張艷雙， 才 藝， 趙曉杰, 趙桂英， 劉文卿， 李 萍， 閆承慧

北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 心血管內(nèi)科，遼寧 沈陽(yáng) 110016

氯吡格雷是一種廣泛使用的抗血小板藥物，能有效降低血小板活性，從而減少支架內(nèi)血栓形成，對(duì)冠心病(coronary heart disease，CHD)的治療及預(yù)防具有重要意義。氯吡格雷是噻吩吡啶類前藥，需要被腸道吸收，通過(guò)肝中各種酶的代謝轉(zhuǎn)化為活性成分，發(fā)揮其抗血小板凝集作用[1]。在腸內(nèi)吸收后的氯吡格雷，85%被羧酸酯酶1水解為無(wú)活性的代謝物，并隨尿液或糞便排出體外[2]，只有15% 氯吡格雷通過(guò)肝中的細(xì)胞色素P450激活產(chǎn)生活性代謝物，活性代謝物通過(guò)與血小板 P2Y12 受體的不可逆結(jié)合來(lái)抑制二磷酸腺苷誘導(dǎo)的血小板聚集[3-4]。然而，由于各種遺傳和非遺傳因素導(dǎo)致氯吡格雷代謝發(fā)生改變，進(jìn)而出現(xiàn)氯吡格雷抵抗(clopidogrel resistance，CR)，其機(jī)制尚不清楚。相關(guān)研究表明，CR可能受多種因素影響，如種族、年齡、遺傳多態(tài)性、藥物相互作用、患者依從性等[5-7]。有研究表明，氯吡格雷反應(yīng)變異性與參與代謝的細(xì)胞色素 P450酶遺傳多態(tài)性有關(guān)，CYP2C19負(fù)責(zé)將氯吡格雷轉(zhuǎn)化為其活性代謝物[8-9]。根據(jù)代謝酶功能的基因型相關(guān)個(gè)體變異性常分為快代謝型、中等代謝型與慢代謝型[10]。CYP2C19快代謝型的正常患者中，服用氯吡格雷后血小板聚集率急劇下降，很少出現(xiàn)氯吡格雷抵抗。然而，較多CYP2C19快代謝型患者應(yīng)用300 mg氯吡格雷負(fù)荷劑量后，血小板聚集率仍沒(méi)有明顯下降。本研究主要通過(guò)測(cè)定CYP2C19快代謝型CHD患者血小板聚集率、氯吡格雷血漿藥物濃度等，旨在探討CYP2C19快代謝患者出現(xiàn)氯吡格雷抵抗的原因，并進(jìn)一步分析研究氯吡格雷的抵抗機(jī)制，為指導(dǎo)臨床用藥提供科學(xué)依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院心血管內(nèi)科自2020年7月至2021年7月收治的202例經(jīng)CYP2C19基因型檢測(cè)篩選為快代謝型CHD患者為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：典型臨床表現(xiàn)如胸痛、胸悶等，完善冠脈造影、心電圖及心肌酶標(biāo)志物等檢查確診為CHD；符合2012歐洲心臟病學(xué)會(huì)CHD指南[11]；臨床資料完整，均進(jìn)行CYP2C19基因型和血小板聚集檢測(cè)。排除標(biāo)準(zhǔn)：對(duì)氯吡格雷藥物過(guò)敏；肝腎功異常；活動(dòng)性消化性潰瘍；接受過(guò)大手術(shù)，腦血管意外或近期出血史。根據(jù)二磷酸腺苷誘導(dǎo)的血小板聚集率將其分為氯吡格雷抵抗組(CR組，血小板聚集率≥70%，n=92)與非氯吡格雷抵抗組(NCR組，血小板聚集率<70%，n=110)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。所有患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 研究方法

