趙子軒，楊 雪，魏 潔，陳曉梅

（集美大學(xué)海洋食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021）

新鮮度對水產(chǎn)品的品質(zhì)及原料的加工適性有重要影響[1]。隨著生活水平的提高，人們對于水產(chǎn)品的鮮度要求也越來越高。目前，水產(chǎn)品新鮮度評價方法主要包括常規(guī)的感官評價法以及特殊標(biāo)志物測定法[2]。前者操作繁瑣、費(fèi)時且重復(fù)性差，相較而言，特殊標(biāo)志物測定法準(zhǔn)確性好、靈敏度高，因此受到研究者的廣泛關(guān)注[3]。

次黃嘌呤（hypoxanthine，Hx）作為一種重要的生物堿，是三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）的主要分解代謝產(chǎn)物[4]。水產(chǎn)品死亡后，體內(nèi)的ATP在酶的作用下發(fā)生一系列降解反應(yīng)，產(chǎn)生Hx，其主要步驟如下：三磷酸腺苷→二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）→ 單磷酸腺苷（adenosine monophosphate，AMP）→ 肌苷酸（inosinemonphosphate，IMP）→次黃嘌呤核苷（hypoxanthine ribonucleoside，HxR）→Hx[5-6]。相比水產(chǎn)品鮮度的其他特征標(biāo)志物，Hx在水產(chǎn)品變質(zhì)的早期即產(chǎn)生[7]。因此，對Hx含量的準(zhǔn)確、快速測定有助于評估水產(chǎn)品的早期新鮮度，這對于保障水產(chǎn)品的食用安全性具有重要意義。

目前，Hx的傳統(tǒng)檢測方法主要有高效液相色譜法[8]、 毛細(xì)管電泳法[9]、酶電極傳感器法[10-12]等。這些方法需要相對昂貴的設(shè)備和熟練的技術(shù)人員，不適合應(yīng)用于Hx的現(xiàn)場快速檢測[3]。比色分析法是一種根據(jù)待測物質(zhì)顏色變化而建立起來的定量分析方法，具有操作簡便、快速、成本低的優(yōu)點[13]，在食品和環(huán)境污染物檢測方面?zhèn)涫荜P(guān)注[14-15]。Tang Yue等[16]合成了具有H2O2模擬酶活性的二維分層狀二硫化鎢納米片，當(dāng)體系中含有Pb（II）時，H2O2模擬酶活性受到抑制，使3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺（3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine，TMB）藍(lán)色氧化物生成量減少，導(dǎo)致650 nm波長處吸光度下降，從而實現(xiàn)對Pb（II）的靈敏檢測。Salem等[17]合成了對氨基苯甲酸穩(wěn)定的銀納米棒，與SO42－結(jié)合后銀納米棒發(fā)生聚集，反應(yīng)體系顏色由紅色變?yōu)樗{(lán)黑色，實現(xiàn)對水樣中SO42－的檢測。課題組在前期研究工作中，合成了具有模擬酶活性的鉑鈀納米花修飾石墨烯復(fù)合材料，結(jié)合TMB實現(xiàn)了對H2O2的比色檢測[18]。本實驗在前期研究工作的基礎(chǔ)上，通過室溫攪拌法合成半胱氨酸（cysteine，Cys）穩(wěn)定的銅納米簇（copper nanoclusters，CuNCs），以TMB為顯色劑，H2O2為底物，考察Cys-CuNCs的H2O2模擬酶活性，結(jié)合Hx在黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XOD）的作用下生成H2O2的特點，建立快速、靈敏檢測Hx的比色分析方法，并將其應(yīng)用于草魚魚肉鮮度的評價。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

草魚 廈門集美農(nóng)貿(mào)市場。

Hx（純度99%）、L-Cys（純度99%）、TMB（純度98%） 上海麥克林生化有限公司；黃嘌呤氧化酶 美國Sigma-Aldrich公司；二水合氯化銅（分析純） 西隴化工股份有限公司；實驗用水均為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

