宋海俠，岳曉華，張小平，祁海燕，孫少伯，王碧瑩，耿廣琴

（1.甘肅省腫瘤醫(yī)院 甘肅 蘭州 730050；2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué) 甘肅 蘭州 730000）

嵌合抗原受體（Chimeric antigen receptor,CAR）是由抗原識別部分和T 細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)域組成的融合蛋白［1］。以B 細胞標記物CD19 為靶點的CAR-T 細胞的臨床試驗已顯示出對多種血液系統(tǒng)惡性腫瘤的明顯療效［2］，包括急性淋巴細胞白血病、慢性淋巴細胞白血病、淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤等。

粘蛋白1（mucin 1,cell surface associated,MUC-1）是人類MUC-1 基因編碼的一種Ⅰ型跨膜蛋白，正常情況下主要表達于多種組織、器官中上皮細胞近管腔或腺腔面。最近研究表明，MUC-1 的一種同種型MUC1/Y 的表達具有腫瘤特異性，其在乳腺癌組織中表達，而相應(yīng)癌旁組織不表達［3］。由于MUC-1 在腫瘤組織中的異常表達，使其成為一種潛在的腫瘤治療生物學(xué)標志物。本研究使用目前應(yīng)用最廣泛的CD19 細胞，導(dǎo)入MUC-1 CAR基因，評價dnPD-1（MUC-1+CD19）CAR-T 靶向治療復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性乳腺癌的有效性、安全性、耐受性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019 年4 月至2019 年11 月在甘肅省腫瘤醫(yī)院治療的1 例PD-L1 陽性（見圖1）乳腺癌患者作為研究對象，年齡43 歲，左側(cè)乳房發(fā)病，臨床分期rT2N3M1，CAR-T 治療前接受既往手術(shù)治療、常規(guī)放療、化療，多周期解救化療。免疫組織化學(xué)檢測腫瘤細胞ER（2+,70%）、PR（1+,5%），C-erbB-2（3+），Ki-67（+30%），GCDFP15-60（散在+），GATA-3（+），CK7（+），符合乳腺來源。納入標準：①病理學(xué)確診是乳腺癌；②轉(zhuǎn)移性乳腺癌，既往接受過＞2～4 個化療方案或者多線內(nèi)分泌治療，目前無標準治療方案；③經(jīng)申辦方認可的實驗室免疫組織化學(xué)測定MUC-1 表達≥1+，PDL陽性；④按RECIST 1.1 版標準≥1 個顱外可測量病灶，可測量病灶未接受過放療；⑤研究開始前4周內(nèi)未接受過化療、放療、分子靴向治療及手術(shù)，并己從前面治療的急性毒性反應(yīng)中恢復(fù)，脫發(fā)及外周神經(jīng)毒性除外；⑥預(yù)計生存期≥6 個月；⑦主要器官功能正常，即符合下列標準：a.ECOG 體能狀態(tài)評分為0～2；b.血常規(guī)檢查標準需符合：血紅蛋白≥90 g/L（14 d 內(nèi)未輸血），中性粒細胞≥1.5×109/L，血小板≥80×109/L；c.