石松， 薛殿婷， 張培， 石靜**， 孫達權(quán)**

(1.黔東南苗族侗族自治州人民醫(yī)院 重癥醫(yī)學科， 貴州 凱里 556000； 2.貴州醫(yī)科大學 基礎(chǔ)醫(yī)學院 生化與分子生物學教研室， 貴州 貴陽 550025)

人絲裂原激活蛋白激酶3(mitogen-activated protein kinase 3，MAPK3)又叫細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1(extracellular signal-regulatedkinase 1，ERK1)，是由第16號染色體p11.2處的MAPK3基因編碼，是大鼠肉瘤原癌蛋白(rat sarcoma proto-oncoprotein，Ras)-快速加速纖維肉瘤激酶(rapidly accelerated fibrosarcoma kinase，Raf)-絲裂原活化蛋白激酶的激酶(mitogen-activated protein kinase kinase，MEK)-絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路的關(guān)鍵成員之一[1-3]。有研究表明，絲裂原活化蛋白激酶1/3(mitogen-activated protein kinase 1/3，MAPK1/3)與細胞的生長增殖、自噬存活及遷移等功能密切相關(guān)[4-8]；同時，MAPK1/3也參與多種病理進程，許多原癌基因編碼的蛋白可通過ERK/MAPK信號通路實現(xiàn)相應(yīng)的細胞學效應(yīng)，而ERK/MAPK信號通路的持續(xù)激活可以加速誘發(fā)腫瘤發(fā)生、發(fā)展和惡化[9-13]。目前，雖然有許多文獻描述了MAPK1/3在肝癌等多種腫瘤中的作用，但單獨研究MAPK3對肝癌作用的文獻不多。本研究克隆了人MAPK3基因的蛋白編碼區(qū)、構(gòu)建原核表達載體、用IPTG誘導MAPK3在細菌中表達，并用Sepharose 4B純化MAPK3蛋白，為后續(xù)研究MAPK3的生物學功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1細胞和血清來源 正常人肝細胞系HL-7702細胞購自中科院上海細胞庫，新生牛血清購自杭州四季青。

1.1.2主要試劑和儀器 固體粉末細胞培養(yǎng)基RPMI-1640(美國Gibco)，TRIzol(美國Invitrogen)，mRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、高保真Taq DNA polymerase、3′末端加脫氧核糖腺苷酸(deoxyriboadenosine，A)試劑盒、脫氧核糖胸苷酸-脫氧核糖腺苷酸(deoxythymidylate-deoxyriboadenosine，T-A)克隆試劑盒、大腸桿菌RY13株的第一種限制性內(nèi)切酶(escherichia coli RY13Ⅰ，EcoR Ⅰ)、黃單胞菌的第一種限制性內(nèi)切酶(Xanthomonas holcicola Ⅰ，XhoⅠ)、T4 DNA ligase及DNA純化回收試劑盒(大連寶生物)，谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase，GST)標簽抗體(南京巴傲得生物)，Glutathione Sepharose 4B樹脂(美國Pharmacia)，質(zhì)粒小量抽提試劑盒和感受態(tài)細菌(北京天根生物)，pGEX-4t-1保存于本實驗室，引物合成和DNA測序委托上海生工完成。聚合酶鏈式反應(yīng)儀(polymerase chain reaction machine，PCR儀)(美國伯樂)，DYCP-32B瓊脂糖凝膠水平電泳儀、DYCZ-24DH蛋白垂直電泳儀及DYCZ-40G轉(zhuǎn)印電泳儀(北京六一)。

1.2 實驗方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 人肝細胞HL-7702置于含10%新生牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2總RNA抽提與反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR) 細胞在直徑6 cm的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)融合至70%時，棄培養(yǎng)液，滅菌的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)清洗貼壁細胞3次，取TRIzol 1mL按說明書抽提細胞內(nèi)總RNA，對抽提的RNA進行濃度定量和瓊脂糖凝膠電泳檢測。取總RNA 4 μg，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書配制反應(yīng)體系，42 ℃反應(yīng)60 min，將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。按NCBI GenBank中人MAPK3基因序列(NM_002746)設(shè)計引物，上游引物為5′-TGAATTCATGGCGGCGGCGGCGGCTCAGGGGG-3′，下游引物為5′-TCTCGAGCTAGGGGGCCTCCAGCACTCCGGGC-3′。為方便構(gòu)建目的DNA質(zhì)粒，本研究在上游引物的5′末端插入EcoR Ⅰ酶切位點，在下游引物的5′末端插入XhoⅠ酶切位點。以cDNA為模板，按說明書加入上和下游引物、dNTPs及高保真DNA聚合酶，按94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃、30 s，56 ℃、30 s，72 ℃、1.5 min，循環(huán)31次；72 ℃、10 min的反應(yīng)條件擴增人MAPK3基因中的蛋白編碼區(qū)DNA片段。

