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        人MAPK3基因原核表達載體的構(gòu)建及鑒定*

        2021-11-06 05:21:58石松薛殿婷張培石靜孫達權(quán)
        關(guān)鍵詞:原核瓊脂糖質(zhì)粒

        石松, 薛殿婷, 張培, 石靜**, 孫達權(quán)**

        (1.黔東南苗族侗族自治州人民醫(yī)院 重癥醫(yī)學(xué)科, 貴州 凱里 556000; 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 生化與分子生物學(xué)教研室, 貴州 貴陽 550025)

        人絲裂原激活蛋白激酶3(mitogen-activated protein kinase 3,MAPK3)又叫細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1(extracellular signal-regulatedkinase 1,ERK1),是由第16號染色體p11.2處的MAPK3基因編碼,是大鼠肉瘤原癌蛋白(rat sarcoma proto-oncoprotein,Ras)-快速加速纖維肉瘤激酶(rapidly accelerated fibrosarcoma kinase,Raf)-絲裂原活化蛋白激酶的激酶(mitogen-activated protein kinase kinase,MEK)-絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號通路的關(guān)鍵成員之一[1-3]。有研究表明,絲裂原活化蛋白激酶1/3(mitogen-activated protein kinase 1/3,MAPK1/3)與細胞的生長增殖、自噬存活及遷移等功能密切相關(guān)[4-8];同時,MAPK1/3也參與多種病理進程,許多原癌基因編碼的蛋白可通過ERK/MAPK信號通路實現(xiàn)相應(yīng)的細胞學(xué)效應(yīng),而ERK/MAPK信號通路的持續(xù)激活可以加速誘發(fā)腫瘤發(fā)生、發(fā)展和惡化[9-13]。目前,雖然有許多文獻描述了MAPK1/3在肝癌等多種腫瘤中的作用,但單獨研究MAPK3對肝癌作用的文獻不多。本研究克隆了人MAPK3基因的蛋白編碼區(qū)、構(gòu)建原核表達載體、用IPTG誘導(dǎo)MAPK3在細菌中表達,并用Sepharose 4B純化MAPK3蛋白,為后續(xù)研究MAPK3的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 實驗材料

        1.1.1細胞和血清來源 正常人肝細胞系HL-7702細胞購自中科院上海細胞庫,新生牛血清購自杭州四季青。

        1.1.2主要試劑和儀器 固體粉末細胞培養(yǎng)基RPMI-1640(美國Gibco),TRIzol(美國Invitrogen),mRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、高保真Taq DNA polymerase、3′末端加脫氧核糖腺苷酸(deoxyriboadenosine,A)試劑盒、脫氧核糖胸苷酸-脫氧核糖腺苷酸(deoxythymidylate-deoxyriboadenosine,T-A)克隆試劑盒、大腸桿菌RY13株的第一種限制性內(nèi)切酶(escherichia coli RY13Ⅰ,EcoR Ⅰ)、黃單胞菌的第一種限制性內(nèi)切酶(Xanthomonas holcicola Ⅰ,XhoⅠ)、T4 DNA ligase及DNA純化回收試劑盒(大連寶生物),谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase,GST)標簽抗體(南京巴傲得生物),Glutathione Sepharose 4B樹脂(美國Pharmacia),質(zhì)粒小量抽提試劑盒和感受態(tài)細菌(北京天根生物),pGEX-4t-1保存于本實驗室,引物合成和DNA測序委托上海生工完成。聚合酶鏈式反應(yīng)儀(polymerase chain reaction machine,PCR儀)(美國伯樂),DYCP-32B瓊脂糖凝膠水平電泳儀、DYCZ-24DH蛋白垂直電泳儀及DYCZ-40G轉(zhuǎn)印電泳儀(北京六一)。

        1.2 實驗方法

        1.2.1細胞培養(yǎng) 人肝細胞HL-7702置于含10%新生牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

        1.2.2總RNA抽提與反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR) 細胞在直徑6 cm的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)融合至70%時,棄培養(yǎng)液,滅菌的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)清洗貼壁細胞3次,取TRIzol 1mL按說明書抽提細胞內(nèi)總RNA,對抽提的RNA進行濃度定量和瓊脂糖凝膠電泳檢測。取總RNA 4 μg,按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書配制反應(yīng)體系,42 ℃反應(yīng)60 min,將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。按NCBI GenBank中人MAPK3基因序列(NM_002746)設(shè)計引物,上游引物為5′-TGAATTCATGGCGGCGGCGGCGGCTCAGGGGG-3′,下游引物為5′-TCTCGAGCTAGGGGGCCTCCAGCACTCCGGGC-3′。為方便構(gòu)建目的DNA質(zhì)粒,本研究在上游引物的5′末端插入EcoR Ⅰ酶切位點,在下游引物的5′末端插入XhoⅠ酶切位點。以cDNA為模板,按說明書加入上和下游引物、dNTPs及高保真DNA聚合酶,按94 ℃預(yù)變性3 min,94 ℃、30 s,56 ℃、30 s,72 ℃、1.5 min,循環(huán)31次;72 ℃、10 min的反應(yīng)條件擴增人MAPK3基因中的蛋白編碼區(qū)DNA片段。

