賈義， 代杰， 楊潔， 張亮亮， 曾柱

(貴州醫(yī)科大學(xué) 生物與工程學(xué)院， 貴州 貴陽(yáng) 550025)

硒是人體和哺乳動(dòng)物所必需的微量元素，具有抗氧化、提高紅細(xì)胞攜氧能力及提高人體免疫力、解毒排毒抗污染等作用，亦與腫瘤等多種疾病相關(guān)[1]。硒的生物功能主要是通過(guò)硒蛋白實(shí)現(xiàn)，通過(guò)實(shí)驗(yàn)和生物信息學(xué)的方法已經(jīng)從人類基因組中發(fā)現(xiàn)了25種硒蛋白[2]。硒結(jié)合蛋白1(selenium-binding protein 1，SBP1)是一種結(jié)合硒原子的含硒蛋白，于1989年被發(fā)現(xiàn)，主要定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核[3-5]；與正常組織器官相比，癌組織中的SBP1表達(dá)水平存在顯著下降甚至丟失[6-7]，比如胃癌、肺癌、肝癌、前列腺癌、卵巢癌和乳房癌等。缺氧誘導(dǎo)因子(hypxia-inducible factor-lalpha，HIF-la)參與了腫瘤血管的生成和能量代謝，而SBP1蛋白表達(dá)水平的明顯下降增加了HIF-1a的穩(wěn)定性[8]，因此，SBP1可能成為潛在的抗腫瘤靶點(diǎn)[9]。巨噬細(xì)胞具有吞噬和趨化性遷移的作用[10-11]，是人體非特異性免疫的重要一員，在腫瘤增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[12]，巨噬細(xì)胞在原發(fā)和繼發(fā)腫瘤中被稱為腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞，是腫瘤間質(zhì)中細(xì)胞數(shù)量最多的群體[13]。研究發(fā)現(xiàn)，硒蛋白參與了免疫功能的調(diào)節(jié)，硒蛋白K(selenoprotein K，SELENOK)敲除可以影響T細(xì)胞的增殖和遷移[14]、硒蛋白T(selenoprotein T，SELENOT)參與了免疫相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)調(diào)控[15]、蛋氨酸亞砜還原酶B1(methionine sulfoxide reductase B1，MSRB1)參與了巨噬細(xì)胞中抗炎癥因子的表達(dá)[16]；此外，硒蛋白S(selenoprotein S，SELENOS)、硒蛋白F(selenoprotein F，SELENOF)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4(glutathione peroxidase 4，GPX4)也參與了免疫應(yīng)激[17]?？紤]到巨噬細(xì)胞和SBP1在癌癥發(fā)展中的作用以及硒蛋白對(duì)免疫功能的調(diào)節(jié)，沉默SBP1基因是否對(duì)巨噬細(xì)胞中硒蛋白的表達(dá)具有調(diào)節(jié)作用是一個(gè)值得研究的方向。本項(xiàng)目將單核細(xì)胞株THP-1分化為M0型巨噬細(xì)胞，檢測(cè)SBP1基因沉默對(duì)巨噬細(xì)胞硒蛋白表達(dá)水平的影響，為SBP1參與調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞功能提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞來(lái)源 人單核細(xì)胞株THP-1購(gòu)于美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)(american type culture collection, ATCC)。

1.1.2主要試劑和儀器 RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、雙抗購(gòu)于美國(guó)Gibco公司，佛波酯購(gòu)于北京索來(lái)寶科技有限公司，引物序列由上海生工生物合成，Lipofectmine 3000、Trizol購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司，PCR試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green PCR Master Mix kit購(gòu)于美國(guó)Thermo 公司，SBP1和GAPDH抗體購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司。CO2培養(yǎng)箱、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)于美國(guó)Thermo 公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) THP-1細(xì)胞用含10%胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，用50 μg/L的佛波酯誘導(dǎo)培養(yǎng)48 h后獲得M0巨噬細(xì)胞。

