楊秋旻， 李佳蔭， 張 艷， 閆承慧， 仲崇斌

1.東北大學 生命科學與健康學院，遼寧 沈陽 110167；2.北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 心血管內(nèi)科，遼寧 沈陽 110016

糖尿病是日益嚴重的公共健康問題。2019年，全球近5億人患有糖尿病。預計至2045年，全球患有糖尿病的數(shù)將增加至7億人。Ⅱ型糖尿病是最常見的糖尿病類型之一，約占全球現(xiàn)患糖尿病總人數(shù)的90%[1]。慢性低度炎癥是公認的Ⅱ型糖尿病及其相關并發(fā)癥的關鍵特征[2]。達格列凈(dapagliflozin，DAPA)是一種新型糖尿病治療藥物，是鈉-葡萄糖協(xié)同轉運蛋白2抑制劑，能夠抑制腎小管S1/S2段SGLT2的表達，從而增加尿糖，降低血糖[3]。有研究表明，DAPA具有獨立于血糖控制的心腎保護作用，但其機制不清[4-5]。NF-κB轉錄因子是產(chǎn)生多種炎性細胞因子的關鍵成分，也是細胞因子觸發(fā)效應的中心介質。目前，NF-κB轉錄因子家族有5位成員：RelA(P65)、RelB、Rel(c-Rel)、P50和P52。除RelB僅能與P52或P50結合形成異二聚體外，其他NF-κB亞基均可兩兩結合形成同二聚體或異二聚體，其中，P50和P65形成的異二聚體是最常見的形式之一[6]。NF-κB被多種刺激物激活，其磷酸化在刺激物下游的NF-κB活化中起關鍵作用，NF-κB亞基的磷酸化可能會增強或下調靶基因的轉錄，或調節(jié)轉錄反應[7]。本研究利用leptin基因敲除的(db/db)小鼠模型建立早期糖尿病腎損傷模型，給予口服DAPA治療，旨在探討DAPA對糖尿病腎的保護作用及機制?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑 選取10只8周齡SPF級db/db雄性糖尿病小鼠(購自中國南京模式動物中心)為研究對象。12 h明/暗交替規(guī)律照明喂養(yǎng)，溫度20℃～25℃，濕度40%～60%。DAPA購自阿斯利康公司。血糖儀及血糖試紙選自美國強生公司。Masson染色試劑盒選自美國SIGMA公司(HT-15-1KT)。PAS染色試劑盒選自北京索萊寶科技有限公司?？贵w購自Cell Signaling Technology公司。

1.2 研究方法

1.2.1 實驗分組 將小鼠隨機分為糖尿病組(DM組)與DAPA組，每組各5只。DM組連續(xù)口服喂養(yǎng)水12周；DAPA組連續(xù)口服喂養(yǎng)DAPA 12周，期間每周測量小鼠體質量，每2周尾靜脈取血測量小鼠的空腹血糖。

1.2.2 實驗取材 12周后處死小鼠，留取血清，取腎組織稱質量。一個腎組織采用多聚甲醛固定，進行HE染色、Masson染色、PAS染色，觀察小鼠腎組織結構變化；另一個腎組織-80℃保存，用于后續(xù)蛋白免疫印跡法檢測。

1.3 血清學檢測小鼠腎功能 采用小鼠血清尿素氮試劑盒(南京建成生物公司研究所)檢測小鼠血清中尿素氮的表達水平。

1.4 腎組織形態(tài)學觀察 腎組織石蠟切片，脫蠟后，經(jīng)HE染色觀察腎組織形態(tài)，Masson染色觀察腎組織的纖維化水平，PAS染色觀察腎組織腎小球硬化情況。