        1.2.3T-A克隆與DNA測序鑒定 取1%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物,膠回收試劑盒回收目的DNA片段?;厥盏腄NA片段用加“A”試劑盒根據(jù)說明書配制反應(yīng)液,65 ℃加“A”,產(chǎn)物與TA克隆載體pMD18-T于16 ℃連接120 min。連接產(chǎn)物用熱激法導(dǎo)入感受態(tài)細菌DH5α,氨芐青霉素瓊脂糖平板培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)。當單克隆菌落形成后,挑取菌落進行擴大培養(yǎng),用質(zhì)粒小量抽提試劑盒抽提質(zhì)粒,獲得的質(zhì)粒用EcoR Ⅰ/XhoⅠ進行雙酶切,1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,條帶大小與預(yù)期一致的質(zhì)粒進行DNA送樣測序,測序結(jié)果正確的質(zhì)粒命名為pMD18-T-MAPK3GST。

        1.2.4重組原核表達質(zhì)粒pGEX-MAPK3GST的構(gòu)建 用EcoR Ⅰ/XhoⅠ對pMD18T-MAPK3GST和原核表達載體pGEX-4t-1分別進行雙酶切,從前者質(zhì)粒中獲取MAPK3GST目的DNA片段,從后者中獲取骨架載體,回收的DNA片段用T4 DNA ligase于16 ℃連接120 min;連接產(chǎn)物用熱激法導(dǎo)入感受態(tài)細菌DH5α中;含有氨芐青霉素的Luria-Bertani(LB)固體培養(yǎng)板篩選培養(yǎng),挑取單克隆菌落擴大培養(yǎng),抽提質(zhì)粒和雙酶切鑒定,通過DNA測序進行再次驗證,所需重組質(zhì)粒命名為pGEX-MAPK3GST。

        1.2.5原核誘導(dǎo)表達GST-MAPK3融合蛋白 純化的原核表達質(zhì)粒pGEX-MAPK3GST轉(zhuǎn)化感受態(tài)Rosetta細菌,含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基篩選培養(yǎng),挑取菌落并擴大培養(yǎng);取菌液1 mL置于200 mL LB 培養(yǎng)基中,200 r/min于37 ℃搖菌至450 nm波長的光密度(λ=450 nm optical density,OD450 nm)為0.4,搖床溫度調(diào)至21 ℃,加10 mmol/L異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside,IPTG)誘導(dǎo)GST-MAPK3融合蛋白表達2 h。

        1.2.6十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)與考馬斯亮藍染色 取誘導(dǎo)前/后的菌體和蛋白等樣品進行制樣。菌體中加入含有1%Triton X-100的PBS 1 mL,并加入終濃度1 mmol/L苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride, PMSF);用勻漿器反復(fù)勻漿,4 ℃、12 000 r/min離心10 min,取上清液和沉淀加入SDS上樣緩沖液,100 ℃煮沸5 min,瞬時離心。蛋白樣品直接加入SDS上樣緩沖液制樣,樣品進行SDS-PAGE,當電泳結(jié)束后剝離變性膠、固定液固定后用0.25%(W/V)的考馬斯亮藍R-250室溫染色2 h、用脫色液脫去背景色。

        1.2.7蛋白免疫印跡 樣品經(jīng)SDS-PAGE后,用1×轉(zhuǎn)膜緩沖液(CAPS/L 2.2 g,10%甲醇,NaOH調(diào)節(jié)pH值至10.5)對變性膠室溫平衡30 min,冰浴中用500 mA轉(zhuǎn)印45 min;轉(zhuǎn)印結(jié)束后剝離聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride,PVDF),利用三羥甲基氨基甲烷溶液配制的氯化鈉和吐溫20溶液(tris-buffered saline and tween 20,TBST)配制的5%BSA于37 ℃封閉30 min;TBST清洗3次,10 min/次;TBST稀釋的一抗4 ℃孵育過夜,TBST清洗3次,10 min/次;用TBST稀釋的辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標記的二抗于室溫孵育2 h,TBST清洗3次、10 min/次;電化學(xué)發(fā)光液(electrochemiluminescence,ECL)進行顯色反應(yīng)。