1.2.2基因沉默 將M0巨噬細(xì)胞接種于6孔板中，分為空白對(duì)照組(C組，含轉(zhuǎn)染試劑)、陰性對(duì)照組(NC組, 含轉(zhuǎn)染試劑和陰性對(duì)照引物)和沉默組(Si組, 含轉(zhuǎn)染試劑和SBP1 siRNA引物)，培養(yǎng)24 h后根據(jù)Lipofectmine 3000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染24 h或48 h后收集細(xì)胞用于后續(xù)檢測(cè)。SBP1 siRNA上下游引物序列分別為5′-CUUGGAGGCACCAAGAAAUTT-3′(sense)，5′-AUUUCUUGGUGCCUCCAAGTT-3′(antisense)。陰性對(duì)照上下游引物序列分別為5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′(sense)，5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′(antisense)。

1.2.3SBP1和硒蛋白基因表達(dá)檢測(cè) 使用Trizol試劑從M0巨噬細(xì)胞提取總RNA，用隨機(jī)引物和逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA，按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。SBP1和硒蛋白(GPX1、SELENOH、SELENOK、SELENOS、SELENOT、SELENOV、SELENOW、TXNRD3和SEPHS2)的引物序列見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)條件參照SYBR Green PCR Master Mix kit設(shè)置，以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參，利用2-ΔΔCT方法計(jì)算目標(biāo)基因的表達(dá)水平[18]。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列Tab.1 List of primers for real-time PCR

1.2.4SBP1蛋白表達(dá)檢測(cè) 收集處理好的細(xì)胞后用含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，取60 μg樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳；轉(zhuǎn)膜后經(jīng)一抗孵育，SBP1和GAPDH抗體稀釋比例分別為1 ∶1 000和1 ∶3 000。二抗孵育后用ECL發(fā)光液進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 SBP1 mRNA表達(dá)水平

基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在SBP1基因沉默巨噬細(xì)胞中，SBP1 mRNA表達(dá)水平被抑制了76%左右，與對(duì)照組(C組)相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001，圖1)，表明巨噬細(xì)胞中SBP1的mRNA表達(dá)被抑制。

注：(1)與C組比較，P<0.001。圖1 SBP1基因沉默后巨噬細(xì)胞SBP1 mRNA的表達(dá)水平Fig.1 SBP1 mRNA expression level in SBP1-gene silencing macrophage

2.2 SBP1蛋白表達(dá)水平

結(jié)果顯示，在SBP1基因沉默的巨噬細(xì)胞中， SBP1蛋白水平被抑制了50%，與C組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2。表明巨噬細(xì)胞中SBP1蛋白的表達(dá)被抑制。

注：(1)與C組比較，P<0.05。圖2 SBP1基因沉默后巨噬細(xì)胞SBP1蛋白表達(dá)水平Fig.2 SBP1 protein expression level in SBP1-gene silencing macrophage

2.3 SBP1基因沉默對(duì)巨噬細(xì)胞中硒蛋白mRNA表達(dá)水平的影響

硒蛋白基因表達(dá)檢測(cè)結(jié)果顯示，在SBP1基因沉默的巨噬細(xì)胞中，硒蛋白SEPHS2、SELENOH、TXNRD3、GPX1、SELENOK和SELENOSmRNA表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.001)，硒蛋白MSRB1、SELENOT和SELENOWmRNA表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.01)，硒蛋白SELENOVmRNA表達(dá)量不變(P>0.05)。見(jiàn)圖3。

注：與C組比較，(1)P<0.001,(2)P<0.01。圖3 SBP1基因沉默后巨噬細(xì)胞中硒蛋白mRNA表達(dá)水平的變化Fig.3 Changes of selenprotein mRNA levels in macrophages after SBP1 gene silencing