1.2.3T-A克隆與DNA測序鑒定 取1%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，膠回收試劑盒回收目的DNA片段?；厥盏腄NA片段用加“A”試劑盒根據(jù)說明書配制反應(yīng)液，65 ℃加“A”，產(chǎn)物與TA克隆載體pMD18-T于16 ℃連接120 min。連接產(chǎn)物用熱激法導入感受態(tài)細菌DH5α，氨芐青霉素瓊脂糖平板培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)。當單克隆菌落形成后，挑取菌落進行擴大培養(yǎng)，用質(zhì)粒小量抽提試劑盒抽提質(zhì)粒，獲得的質(zhì)粒用EcoR Ⅰ/XhoⅠ進行雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，條帶大小與預(yù)期一致的質(zhì)粒進行DNA送樣測序，測序結(jié)果正確的質(zhì)粒命名為pMD18-T-MAPK3GST。

1.2.4重組原核表達質(zhì)粒pGEX-MAPK3GST的構(gòu)建 用EcoR Ⅰ/XhoⅠ對pMD18T-MAPK3GST和原核表達載體pGEX-4t-1分別進行雙酶切，從前者質(zhì)粒中獲取MAPK3GST目的DNA片段，從后者中獲取骨架載體，回收的DNA片段用T4 DNA ligase于16 ℃連接120 min；連接產(chǎn)物用熱激法導入感受態(tài)細菌DH5α中；含有氨芐青霉素的Luria-Bertani(LB)固體培養(yǎng)板篩選培養(yǎng)，挑取單克隆菌落擴大培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒和雙酶切鑒定，通過DNA測序進行再次驗證，所需重組質(zhì)粒命名為pGEX-MAPK3GST。

1.2.5原核誘導表達GST-MAPK3融合蛋白 純化的原核表達質(zhì)粒pGEX-MAPK3GST轉(zhuǎn)化感受態(tài)Rosetta細菌，含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)，挑取菌落并擴大培養(yǎng)；取菌液1 mL置于200 mL LB 培養(yǎng)基中，200 r/min于37 ℃搖菌至450 nm波長的光密度(λ=450 nm optical density，OD450 nm)為0.4，搖床溫度調(diào)至21 ℃，加10 mmol/L異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside，IPTG)誘導GST-MAPK3融合蛋白表達2 h。

1.2.6十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)與考馬斯亮藍染色 取誘導前/后的菌體和蛋白等樣品進行制樣。菌體中加入含有1%Triton X-100的PBS 1 mL，并加入終濃度1 mmol/L苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride， PMSF)；用勻漿器反復勻漿，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液和沉淀加入SDS上樣緩沖液，100 ℃煮沸5 min，瞬時離心。蛋白樣品直接加入SDS上樣緩沖液制樣，樣品進行SDS-PAGE，當電泳結(jié)束后剝離變性膠、固定液固定后用0.25%(W/V)的考馬斯亮藍R-250室溫染色2 h、用脫色液脫去背景色。

1.2.7蛋白免疫印跡 樣品經(jīng)SDS-PAGE后，用1×轉(zhuǎn)膜緩沖液(CAPS/L 2.2 g，10%甲醇，NaOH調(diào)節(jié)pH值至10.5)對變性膠室溫平衡30 min，冰浴中用500 mA轉(zhuǎn)印45 min；轉(zhuǎn)印結(jié)束后剝離聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)，利用三羥甲基氨基甲烷溶液配制的氯化鈉和吐溫20溶液(tris-buffered saline and tween 20，TBST)配制的5%BSA于37 ℃封閉30 min；TBST清洗3次，10 min/次；TBST稀釋的一抗4 ℃孵育過夜，TBST清洗3次，10 min/次；用TBST稀釋的辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標記的二抗于室溫孵育2 h，TBST清洗3次、10 min/次；電化學發(fā)光液(electrochemiluminescence，ECL)進行顯色反應(yīng)。