        1.2.8蛋白純化和鑒定 1 mmol/L IPTG于20 ℃誘導(dǎo)4 h,4 ℃ 12 000 r/min 離心10 min,收集菌體;加含1mmol/L PMSF的PBS后,冰浴超聲破碎(超聲功率為300 W,5 s/次、間隔5 s、超聲50次);菌體破碎,液體轉(zhuǎn)入50 mL離心管中,4 ℃ 下7 500 r/min離心15 min,分別取上清和沉淀;分別用變性膠上樣緩沖液制樣進行SDS-PAGE,電泳結(jié)束后進行考馬斯亮藍R-250染色和蛋白免疫印跡實驗;確定目的蛋白在上清蛋白液中后,將上清蛋白液與Glutathione Sepharose 4B瓊脂糖凝膠于4 ℃雜交60 min、1 000 r/min離心15 s、收集瓊脂糖凝膠,PBS清洗3次、10 min/次,10 mmol/L谷胱甘肽洗脫液于室溫搖床上孵育30 min,4 ℃下1 000 r/min離心15 s,收集洗脫液,制備樣品進行SDS-PAGE,考馬斯亮藍R-250染色和蛋白免疫印跡驗證。

        2 結(jié)果

        2.1 人MAPK3基因編碼區(qū)克隆及其原核表達質(zhì)粒pGEX-MAPK3GST構(gòu)建

        首先通過RT-PCR獲得人靶基因MAPK3的蛋白編碼區(qū)DNA片段,其長度為1.2 kb,利用T-A克隆將目的基因插入pMD18-T中,構(gòu)建了含有靶基因的pMD18-T-MAPK3GST;DNA測序結(jié)果證明pMD18-T-MAPK3GST正是所需質(zhì)粒,MAPK3基因蛋白編碼區(qū)無任何點突變;用限制性核酸內(nèi)切酶雙酶切原核表達質(zhì)粒pGEX-4t-1和pMD18-T-MAPK3GST,重組后獲得pGEX-MAPK3GST,酶切鑒定證實該質(zhì)粒與預(yù)期結(jié)果一致;DNA測序結(jié)果顯示人MAPK3蛋白編碼區(qū)正確插入了原核表達載體中,成功構(gòu)建了原核表達質(zhì)粒pGEX-MAPK3GST。見圖1。

        注:A為RT-PCR擴增MAPK3基因的蛋白編碼區(qū),B為EcoR Ⅰ/Xho Ⅰ雙酶切原核表達質(zhì)粒pGEX-4t-1和pMD18-T-MAPK3GST,C為EcoR Ⅰ/Xho Ⅰ雙酶切重組原核表達質(zhì)粒pGEX- MAPK3GST,D為pGEX- MAPK3GST質(zhì)粒圖譜,E為pMD18-T-MAPK3GST DNA測序,F(xiàn)為pGEX- MAPK3GST DNA測序。圖1 人MAPK3基因克隆及其原核表達載體pGEX-MAPK3GST構(gòu)建Fig.1 Cloning of human MAPK3 gene and construction of its prokaryotic expression plasmid pGEX-MAPK3GST

        2.2 MAPK3融合蛋白表達、純化及鑒定

        將重組的原核表達質(zhì)粒pGEX-MAPK3GST導(dǎo)入Rosetta細菌(DE3)中,用IPTG誘導(dǎo)GST-MAPK3融合蛋白表達。結(jié)果如圖2所示,當細菌被誘導(dǎo)后在70 kDa之上出現(xiàn)了大量的蛋白;破碎菌體后,分別對上清液和沉淀進行變性膠電泳和考馬斯亮藍染色,發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)蛋白同時出現(xiàn)在上清和沉淀中;用Glutathione Sepharose 4B瓊脂糖凝膠與上清液雜交,獲得的蛋白液進行變性膠電泳和考馬斯亮藍染色,在70 kDa之上出現(xiàn)了單一的蛋白條帶;蛋白免疫印跡結(jié)果顯示,該目的條帶正是GST-MAPK3融合蛋白。

        注:1為Thermo Scientific PageRuler Pierce 26616,2為未誘導(dǎo)的細菌,3為IPTG誘導(dǎo)的細菌,4為菌體破碎后的上清液,5為菌體破碎后的沉淀物,6為純化的GST-MAPK3融合蛋白。圖2 融合蛋白GST-MAPK3的考馬斯亮藍染色及蛋白免疫印跡分析Fig.2 Coomassie bright blue staining and Western blot of the purified fusion protein GST-MAPK3