生物化學(xué)檢查需符合以下標準：總膽紅素≤1.5×正常值上限（ULN），谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）≤2.5×ULN，如有肝轉(zhuǎn)移，則ALT 和AST≤5×ULN，血清肌酐≤1×ULN，內(nèi)生肌酐清除率＞50 mL/min（Cockcroft-Gault 公式）；⑧育齡婦女須在入組前7 d內(nèi)進行妊娠實驗（血清或尿液），且結(jié)果為陰性，愿意在實驗期間和末次給予CAR-T 后8 周采用適當?shù)姆椒ū茉校ń邮芰私^育術(shù)或絕經(jīng)后＞2 年的女性可認定為不具有生育能力）；⑨受試者自愿加入本研究，簽署知情同意書，依從性好，配合隨訪。排除標準：①既往5 年內(nèi)有其他惡性腫瘤病史，但已治愈的皮膚基底細胞癌和宮頸原位癌除外；②既往接受過MUC-1 靶向治療、嵌合抗原受體治療或其他轉(zhuǎn)基因T 細胞治療；③妊娠或哺乳期婦女；④研究開始前4 周內(nèi)參加過其他藥物臨床試驗；⑤患有高血壓且經(jīng)單一降壓藥物無法獲得良好控制者（收縮壓＞140 mmHg，舒張壓＞90 mmHg），患有＞Ⅰ級心肌缺血或心肌梗塞、≥Ⅰ級心律失常（包括QT 間期≥440 ms）或心功能部全；⑥長期未愈合的胸部或其他部位的傷口或骨折；⑦具有精神類藥物濫用史且無法戒除者或有精神障礙史；⑧既往和目前有肺纖維化史、間質(zhì)行肺炎、塵肺、放射性肺炎、藥物相關(guān)肺炎、肺功能嚴重受損等的客觀證據(jù)；⑨存在不可控制或需要Ⅳ抗菌劑治療的真菌、細菌、病毒或其他感染，如果對活性治療有應(yīng)答，在咨詢醫(yī)學(xué)監(jiān)查員后允許存在單純的尿路感染和無并發(fā)癥的細菌性咽炎；⑩對于既往使用過化療的受試者，根據(jù)NCI-CTCAE 4.0 標準，入組時存在≥2 級血液學(xué)毒性或≥3 級非血液學(xué)毒性；?已知存在艾滋病病毒或乙型肝炎（HBsAg陽性）或丙型肝炎病毒（抗HCV 陽性）感染病史；?存在任何留置導(dǎo)管或引流管（如經(jīng)皮腎造口管、留置弗利氏導(dǎo)尿管、膽汁引流管或胸膜/腹膜/心包導(dǎo)管），允許使用專用中心靜脈導(dǎo)管；?腦轉(zhuǎn)移；?存在中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染（CNS）病史或疾病，如癲癇發(fā)作疾病、腦血管缺血/出血、癡呆、小腦疾病或任何涉及CNS 的自身免疫性疾??；?入組12 個月內(nèi)有心肌梗死、心臟血管成形術(shù)或支架植入術(shù)、不穩(wěn)定型心絞痛或其他具有臨床意義的心臟疾病病史、紐約心臟協(xié)會Ⅲ類或Ⅳ類心力衰竭；?存在重大免疫缺陷；?對本研究中的主要治療藥物（包括預(yù)處理期間使用的氟達拉濱、環(huán)磷酰胺、美司鈉及防治細胞因子釋放綜合征的托珠單抗及抗感染藥物等）具有重度超敏反應(yīng)病史；?入組6 個月內(nèi)存在深靜脈血栓或肺栓塞病史；?過去2 年內(nèi)存在導(dǎo)致末端器官損傷或需要全身免疫抑制/全身疾病調(diào)節(jié)藥物的自身免疫性疾?。ㄈ缈肆_恩氏病、類風濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡）病史；?有任何可能對研究治療的安全性或療效評估產(chǎn)生干擾的疾病。