1.2.8蛋白純化和鑒定 1 mmol/L IPTG于20 ℃誘導4 h，4 ℃ 12 000 r/min 離心10 min，收集菌體；加含1mmol/L PMSF的PBS后，冰浴超聲破碎(超聲功率為300 W，5 s/次、間隔5 s、超聲50次)；菌體破碎，液體轉(zhuǎn)入50 mL離心管中，4 ℃ 下7 500 r/min離心15 min，分別取上清和沉淀；分別用變性膠上樣緩沖液制樣進行SDS-PAGE，電泳結(jié)束后進行考馬斯亮藍R-250染色和蛋白免疫印跡實驗；確定目的蛋白在上清蛋白液中后，將上清蛋白液與Glutathione Sepharose 4B瓊脂糖凝膠于4 ℃雜交60 min、1 000 r/min離心15 s、收集瓊脂糖凝膠，PBS清洗3次、10 min/次，10 mmol/L谷胱甘肽洗脫液于室溫搖床上孵育30 min，4 ℃下1 000 r/min離心15 s，收集洗脫液，制備樣品進行SDS-PAGE，考馬斯亮藍R-250染色和蛋白免疫印跡驗證。

2 結(jié)果

2.1 人MAPK3基因編碼區(qū)克隆及其原核表達質(zhì)粒pGEX-MAPK3GST構(gòu)建

首先通過RT-PCR獲得人靶基因MAPK3的蛋白編碼區(qū)DNA片段，其長度為1.2 kb，利用T-A克隆將目的基因插入pMD18-T中，構(gòu)建了含有靶基因的pMD18-T-MAPK3GST；DNA測序結(jié)果證明pMD18-T-MAPK3GST正是所需質(zhì)粒，MAPK3基因蛋白編碼區(qū)無任何點突變；用限制性核酸內(nèi)切酶雙酶切原核表達質(zhì)粒pGEX-4t-1和pMD18-T-MAPK3GST，重組后獲得pGEX-MAPK3GST，酶切鑒定證實該質(zhì)粒與預(yù)期結(jié)果一致；DNA測序結(jié)果顯示人MAPK3蛋白編碼區(qū)正確插入了原核表達載體中，成功構(gòu)建了原核表達質(zhì)粒pGEX-MAPK3GST。見圖1。

注：A為RT-PCR擴增MAPK3基因的蛋白編碼區(qū)，B為EcoR Ⅰ/Xho Ⅰ雙酶切原核表達質(zhì)粒pGEX-4t-1和pMD18-T-MAPK3GST，C為EcoR Ⅰ/Xho Ⅰ雙酶切重組原核表達質(zhì)粒pGEX- MAPK3GST，D為pGEX- MAPK3GST質(zhì)粒圖譜，E為pMD18-T-MAPK3GST DNA測序，F(xiàn)為pGEX- MAPK3GST DNA測序。圖1 人MAPK3基因克隆及其原核表達載體pGEX-MAPK3GST構(gòu)建Fig.1 Cloning of human MAPK3 gene and construction of its prokaryotic expression plasmid pGEX-MAPK3GST

2.2 MAPK3融合蛋白表達、純化及鑒定

將重組的原核表達質(zhì)粒pGEX-MAPK3GST導入Rosetta細菌(DE3)中，用IPTG誘導GST-MAPK3融合蛋白表達。結(jié)果如圖2所示，當細菌被誘導后在70 kDa之上出現(xiàn)了大量的蛋白；破碎菌體后，分別對上清液和沉淀進行變性膠電泳和考馬斯亮藍染色，發(fā)現(xiàn)誘導蛋白同時出現(xiàn)在上清和沉淀中；用Glutathione Sepharose 4B瓊脂糖凝膠與上清液雜交，獲得的蛋白液進行變性膠電泳和考馬斯亮藍染色，在70 kDa之上出現(xiàn)了單一的蛋白條帶；蛋白免疫印跡結(jié)果顯示，該目的條帶正是GST-MAPK3融合蛋白。

注：1為Thermo Scientific PageRuler Pierce 26616，2為未誘導的細菌，3為IPTG誘導的細菌，4為菌體破碎后的上清液，5為菌體破碎后的沉淀物，6為純化的GST-MAPK3融合蛋白。圖2 融合蛋白GST-MAPK3的考馬斯亮藍染色及蛋白免疫印跡分析Fig.2 Coomassie bright blue staining and Western blot of the purified fusion protein GST-MAPK3