1.2.1 藥物使用方法 治療方案為首次口服300 mg氯吡格雷負(fù)荷劑量后，規(guī)律口服75 mg/d[12]。

1.2.2 CYP2C19基因型檢測(cè) 采集患者清晨空腹靜脈血3 ml(EDTA Na2抗凝)。采用上海百傲科技有限公司提供的核酸提取及CYP2C19基因檢測(cè)試劑盒，提取基因組DNA并經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增后雜交顯色經(jīng)BaiO基因芯片圖像分析軟件進(jìn)行圖像掃描和數(shù)據(jù)分析，篩選出快代謝型(野生型純合子型CYP2C19 *1*1)。

1.2.3 血小板聚集率檢測(cè) 采用美國(guó)HELENA AggRAM血小板聚集儀檢測(cè)血小板聚集率。抽取患者空腹靜脈兩管藍(lán)色帽枸櫞酸抗凝血，每管3 ml，血與抗凝劑比例9∶1。一管血以748 r/min離心10 min，收集上清液淺黃色血清制備富含血小板的血漿(platelet-rich plasma，PRP)。另一管血以3 000 r/min離心10 min，收集上清液制備貧血小板血漿(platelet poor plasma，PPP)，做好標(biāo)記。打開(kāi)儀器，吸取250 μl PPP到檢測(cè)杯準(zhǔn)備空白，待黃色指示燈閃爍兩秒變綠后移走檢測(cè)杯。吸取225 μl PRP置于有小磁珠的檢測(cè)杯中，并將其放置在測(cè)試通道中，使用加樣槍向檢測(cè)杯中加入20 μmol/L二磷酸腺苷25 μl，然后測(cè)量二磷酸腺苷誘導(dǎo)的血小板聚集率并記錄。CR尚無(wú)統(tǒng)一定義，根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)資料，血小板聚集率相對(duì)于基線水平降低<10%為CR[13-15]。

1.2.4 氯吡格雷血漿藥物濃度測(cè)定 患者口服300 mg氯吡格雷負(fù)荷劑量后，次日采集患者清晨空腹靜脈血3 ml藍(lán)色帽枸櫞酸抗凝血，以748 r/min離心10 min，收集血漿儲(chǔ)存1.5 ml收集管中待檢測(cè)。

1.2.5 溶液配制 稱取適量氯吡格雷對(duì)照品，采用50%乙腈-水溶解并定容，得濃度約為1 mg/ml的儲(chǔ)備液，于-20℃避光保存。吸取氯吡格雷儲(chǔ)備液適量，采用50%乙腈-水稀釋，得濃度為100、50、25、10、4、2、1 ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。

1.2.6 色譜條件 色譜柱：ACQUITY BEH C18(100.0 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流動(dòng)相：0.2%甲酸的水溶液(A)和乙腈(B)組成，流速設(shè)置為0.25 ml/min；柱溫：40℃；進(jìn)樣量5 μl。正離子模式下的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)。參數(shù)如下：ESI正電離模式，錐孔電壓為40.0 V，毛細(xì)管電壓為3.2 kV，去溶劑化溫度為450℃，離子源溫度為100℃。去溶劑化、錐孔氣體(氮?dú)?的流速分別為600、50 L/h。

1.2.7 血漿樣品預(yù)處理 取待測(cè)血漿樣品200 μl置1.5 ml離心管中，分別加入10 μl內(nèi)標(biāo)溶液500 ng/ml和400 μl乙腈，渦旋振蕩3 min，以12 000 r/min、4℃離心20 min。取500 μl上清液在35℃氮?dú)饬飨麓蹈?，?0 μl流動(dòng)相復(fù)溶，取上清液進(jìn)行高效液相液質(zhì)聯(lián)用分析。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者一般資料比較 兩組患者年齡、男性比例、體質(zhì)量指數(shù)、高血壓、糖尿病、他汀類藥物、鈣通道阻滯劑、雷貝拉唑腸溶片用藥史比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。NCR組患者吸煙史比例高于CR組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 兩組患者一般資料比較/例(百分率/%)

