賈義, 代杰, 楊潔, 張亮亮, 曾柱
(貴州醫(yī)科大學(xué) 生物與工程學(xué)院, 貴州 貴陽 550025)
硒是人體和哺乳動物所必需的微量元素,具有抗氧化、提高紅細(xì)胞攜氧能力及提高人體免疫力、解毒排毒抗污染等作用,亦與腫瘤等多種疾病相關(guān)[1]。硒的生物功能主要是通過硒蛋白實(shí)現(xiàn),通過實(shí)驗(yàn)和生物信息學(xué)的方法已經(jīng)從人類基因組中發(fā)現(xiàn)了25種硒蛋白[2]。硒結(jié)合蛋白1(selenium-binding protein 1,SBP1)是一種結(jié)合硒原子的含硒蛋白,于1989年被發(fā)現(xiàn),主要定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核[3-5];與正常組織器官相比,癌組織中的SBP1表達(dá)水平存在顯著下降甚至丟失[6-7],比如胃癌、肺癌、肝癌、前列腺癌、卵巢癌和乳房癌等。缺氧誘導(dǎo)因子(hypxia-inducible factor-lalpha,HIF-la)參與了腫瘤血管的生成和能量代謝,而SBP1蛋白表達(dá)水平的明顯下降增加了HIF-1a的穩(wěn)定性[8],因此,SBP1可能成為潛在的抗腫瘤靶點(diǎn)[9]。巨噬細(xì)胞具有吞噬和趨化性遷移的作用[10-11],是人體非特異性免疫的重要一員,在腫瘤增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[12],巨噬細(xì)胞在原發(fā)和繼發(fā)腫瘤中被稱為腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞,是腫瘤間質(zhì)中細(xì)胞數(shù)量最多的群體[13]。研究發(fā)現(xiàn),硒蛋白參與了免疫功能的調(diào)節(jié),硒蛋白K(selenoprotein K,SELENOK)敲除可以影響T細(xì)胞的增殖和遷移[14]、硒蛋白T(selenoprotein T,SELENOT)參與了免疫相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)調(diào)控[15]、蛋氨酸亞砜還原酶B1(methionine sulfoxide reductase B1,MSRB1)參與了巨噬細(xì)胞中抗炎癥因子的表達(dá)[16];此外,硒蛋白S(selenoprotein S,SELENOS)、硒蛋白F(selenoprotein F,SELENOF)和谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)也參與了免疫應(yīng)激[17]??紤]到巨噬細(xì)胞和SBP1在癌癥發(fā)展中的作用以及硒蛋白對免疫功能的調(diào)節(jié),沉默SBP1基因是否對巨噬細(xì)胞中硒蛋白的表達(dá)具有調(diào)節(jié)作用是一個(gè)值得研究的方向。本項(xiàng)目將單核細(xì)胞株THP-1分化為M0型巨噬細(xì)胞,檢測SBP1基因沉默對巨噬細(xì)胞硒蛋白表達(dá)水平的影響,為SBP1參與調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞功能提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
1.1.1細(xì)胞來源 人單核細(xì)胞株THP-1購于美國模式培養(yǎng)物集存庫(american type culture collection, ATCC)。
1.1.2主要試劑和儀器 RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、雙抗購于美國Gibco公司,佛波酯購于北京索來寶科技有限公司,引物序列由上海生工生物合成,Lipofectmine 3000、Trizol購于美國Invitrogen公司,PCR試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green PCR Master Mix kit購于美國Thermo 公司,SBP1和GAPDH抗體購于美國Santa Cruz公司。CO2培養(yǎng)箱、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購于美國Thermo 公司。
1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) THP-1細(xì)胞用含10%胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),用50 μg/L的佛波酯誘導(dǎo)培養(yǎng)48 h后獲得M0巨噬細(xì)胞。
1.2.2基因沉默 將M0巨噬細(xì)胞接種于6孔板中,分為空白對照組(C組,含轉(zhuǎn)染試劑)、陰性對照組(NC組, 含轉(zhuǎn)染試劑和陰性對照引物)和沉默組(Si組, 含轉(zhuǎn)染試劑和SBP1 siRNA引物),培養(yǎng)24 h后根據(jù)Lipofectmine 3000轉(zhuǎn)染試劑說明對細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染24 h或48 h后收集細(xì)胞用于后續(xù)檢測。SBP1 siRNA上下游引物序列分別為5′-CUUGGAGGCACCAAGAAAUTT-3′(sense),5′-AUUUCUUGGUGCCUCCAAGTT-3′(antisense)。陰性對照上下游引物序列分別為5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′(sense),5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′(antisense)。
1.2.3SBP1和硒蛋白基因表達(dá)檢測 使用Trizol試劑從M0巨噬細(xì)胞提取總RNA,用隨機(jī)引物和逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA,按照試劑盒說明進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。SBP1和硒蛋白(GPX1、SELENOH、SELENOK、SELENOS、SELENOT、SELENOV、SELENOW、TXNRD3和SEPHS2)的引物序列見表1。PCR反應(yīng)條件參照SYBR Green PCR Master Mix kit設(shè)置,以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參,利用2-ΔΔCT方法計(jì)算目標(biāo)基因的表達(dá)水平[18]。
表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列Tab.1 List of primers for real-time PCR
1.2.4SBP1蛋白表達(dá)檢測 收集處理好的細(xì)胞后用含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液提取總蛋白,BCA法測定蛋白濃度,取60 μg樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳;轉(zhuǎn)膜后經(jīng)一抗孵育,SBP1和GAPDH抗體稀釋比例分別為1 ∶1 000和1 ∶3 000。二抗孵育后用ECL發(fā)光液進(jìn)行檢測。