1.5 免疫組織化學染色 腎組織石蠟切片，脫蠟后，于抗原稀釋液(抗原稀釋液:蒸餾水為1∶50)中煮沸40 min，密閉冷卻至室溫后，加1滴或50 μl過氧化酶阻斷液，室溫10 min，PBS洗3次，加1滴或50 μl非免疫動物血清室溫10～30 min，除去血清，不清洗切片，加1滴或50 μl一抗(現(xiàn)用現(xiàn)配，一抗∶PBS為1∶100)4℃過夜，復溫30 min，PBS洗3次，每次3 min，加50 μl二抗室溫1 h，PBS洗3次，每次3 min，加50 μl鏈霉素抗生物素-過氧化酶溶液室溫10 min，PBS洗3次，每次3 min，DAB顯色液(現(xiàn)用現(xiàn)配)3～10 min，鏡下觀察顏色效果，流水沖洗終止反應，HE復染10 min，水洗，75%乙醇-鹽酸分化30 s，水洗，氨水反藍1～2 min，水洗，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。

1.6 AD293細胞培養(yǎng)及體外模型構建 體外應用H2O2刺激AD293細胞，模擬糖尿病小鼠體內(nèi)由氧化應激引起的炎癥。細胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM中，靜置于37℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞傳代至六孔板，在細胞密度為80%左右加入0.8 μmol/L的DAPA，預處理細胞24 h，然后加入H2O20.88 μmol/L處理細胞8 h，分為正常對照組(Con組)，H2O2組，H2O2+DAPA 0.4 μmol/L組，H2O2+DAPA 0.8 μmol/L組。

1.7 蛋白免疫印跡法 取腎組織加入RIPA裂解液研磨機破碎組織，冰上裂解30 min后，4℃、12 000 r/min離心15 min。收集AD293細胞，加入RIPA裂解液混勻，冰上裂解30 min，4℃、12 000 r/min離心15 min。收集上清，BCA蛋白定量法檢測蛋白濃度，制備蛋白上樣樣品，組織蛋白于100℃水浴鍋中水煮10 min，細胞蛋白水煮5 min；經(jīng)過SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白樣品，根據(jù)所需分子量停止電泳；于轉膜液中濕轉2 h，轉膜結束后，取出PVDF膜于5%脫脂牛奶中室溫搖床封閉1 h；將封閉好的PVDF膜置于適當稀釋的一抗中，放置于4℃冰箱中孵育過夜，回收一抗，TBST洗膜3次，每次5 min，將PVCF膜放置于稀釋好的二抗中，室溫搖床孵育2 h，TBST洗膜3次，每次15 min；將PVDF膜放置于ECL發(fā)光液中，然后將膜放入凝膠成像儀中掃描成像并保存圖片。應用Image J軟件對蛋白條帶進行定量分析。

2 結果

2.1 兩組小鼠血糖及體質量變化情況比較 12周后，DAPA組小鼠空腹血糖低于DM組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；兩組小鼠體質量比較，差異無有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖1。

圖1 兩組小鼠血糖及體質量變化情況比較

2.2 組織染色結果 與DM組小鼠相比，DAPA組小鼠的腎結構比較完整，腎小球內(nèi)細胞數(shù)目有所增加，但未減小腎小球體積大??；DAPA組的腎小球的硬化程度以及腎小球纖維化的現(xiàn)象有所緩解。見圖2。

圖2 小鼠腎染色結果(a.DM組HE染色，1×；b.DAPA組HE染色，1×；c.DM組PAS染色，40×；d.DAPA組PAS染色，40×；e.DM組HE染色40×；f.DAPA組HE染色，40×；g.DM組Masson染色，40×；h.DAPA組Masson染色，40×)

2.3 兩組小鼠腎功能比較 與DM組比較，DAPA組小鼠血清尿素氮水平降低，腎質量及腎質量/體質量增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖3。

圖3 兩組小鼠腎功能比較

2.4 DAPA對小鼠腎SGLT2表達的影響 與DM組比較，DAPA組小鼠腎組織中SGLT2表達量降低，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖4、圖5。

圖4 小鼠腎SGLT2免疫組化結果(a.DM組；b.DAPA組)

圖5 蛋白免疫印跡法

2.5 DAPA對小鼠腎組織炎癥的影響 與DM組比較，DAPA組小鼠腎組織腎小球內(nèi)CD68表達降低。見圖6。蛋白免疫印跡法結果顯示，DAPA組小鼠腎組織中P-P65(Ser-468)蛋白表達低于DM組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖7。

圖6 小鼠腎CD68免疫組化結果(a.DM組；b.DAPA組)

