是農(nóng)用和畜牧業(yè)抗生素產(chǎn)生菌的重要分離資源和種質(zhì)資源庫(kù)，對(duì)于發(fā)展畜牧業(yè)和生態(tài)環(huán)境建設(shè)有著重要的研究?jī)r(jià)值。

本研究在分離根際土壤放線菌的基礎(chǔ)上對(duì)放線菌進(jìn)行了生理生化鑒定，可以發(fā)現(xiàn)，5株菌株的淀粉水解能力、明膠液化能力、牛奶胨化能力均較強(qiáng)，而纖維素分解能力較弱，僅只有YX3能夠使纖維素分解，5株菌株不能產(chǎn)H2S，說明均無分解含硫有機(jī)物的能力。這與來航線等[17]分離的放線菌生理生化試驗(yàn)結(jié)果相似。這些菌株對(duì)于淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶的開發(fā)應(yīng)用提供了研究材料，后期可進(jìn)一步詳細(xì)研究菌株的產(chǎn)酶條件等相關(guān)酶學(xué)性質(zhì)，對(duì)其進(jìn)行處理改造提高酶的活力和產(chǎn)量，為酶工業(yè)生產(chǎn)提供更多微生物資源。

本研究發(fā)現(xiàn)土壤中放線菌種類和數(shù)量較少，但根據(jù)葉景靜等[18]在廣西茅尾海紅樹林植物根際土壤中發(fā)現(xiàn)放線菌共88株，有6目8科9屬；羅亞軍等[19]在西藏沙棘根瘤及根際土壤中分離放線菌共112株，有7目12科23屬，而本次實(shí)驗(yàn)只分離出5株鏈霉菌屬的菌株，說明土壤中還有更多的放線菌還未分離出來，樊炳君等[20]通過分離桉樹根際土壤放線菌研究發(fā)現(xiàn)，不同培養(yǎng)基上放線菌的生長(zhǎng)情況和數(shù)量差異很大。其中，以采樣地土壤制成的培養(yǎng)基放線菌的出菌率最高，推測(cè)可能是由于桉樹大量吸收養(yǎng)分而形成的貧營(yíng)養(yǎng)環(huán)境的選擇作用使得適應(yīng)寡營(yíng)養(yǎng)的放線菌類群占據(jù)了絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的原因。未來將通過增加篩選培養(yǎng)基的種類和改變抑制劑的種類和配比，來改善放線菌數(shù)量和種類較少的問題，爭(zhēng)取從川西高原篩選到更多有價(jià)值的放線菌。羅亞軍等[19]對(duì)西藏沙棘根瘤及根際土壤放線菌進(jìn)行抗菌活性研究發(fā)現(xiàn)，有17株菌至少對(duì)一種檢定菌有抗菌活性；潘文娟等[21]對(duì)西藏湖泊放線菌進(jìn)行抗菌活性測(cè)定發(fā)現(xiàn)，有55株菌至少對(duì)一種檢定菌有抗菌活性，這表明放線菌能產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)，抑制病原菌生長(zhǎng)。本次研究通過牛津杯法對(duì)放線菌進(jìn)行4種病原菌的抑菌活性的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)YX1、YX2和YX5的抑菌效果較好。這些具有抑菌抗性的放線菌還可以進(jìn)一步研究其促生功能、抗逆性作用、功能基因以及抗菌活性產(chǎn)物與其藥用價(jià)值間的關(guān)系，全面而系統(tǒng)地揭示川西高原垂穗披堿草根際土壤放線菌的藥用價(jià)值與應(yīng)用前景，達(dá)到保護(hù)垂穗披堿草資源的目的。因此，在后續(xù)的研究工作中，可進(jìn)一步對(duì)這些菌株的抗菌活性進(jìn)行測(cè)定，研究其產(chǎn)生抗菌活性的物質(zhì)，揭示其次生代謝產(chǎn)物的化學(xué)組成，力求從中發(fā)現(xiàn)具有較好應(yīng)用價(jià)值的新型活性物質(zhì)，為新藥的開發(fā)提供依據(jù)。另可針對(duì)禾本科常見的病原菌篩選出較好拮抗活性的微生物資源并制作相應(yīng)產(chǎn)品進(jìn)行應(yīng)用，將有助于川西高原草場(chǎng)的改良，有利于促進(jìn)我國(guó)的畜牧業(yè)發(fā)展和環(huán)境保護(hù)事業(yè)。