2.2 兩組患者血小板計(jì)數(shù)與血小板聚集率比較 兩組患者血小板計(jì)數(shù)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；CR組患者的血小板聚集率高于NCR組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 兩組患者血小板計(jì)數(shù)與血小板聚集率比較

2.3 兩組患者氯吡格雷血漿藥物濃度比較 CR組患者氯吡格雷血漿藥物濃度為(2.52±3.34)ng/ml，低于NCR組的(3.05±5.33)ng/ml，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討論

近年來(lái)，中國(guó)CHD發(fā)病率持續(xù)增加，病死率與致殘率均較高[16]。氯吡格雷是目前臨床治療CHD患者最廣泛應(yīng)用的抗血小板藥物之一。據(jù)報(bào)道，超過(guò)30% 接受該藥物治療的患者出現(xiàn)抗血小板療效欠佳[17]。越來(lái)越多的研究表明，CYP2C19基因多態(tài)性導(dǎo)致對(duì)氯吡格雷的不同反應(yīng)[18]，具有正常野生型等位基因的 CYP2C19基因編碼一種功能性酶，可將氯吡格雷前藥轉(zhuǎn)化為其活性代謝物。與非攜帶者相比，攜帶至少1個(gè)無(wú)效等位基因的攜帶者氯吡格雷的活性代謝物減少了32.4%，血小板聚集率增加了9.0%[19]。有研究表明，CYP2C19的遺傳變異與氯吡格雷活性代謝物的生物利用度、其抗血小板作用及臨床結(jié)果的差異有關(guān)[20]。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩組患者血小板計(jì)數(shù)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；CR組患者的血小板聚集率高于NCR組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這表明，兩組患者血小板計(jì)數(shù)正常無(wú)差異，血小板聚集功能出現(xiàn)差異。本研究結(jié)果還顯示，CR組患者氯吡格雷血漿藥物濃度為(2.52±3.34)ng/ml，低于NCR組的(3.05±5.33)ng/ml，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。這一結(jié)果側(cè)面反映出CYP2C19 快代謝型發(fā)揮了CYP酶活性，導(dǎo)致氯吡格雷血漿水平降低。兩組患者氯吡格雷活性代謝物的減少，卻并沒(méi)有產(chǎn)生抗血小板作用可能與本研究的局限性有關(guān)。第一，本研究沒(méi)有考慮多態(tài)性CYP3A的代謝活性，包括CYP3A4與CYP3A5，二者均為氯吡格雷活化的必需酶之一。有研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CYP3A4與CYP3A5的活性與血小板聚集率無(wú)關(guān)，其基因分型和表型分析也不能預(yù)測(cè)氯吡格雷的抗血小板作用[21-22]。第二，接受氯吡格雷治療的患者同時(shí)服用其他藥物，如阿司匹林、鈣通道阻滯劑、奧美拉唑、他汀類藥物等，除氯吡格雷外，CYP3A4通路還代謝他汀類藥物和鈣通道阻滯劑，CYP2C19通路代謝質(zhì)子泵抑制劑[23]。因此，藥物相互作用也會(huì)影響氯吡格雷的代謝機(jī)制。第三，患者的依從性、糖尿病、高血壓等基礎(chǔ)疾病的影響，炎癥因子水平與血小板功能異常引起的CR之間也密切相關(guān)。

綜上所述，氯吡格雷在治療CHD中起到至關(guān)重要的作用，CHD患者CYP2C19快代謝型發(fā)揮酶活性能有效抑制血小板聚集，但也會(huì)產(chǎn)生氯吡格雷抵抗，然而多種因素會(huì)影響對(duì)該藥物的反應(yīng)，如遺傳多態(tài)性，藥物相互作用、患者依從性、糖尿病等，為更好優(yōu)化氯吡格雷抵抗防治策略仍需進(jìn)一步探索研究。