        3 討論

        MAPK家族成員較多,如p38MAPK、JNK等,且不斷有新成員加入,這些成員參與了真核細胞的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和網(wǎng)絡(luò)調(diào)控,影響多種細胞的生長、增殖、分化、遷移、凋亡及炎癥等生理[14]。不同的MAPK具有相似的作用,也存在各自特異的生物學(xué)功能[15]。在這些成員中,由于MAPK3與MAPK1在蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)上具有85%的相似性,因此具有諸多類似的生物學(xué)功能,兩者也通常被歸為一類并寫成MAPK1/3或者ERK1/2[14-15]。盡管如此,兩者之間蛋白結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能仍有差異,與分子量42 kDa的MAPK1相比,MAPK3的N-末端多了一段特有的氨基酸序列,使其分子量比MAPK1多出了2 kDa,導(dǎo)致胞質(zhì)中磷酸化活化的MAPK3入核速度低于MAPK1,因此細胞核內(nèi)MAPK3整體磷酸化水平低于MAPK1的磷酸化水平,使MAPK3攜帶細胞增殖信號的能力下降[15]。此外,MAPK3還有許多不同于MAPK1的特異生物學(xué)功能,能夠誘導(dǎo)脂肪細胞分化、引起肥胖[16];能誘導(dǎo)破骨細胞,形成和保護N-甲基-D-天冬氨酸誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜損傷[17]。因此,除了研究MAPK1/3的共同生物學(xué)功能外,非常有必要單獨研究MAPK3的生物學(xué)功能。為研究MAPK3蛋白在肝臟生理條件下和病理過程中的生物學(xué)功能,首先需要獲得MAPK3蛋白。為此本課題組通過TRIzol法從人肝細胞中抽提獲得總RNA,以此總RNA為模板通過RT-PCR體外擴增獲得人MAPK3基因的蛋白編碼區(qū),利用DNA測序技術(shù)驗證體外擴增獲得的cDNA片段正是人MAPK3基因的蛋白編碼區(qū),且未發(fā)生任何突變;隨后將該cDNA片段通過限制性核酸內(nèi)切酶EcoR Ⅰ/XhoⅠ插入到原核表達載體pGEX-4t-1中,構(gòu)建重組原核表達質(zhì)粒pGEX-MAPK3GST;將重組質(zhì)粒用熱激法導(dǎo)入細菌Rosetta中,利用IPTG誘導(dǎo)宿主細菌表達可溶性融合蛋白GST-MAPK3,菌體破碎和高速離心獲取含有GST-MAPK3的蛋白混合液,再利用GST標簽的特性通過Glutathione Sepharose 4B瓊脂糖凝膠親和層析純化GST-MAPK3,用考馬斯亮藍法和蛋白免疫印跡法分別驗證蛋白純度及蛋白特異性,最終獲得較純的MAPK3蛋白,為下一步研究MAPK3的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

        本研究利用了一種常用的、體外有效獲取基因片段的技術(shù)方法RT-PCR來獲取人MAPK3基因蛋白編碼區(qū),該技術(shù)始于1985年,現(xiàn)已成為當前分子生物學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用最廣和最熱門的一項技術(shù)[17-19]。該技術(shù)的廣泛普及得益于多種性能的Taq DNA聚合酶的開發(fā)和創(chuàng)新[20-22]。本研究利用了一種莫羅尼鼠白血病病毒(moloney murine leukemia virus,MMLV)來源、通過基因改造的可抑制RNA高級結(jié)構(gòu)和錯配延伸的反轉(zhuǎn)錄酶及高保真長鏈擴增DNA聚合酶,單次實驗就實現(xiàn)了從人肝細胞總RNA中獲得了MAPK3基因蛋白編碼區(qū)。

        原核表達是一種大量、快速制備目的蛋白的有效方法,與真核表達和體外無細胞翻譯系統(tǒng)相比,其具有目的蛋白表達量多、蛋白制備和純化程序簡單及原材料經(jīng)濟等優(yōu)點,是有效獲取目的蛋白的重要方式之一[23-24]。本研究通過重組原核表達質(zhì)粒pGEX-MAPK3GST在細菌中大量誘導(dǎo)表達融合蛋白GST-MAPK3,并利用融合蛋白中的GST標簽增加目的表達蛋白的水溶性,使原核表達的蛋白不容易形成包涵體,使目的蛋白在自然條件下正確折疊;同時,利用GST標簽蛋白與Glutathione Sepharose 4B具有親和力的特性,通過親和層析從細菌蛋白混合液中分離純化MAPK3目的蛋白。

        研究表明,MAPK1/3能夠促進細胞中角蛋白18(cytokeration 18,CK18)再表達,而表達的CK18可能會反向作用于MAPK1/3,影響其激酶活性,從而反饋性調(diào)控細胞生理和細胞活動;另一方面,蛋白激酶C(protein kinase C epsilon,PKC)活性可以調(diào)控MAPK1/3的活性[25],而PKC與CK18的磷酸化具有密切聯(lián)系,本研究成功克隆人MAPK3基因并獲得MAPK3蛋白,可用于體外研究MAPK3對CK18的磷酸化作用。因此,在獲得了純化的MAPK3融合蛋白的基礎(chǔ)上,為后續(xù)研究MAPK3、PKCε及CK18之間的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。

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