3 討論

硒主要以硒蛋白的形式存在于體內(nèi)，研究發(fā)現(xiàn)，硒蛋白在免疫反應(yīng)等多方面發(fā)揮重要的生理作用[19]。而巨噬細(xì)胞是非特異性免疫系統(tǒng)中主要的效應(yīng)細(xì)胞，可通過(guò)多種途徑影響其他免疫細(xì)胞的功能活性，對(duì)于特異性免疫應(yīng)答也起著重要的作用[19]。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)硒蛋白對(duì)巨噬細(xì)胞功能具有重要的調(diào)節(jié)著作用[19]。為了進(jìn)一步研究SBP1對(duì)巨噬細(xì)胞中部分硒蛋白的影響，本實(shí)驗(yàn)以單核細(xì)胞株THP-1誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞為研究對(duì)象，分析了SBP1基因沉默對(duì)硒蛋白SEPHS2、SELENOH、TXNRD3、GPX1、SELENOK、SELENOS、MSRB1、SELENOT、SELENOW和SELENOVmRNA表達(dá)的影響，這對(duì)深入了解SBP1是否參與巨噬細(xì)胞的免疫功能具有重要意義。

SELENOK、SELENOS、SELENOT、SELENOW是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位硒蛋白，在鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)、氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮重要作用，均參與了免疫功能的調(diào)節(jié)[14-15,17,20]。SELENOH通過(guò)氧化還原作用參與人體內(nèi)各種生理作用[21]，可以調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的增殖[22]，在LPS誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞中表達(dá)量下降[23]；MSRBl位于細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)，具有氧化還原活性，可調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞中抗炎因子的表達(dá)[16]；GPX1具有抗氧化作用，是谷胱甘肽過(guò)氧化物酶家族成員，GPX1敲除小鼠可以導(dǎo)致巨噬細(xì)胞數(shù)量減少[24]；TXNRD3是硫氧還蛋白還原酶，在硫氧還蛋白存在時(shí)，具有氧化還原活性，參與胰島素中炎癥的調(diào)節(jié)。研究表明，GPX1與TXNRD可以發(fā)揮互補(bǔ)作用，在調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答平衡過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用；GPX1與SELENOW之間存在一定的代償性，SELENOW表達(dá)降低可導(dǎo)致GPX1表達(dá)升高[25]。這與本文的研究結(jié)果一致。人結(jié)腸直腸癌或乳腺癌中SBP1的過(guò)表達(dá)可以導(dǎo)致GPX1酶活的減少，GPX1表達(dá)增加會(huì)導(dǎo)致SBP1的轉(zhuǎn)錄和翻譯抑制，表明GPX1和SBP1表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)[11]。本文結(jié)果顯示巨噬細(xì)胞中SBP1被抑制后，GPX1表達(dá)水平升高。

根據(jù)本文的研究結(jié)果，可以推測(cè)SBP1與部分硒蛋白之間存在一種補(bǔ)償機(jī)制，當(dāng)SBP1表達(dá)降低時(shí)，SEPHS2、SELENOH、TXNRD3、GPX1、SELENOK和SELENOSmRNA的表達(dá)升高，而SBP1與MSRB1、SELENOT和SELENOW的表達(dá)存在正相關(guān)性。因此，探討SBP1基因沉默對(duì)巨噬細(xì)胞中硒蛋白表達(dá)水平的影響，研究SBP1與硒蛋白組之間可能存在的補(bǔ)償機(jī)制，為SBP1參與巨噬細(xì)胞免疫功能的調(diào)節(jié)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

總之，SBP1基因沉默的巨噬細(xì)胞，硒蛋白SEPHS2、SELENOH、TXNRD3、GPX1、SELENOK和SELENOSmRNA表達(dá)上調(diào)，硒蛋白MSRB1、SELENOT和SELENOWmRNA表達(dá)下調(diào)，硒蛋白SELENOVmRNA表達(dá)不變。SBP1基因沉默可以調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞硒蛋白的表達(dá)。