3 討論

MAPK家族成員較多，如p38MAPK、JNK等，且不斷有新成員加入，這些成員參與了真核細胞的重要信號轉(zhuǎn)導和網(wǎng)絡(luò)調(diào)控，影響多種細胞的生長、增殖、分化、遷移、凋亡及炎癥等生理[14]。不同的MAPK具有相似的作用，也存在各自特異的生物學功能[15]。在這些成員中，由于MAPK3與MAPK1在蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)上具有85%的相似性，因此具有諸多類似的生物學功能，兩者也通常被歸為一類并寫成MAPK1/3或者ERK1/2[14-15]。盡管如此，兩者之間蛋白結(jié)構(gòu)和生物學功能仍有差異，與分子量42 kDa的MAPK1相比，MAPK3的N-末端多了一段特有的氨基酸序列，使其分子量比MAPK1多出了2 kDa，導致胞質(zhì)中磷酸化活化的MAPK3入核速度低于MAPK1，因此細胞核內(nèi)MAPK3整體磷酸化水平低于MAPK1的磷酸化水平，使MAPK3攜帶細胞增殖信號的能力下降[15]。此外，MAPK3還有許多不同于MAPK1的特異生物學功能，能夠誘導脂肪細胞分化、引起肥胖[16]；能誘導破骨細胞，形成和保護N-甲基-D-天冬氨酸誘導的視網(wǎng)膜損傷[17]。因此，除了研究MAPK1/3的共同生物學功能外，非常有必要單獨研究MAPK3的生物學功能。為研究MAPK3蛋白在肝臟生理條件下和病理過程中的生物學功能，首先需要獲得MAPK3蛋白。為此本課題組通過TRIzol法從人肝細胞中抽提獲得總RNA，以此總RNA為模板通過RT-PCR體外擴增獲得人MAPK3基因的蛋白編碼區(qū)，利用DNA測序技術(shù)驗證體外擴增獲得的cDNA片段正是人MAPK3基因的蛋白編碼區(qū)，且未發(fā)生任何突變；隨后將該cDNA片段通過限制性核酸內(nèi)切酶EcoR Ⅰ/XhoⅠ插入到原核表達載體pGEX-4t-1中，構(gòu)建重組原核表達質(zhì)粒pGEX-MAPK3GST；將重組質(zhì)粒用熱激法導入細菌Rosetta中，利用IPTG誘導宿主細菌表達可溶性融合蛋白GST-MAPK3，菌體破碎和高速離心獲取含有GST-MAPK3的蛋白混合液，再利用GST標簽的特性通過Glutathione Sepharose 4B瓊脂糖凝膠親和層析純化GST-MAPK3，用考馬斯亮藍法和蛋白免疫印跡法分別驗證蛋白純度及蛋白特異性，最終獲得較純的MAPK3蛋白，為下一步研究MAPK3的生物學功能奠定了基礎(chǔ)。

本研究利用了一種常用的、體外有效獲取基因片段的技術(shù)方法RT-PCR來獲取人MAPK3基因蛋白編碼區(qū)，該技術(shù)始于1985年，現(xiàn)已成為當前分子生物學領(lǐng)域應(yīng)用最廣和最熱門的一項技術(shù)[17-19]。該技術(shù)的廣泛普及得益于多種性能的Taq DNA聚合酶的開發(fā)和創(chuàng)新[20-22]。本研究利用了一種莫羅尼鼠白血病病毒(moloney murine leukemia virus，MMLV)來源、通過基因改造的可抑制RNA高級結(jié)構(gòu)和錯配延伸的反轉(zhuǎn)錄酶及高保真長鏈擴增DNA聚合酶，單次實驗就實現(xiàn)了從人肝細胞總RNA中獲得了MAPK3基因蛋白編碼區(qū)。

原核表達是一種大量、快速制備目的蛋白的有效方法，與真核表達和體外無細胞翻譯系統(tǒng)相比，其具有目的蛋白表達量多、蛋白制備和純化程序簡單及原材料經(jīng)濟等優(yōu)點，是有效獲取目的蛋白的重要方式之一[23-24]。本研究通過重組原核表達質(zhì)粒pGEX-MAPK3GST在細菌中大量誘導表達融合蛋白GST-MAPK3，并利用融合蛋白中的GST標簽增加目的表達蛋白的水溶性，使原核表達的蛋白不容易形成包涵體，使目的蛋白在自然條件下正確折疊；同時，利用GST標簽蛋白與Glutathione Sepharose 4B具有親和力的特性，通過親和層析從細菌蛋白混合液中分離純化MAPK3目的蛋白。

研究表明，MAPK1/3能夠促進細胞中角蛋白18(cytokeration 18，CK18)再表達，而表達的CK18可能會反向作用于MAPK1/3，影響其激酶活性，從而反饋性調(diào)控細胞生理和細胞活動；另一方面，蛋白激酶C(protein kinase C epsilon，PKC)活性可以調(diào)控MAPK1/3的活性[25]，而PKC與CK18的磷酸化具有密切聯(lián)系，本研究成功克隆人MAPK3基因并獲得MAPK3蛋白，可用于體外研究MAPK3對CK18的磷酸化作用。因此，在獲得了純化的MAPK3融合蛋白的基礎(chǔ)上，為后續(xù)研究MAPK3、PKCε及CK18之間的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。