圖1 患者PD-L1 陽性免疫組織化學(xué)染色

1.2 方法

受試患者采12～15 mL 外周血進行白細胞分離，獲得約8×109/L 單核細胞，對白細胞分離產(chǎn)物中的T 細胞進行純化處理。隨后T 細胞接受激活并擴增，使用病毒載體導(dǎo)入MUC-1 CAR（粘蛋白1）基因，構(gòu)建起靶向MUC-1 的CAR-T 細胞、進一步擴增。然后使用利用T 細胞誘導(dǎo)改造技術(shù)dnPD-1（dominant negative PD-1）（專利號：US 2017/0096638 A1，上海斯丹賽生物技術(shù)有限公司）改良PD-1，降低PD-L1 誘導(dǎo)的免疫耐受，增強CAR-T 細胞抗腫瘤活性。

1.3 治療

1.3.1 預(yù)化療處理 用氟達拉濱［30 mg/（m2·d）］和環(huán)磷酰胺［500 mg/（m2·d）］給藥3 d，以促使淋巴細胞耗竭，創(chuàng)建體內(nèi)靶向MUC-1 CAR-T 擴展的最佳環(huán)境。組成的預(yù)處理化療方案后給予靶向dnPD1（MUC-1+CD19）CAR-T。

1.3.2 靶向dnPD1（MUC-1+CD19）CAR-T 輸注以回輸劑量為5×106dnPD1（MUC-1+CD19）CAR-T細胞/kg 的CAR 轉(zhuǎn)導(dǎo)自體T 細胞的劑量靜脈輸注。

2 結(jié)果

2.1 MUC-1 CAR-T 細胞回輸前后患者相關(guān)指標變化情況

CAR-T 細胞回輸后1 d，患者體溫升高，出現(xiàn)2 級發(fā)熱。白細胞介素-2（IL-2）、白細胞介素-6（IL-6）、白細胞介素-10（IL-10）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、干擾素-γ（INF-γ）、C-反應(yīng)蛋白（CRP）出現(xiàn)不同程度的升高，CAR-T 細胞數(shù)量自回輸3 d后明顯上升。見表1。

表1 CAR-T 細胞回輸前后患者相關(guān)指標變化情況

2.2 患者治療前后左側(cè)胸骨骨轉(zhuǎn)破壞及左胸壁軟組織PET-CT 檢查結(jié)果變化情況

PET-CT 掃描結(jié)果：患者治療前左側(cè)胸壁軟組織腫塊24 mm×20 mm，SUVmax：12.19（見圖2A）。治療后1 個月（見圖2B）及3 個月（見圖2C）PET-CT 提示左胸壁軟組織腫塊無明顯變化（25 mm×19 mm vs.28 mm×17 mm），SUVmax 值變化不明顯（11.55 vs.13.6），但治療后6 個月左側(cè)胸壁軟組織腫塊明顯增大（40 mm×25 mm）、代謝增高，SUVmax17.7（見圖2D）。

圖2 左胸壁軟組織及胸骨骨轉(zhuǎn)破壞PET-CT 結(jié)果

2.3 患者治療前后右側(cè)腋窩腫大淋巴結(jié)PET-CT檢查結(jié)果變化情況

右側(cè)腋窩淋巴結(jié)體積變化：CAR-T 治療前（見圖3A），治療后1 個月15 mm×10 mm（見圖3B），3 個月16 mm×10 mm（見圖3C），6 個月23 mm×27 mm（見圖3D）。SUVmax：治療后1 個月8.5，3 個月8.9，6 個月14.7。

圖3 右側(cè)腋窩腫大淋巴結(jié)PET-CT 檢查結(jié)果

2.4 患者治療6 個月后PET-CT 檢查結(jié)果新發(fā)轉(zhuǎn)移灶情況

PET-CT 結(jié)果顯示：患者治療6 個月后肝臟和肺部出現(xiàn)新發(fā)病灶。見圖4。

圖4 新發(fā)轉(zhuǎn)移灶

2.5 患者身體其他部位PET-CT 檢測結(jié)果情況

患者腦部、頸部、肺部、腹部和骨盆的基線經(jīng)PET-CT 掃描，結(jié)果治療后1 個月、3 個月、6個月均未出現(xiàn)明顯異常。

2.6 患者緩解持續(xù)時間和無進展生存期情況

根據(jù)實體瘤的療效評價標準1.1 版，患者的疾病緩解持續(xù)時間和無進展生存期可以達到6 個月。患者自CAR-T 治療開始至今已經(jīng)存活17 個月，且一般情況良好。

2.7 患者不良反應(yīng)及毒副作用情況

CAR-T 細胞回輸后1 d 出現(xiàn)2 級發(fā)熱，持續(xù)5 d；回輸18 d 出現(xiàn)Ⅲ°骨髓抑制；回輸1 d 后降鈣素原、IL-2、IL-6、IL-10 開始升高；回輸1 月后B淋巴細胞（CD19+）偏低，回輸6 個月后恢復(fù)正常；回輸后5 d、8 d 雙側(cè)手掌、雙足出現(xiàn)出血點（見圖5），伴瘙癢；期間伴隨發(fā)熱、疲乏、心慌氣短、血管滲漏等細胞因子釋放綜合征；神經(jīng)系統(tǒng)MMSE 評分30 分，無明顯異常；心臟功能、核磁共振成像、肝功能、腎功能、心肌酶譜、糞尿常規(guī)、凝血功能均在正常范圍，無明顯異常。