圖7 蛋白免疫印跡法檢測小鼠腎炎癥因子表達

2.6 DAPA對H2O2刺激AD293細胞炎癥反應影響 與Con組比較，H2O2組AD293細胞中SGLT2、P-P65(Ser-468)、P-P65(Ser-536)蛋白表達水平明顯升高；與H2O2組比較，H2O2+DAPA 0.4 μmol/L組、H2O2+DAPA 0.8 μmol/L組AD293細胞中SGLT2、P-P65(Ser-468)、P-P65(Ser-536)的蛋白表達明顯降低，且H2O2+DAPA 0.8 μmol/L組低于H2O2+DAPA 0.4 μmol/L組。見圖8。

圖8 蛋白免疫印跡法檢測AD293細胞炎癥因子表達

3 討論

《中國Ⅱ型糖尿病防治指南(2020版)》顯示，我國成人的糖尿病患病率上升至11.2%，指南推薦有慢性腎病的Ⅱ型糖尿病患者，無論糖化血紅蛋白是否達標，若無禁忌證，均應該在二甲雙胍的基礎上使用SGLT2抑制劑[8]。目前，越來越多的證據(jù)支持炎癥在Ⅰ型和Ⅱ型糖尿病中的作用[9]。Rangan等[10]對NF-κB亞型在慢性炎癥的發(fā)病機制和慢性腎病相關細胞存活中的核心作用進行綜述。Terami等[11]研究報道，DAPA治療可顯著降低巨噬細胞浸潤，以及db/db小鼠腎炎癥及氧化應激的表達。Tang等[12]研究報道，DAPA可以降低P65和MCP-1，通過改善高血糖引起的組織炎癥和氧化應激進而緩解糖尿病相關腎小球硬化和纖維化進展。有研究報道，DAPA的腎保護作用可能是通過HMGB1-RAGE-NF-κB信號通路介導[13]。以上研究結果提示，在糖尿病中，腎組織的炎癥反應增強，而該反應可能由氧化應激導致，DAPA可能通過NF-κB信號通路影響炎癥反應，達到糖尿病腎保護作用的效果。

本研究對DAPA喂養(yǎng)12周后的小鼠腎組織進行病理檢測，結果發(fā)現(xiàn)，DAPA組小鼠的腎小球硬化和纖維化水平明顯降低；同時，DAPA組小鼠的空腹血糖和血清尿素氮與DM組小鼠相比顯著降低，表明DAPA可以降低糖尿病小鼠的空腹血糖水平，并且對糖尿病小鼠的腎功能具有一定的保護作用；進一步應用CD68免疫組化染色證實，喂養(yǎng)DAPA 12周后，糖尿病小鼠的腎小球中CD68表達顯著降低，提示達格列凈可能是通過降低腎組織炎癥進行腎功能保護。

NF-κB翻譯后修飾，尤其是磷酸化，對NF-κB調節(jié)基因轉錄同樣重要[14]。P65存在多種磷酸化位點，NF-κB P65亞基特異性磷酸化導致下游基因選擇性轉錄。在炎癥期間，Ser-536和Ser-468磷酸化刺激轉錄活性[15]。其中，Ser-468磷酸化調節(jié)P65的穩(wěn)定性，Ser-536磷酸化調節(jié)亞細胞的定位[14]。體外培養(yǎng)的AD293細胞模型中，DAPA可以降低P65亞基Ser-536和Ser-468位點磷酸化。本研究采用蛋白免疫印跡法檢測小鼠腎組織中P-P65(Ser-468)、P-P65(Ser-536)的磷酸化水平，結果顯示，DAPA組小鼠腎組織中P-P65(Ser-468)、P-P65(Ser-536)蛋白表達低于DM組，提示DAPA可以顯著降低糖尿病小鼠腎組織中P65亞基Ser-536和Ser-468位點的磷酸化，降低糖尿病小鼠腎中炎癥因子的表達。

綜上所述，DAPA可能通過影響NF-κB信號通路中P65亞基的磷酸化調控下游炎癥因子的表達，從而發(fā)揮一定的腎保護作用。