基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在SBP1基因沉默巨噬細(xì)胞中,SBP1 mRNA表達(dá)水平被抑制了76%左右,與對照組(C組)相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001,圖1),表明巨噬細(xì)胞中SBP1的mRNA表達(dá)被抑制。
注:(1)與C組比較,P<0.001。圖1 SBP1基因沉默后巨噬細(xì)胞SBP1 mRNA的表達(dá)水平Fig.1 SBP1 mRNA expression level in SBP1-gene silencing macrophage
結(jié)果顯示,在SBP1基因沉默的巨噬細(xì)胞中, SBP1蛋白水平被抑制了50%,與C組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。表明巨噬細(xì)胞中SBP1蛋白的表達(dá)被抑制。
注:(1)與C組比較,P<0.05。圖2 SBP1基因沉默后巨噬細(xì)胞SBP1蛋白表達(dá)水平Fig.2 SBP1 protein expression level in SBP1-gene silencing macrophage
硒蛋白基因表達(dá)檢測結(jié)果顯示,在SBP1基因沉默的巨噬細(xì)胞中,硒蛋白SEPHS2、SELENOH、TXNRD3、GPX1、SELENOK和SELENOSmRNA表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.001),硒蛋白MSRB1、SELENOT和SELENOWmRNA表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.01),硒蛋白SELENOVmRNA表達(dá)量不變(P>0.05)。見圖3。
注:與C組比較,(1)P<0.001,(2)P<0.01。圖3 SBP1基因沉默后巨噬細(xì)胞中硒蛋白mRNA表達(dá)水平的變化Fig.3 Changes of selenprotein mRNA levels in macrophages after SBP1 gene silencing
硒主要以硒蛋白的形式存在于體內(nèi),研究發(fā)現(xiàn),硒蛋白在免疫反應(yīng)等多方面發(fā)揮重要的生理作用[19]。而巨噬細(xì)胞是非特異性免疫系統(tǒng)中主要的效應(yīng)細(xì)胞,可通過多種途徑影響其他免疫細(xì)胞的功能活性,對于特異性免疫應(yīng)答也起著重要的作用[19]。近年來,研究發(fā)現(xiàn)硒蛋白對巨噬細(xì)胞功能具有重要的調(diào)節(jié)著作用[19]。為了進(jìn)一步研究SBP1對巨噬細(xì)胞中部分硒蛋白的影響,本實(shí)驗(yàn)以單核細(xì)胞株THP-1誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞為研究對象,分析了SBP1基因沉默對硒蛋白SEPHS2、SELENOH、TXNRD3、GPX1、SELENOK、SELENOS、MSRB1、SELENOT、SELENOW和SELENOVmRNA表達(dá)的影響,這對深入了解SBP1是否參與巨噬細(xì)胞的免疫功能具有重要意義。
SELENOK、SELENOS、SELENOT、SELENOW是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位硒蛋白,在鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)、氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮重要作用,均參與了免疫功能的調(diào)節(jié)[14-15,17,20]。SELENOH通過氧化還原作用參與人體內(nèi)各種生理作用[21],可以調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的增殖[22],在LPS誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞中表達(dá)量下降[23];MSRBl位于細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì),具有氧化還原活性,可調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞中抗炎因子的表達(dá)[16];GPX1具有抗氧化作用,是谷胱甘肽過氧化物酶家族成員,GPX1敲除小鼠可以導(dǎo)致巨噬細(xì)胞數(shù)量減少[24];TXNRD3是硫氧還蛋白還原酶,在硫氧還蛋白存在時(shí),具有氧化還原活性,參與胰島素中炎癥的調(diào)節(jié)。研究表明,GPX1與TXNRD可以發(fā)揮互補(bǔ)作用,在調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答平衡過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用;GPX1與SELENOW之間存在一定的代償性,SELENOW表達(dá)降低可導(dǎo)致GPX1表達(dá)升高[25]。這與本文的研究結(jié)果一致。人結(jié)腸直腸癌或乳腺癌中SBP1的過表達(dá)可以導(dǎo)致GPX1酶活的減少,GPX1表達(dá)增加會導(dǎo)致SBP1的轉(zhuǎn)錄和翻譯抑制,表明GPX1和SBP1表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)[11]。本文結(jié)果顯示巨噬細(xì)胞中SBP1被抑制后,GPX1表達(dá)水平升高。
根據(jù)本文的研究結(jié)果,可以推測SBP1與部分硒蛋白之間存在一種補(bǔ)償機(jī)制,當(dāng)SBP1表達(dá)降低時(shí),SEPHS2、SELENOH、TXNRD3、GPX1、SELENOK和SELENOSmRNA的表達(dá)升高,而SBP1與MSRB1、SELENOT和SELENOW的表達(dá)存在正相關(guān)性。因此,探討SBP1基因沉默對巨噬細(xì)胞中硒蛋白表達(dá)水平的影響,研究SBP1與硒蛋白組之間可能存在的補(bǔ)償機(jī)制,為SBP1參與巨噬細(xì)胞免疫功能的調(diào)節(jié)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
總之,SBP1基因沉默的巨噬細(xì)胞,硒蛋白SEPHS2、SELENOH、TXNRD3、GPX1、SELENOK和SELENOSmRNA表達(dá)上調(diào),硒蛋白MSRB1、SELENOT和SELENOWmRNA表達(dá)下調(diào),硒蛋白SELENOVmRNA表達(dá)不變。SBP1基因沉默可以調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞硒蛋白的表達(dá)。
貴州醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)2021年10期