圖5 雙側(cè)手掌、雙足出血點

3 討論

根據(jù)2017 年美國癌癥統(tǒng)計研究報告顯示，乳腺癌仍然高居女性惡性腫瘤發(fā)病率的第1 位，占所有新發(fā)女性惡性腫瘤約30%；而因乳腺癌死亡的病例數(shù)排在第2 位，占所有死于惡性腫瘤女性約14%［4］。目前約有40%乳腺癌患者會在接受系統(tǒng)性治療后，仍出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，而且大部分復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移患者最后均因轉(zhuǎn)移而死亡［5］。乳腺癌在接受治療后的前三年會出現(xiàn)1 次復(fù)發(fā)高峰期，之后復(fù)發(fā)風險將逐步下降。但是復(fù)發(fā)風險將一直存在，約有10%～20%復(fù)發(fā)病灶表現(xiàn)為手術(shù)區(qū)域的局部復(fù)發(fā)，60%～70%則表現(xiàn)為遠處轉(zhuǎn)移或多發(fā)轉(zhuǎn)移。大部分晚期癌癥最終進展為常規(guī)治療難治性疾病，需要新的治療模式。免疫檢查點抑制劑和腫瘤浸潤淋巴細胞的研究表明了T 細胞治療癌癥的潛力，程序化的T 細胞是一種非常有前景的癌癥治療方法［6］。

MUC-1 在多種腫瘤中異常表達，表達量增高可達正常時＞100 倍，而且細胞表面分布改變，極性分布喪失，整個細胞表面均表達。其在乳腺癌組織中異常表達，癌旁組織不表達，使其成為一種潛在的腫瘤治療靶點［3］，所以在研究中筆者使用靶向MUC-1 CAR-T 的T 細胞進行治療；同時因為免疫檢查點的存在，為了進一步增強抗腫瘤活性，使用經(jīng)過改造的抑制了PD-1 功能的CAR-T細胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)3 個月內(nèi)病情穩(wěn)定，PET-CT 檢測結(jié)果無明顯的惡化或轉(zhuǎn)移灶；6 個月PET-CT 檢測發(fā)現(xiàn)左胸壁病灶部位增大，右腋窩淋巴結(jié)增大，SUVmax 增加，肺部和肝臟出現(xiàn)新發(fā)轉(zhuǎn)移病灶；緩解持續(xù)時間和無進展生存期可達6 個月，而且患者自治療存活至今17 個月，且一般情況良好。

CAR-T 治療最常見的毒性是細胞因子釋放綜合征和神經(jīng)毒性［7］。本研究中也出現(xiàn)了細胞因子釋放綜合征，包括發(fā)熱、惡心、厭食、心動過速、發(fā)熱、疲乏、心慌氣短、血管滲漏綜合征，IL-2、IL-6、IL-10、INF-γ、CRP 明顯上升。美羅培南和甲強龍聯(lián)合處理后發(fā)熱得到控制，期間出現(xiàn)的Ⅲ°骨髓抑制通過皮下注射重組人白細胞介素-11 得以糾正，神經(jīng)系統(tǒng)MMSE 評分30 分，無明顯神經(jīng)毒性。治療后1 個月B 淋巴細胞（CD19+）偏低，但治療后6 個月恢復(fù)正常，患者肝功能、腎功能、心肌酶譜、糞尿常規(guī)、凝血功能均在正常范圍，這證明筆者的治療具有較好的安全性。

綜上所述，本研究證明dnPD-1（MUC-1+CD19）CAR-T 細胞治療復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性乳腺癌能有效控制癌細胞的復(fù)發(fā)和惡化，不良反應(yīng)和副作用可控，具有較好的安全性和穩(wěn)定性，但因為納入的志愿者患者數(shù)量有限，其詳細機制還需進一步的研究。