F30透射電子顯微鏡 美國FEI公司；Lambda 265紫外-可見分光光度計、LS55熒光分光光譜儀 鉑金埃爾默股份有限公司；Nicolet iS50傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectrometer，F(xiàn)TIR）儀 美國 賽默飛世爾科技公司；ME204分析天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；TG16-WS臺式高速離心機(jī) 昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；RH D S25加熱磁力攪拌器 德國IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 Cys-CuNCs的制備

參考文獻(xiàn)[19]的制備方法。首先，在劇烈攪拌下向10 mL 5 mmol/L CuCl2溶液中逐滴加入10 mL 5 mmol/L Cys溶液，此時，溶液由淡藍(lán)色變?yōu)樽仙?。在室溫下繼續(xù)攪拌15 min，利用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)溶液pH 12，此時，溶液變?yōu)榛液谏?。繼續(xù)攪拌2 h后，溶液呈青綠色。將所得溶液在9 000 r/min離心15 min，收集上清液重復(fù)離心3 次，用截留分子質(zhì)量為3 500 Da的透析袋避光透析24 h，得到Cys-CuNCs，于4 ℃冰箱密封保存。

1.3.2 Cys-CuNCs模擬酶活性的測試

以TMB為顯色劑，H2O2為底物，測試Cys-CuNCs的過氧化物模擬酶活性。實驗步驟如下：將10 μL 1.0 mg/mL 的Cys-CuNCs加入2 mL含有1 mmol/L TMB溶液和0.1 mol/L NaAc緩沖液（pH 4.4）的混合溶液中，再加入50 μL的0.1 mol/L H2O2溶液。混合均勻后，室溫下靜置10 min，檢測在652 nm波長處的吸光度。

使用分光光度計在掃描動力學(xué)模式下記錄652 nm波長處的吸光度變化，研究過氧化物模擬酶的催化氧化反應(yīng)動力學(xué)。實驗分別通過固定TMB濃度測試不同濃度H2O2反應(yīng)速率、固定H2O2濃度測試不同濃度TMB反應(yīng)速率，在此基礎(chǔ)上，計算得到底物的米氏常數(shù)Km和最大反應(yīng)速率Vmax。動力學(xué)計算公式為米氏方程：

式中：V為初始速率/（mol/（L?s））；Vmax為最大反應(yīng)速率/（mol/（L?s））；[S]為底物濃度/（mol/L）；Km為米氏常數(shù)/（mol/L）。

1.3.3 Hx的測定

采用比色法進(jìn)行測定。過程如下：1）將50 μL 1 U/mL XOD加入2 mL含不同濃度Hx的磷酸鹽緩沖液中（pH 7.5，0.1 mol/L），30 ℃水浴反應(yīng)1 h；2）取0.2 mL水浴反應(yīng)產(chǎn)物加入Cys-CuNCs模擬酶反應(yīng)體系（同 1.3.2節(jié)）中；3）將混合溶液在室溫中反應(yīng)10 min，測定混合溶液在652 nm波長處的吸光度。每組實驗重復(fù)檢測3 次，吸光度取平均值。

1.3.4 魚肉樣品的檢測

將新鮮草魚剔除魚頭、魚鱗、魚皮及內(nèi)臟部分，在25 ℃保存，每隔5 h沿背脊取肌肉部分在4 ℃均質(zhì)混勻。取均質(zhì)后的樣品5 g加入20 mL 10%高氯酸溶液中，渦旋振蕩1 min后，在4 ℃、8 000 r/min離心10 min，取上清液。用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)溶液pH值至6.0。隨后按照1.3.3節(jié)進(jìn)行Hx濃度的測定，每組做3 個平行樣品，結(jié)果取平均值。同時取均質(zhì)后的樣品20 g按照GB 5009.228—2016《食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》[20]中微量擴(kuò)散法測定樣品的揮發(fā)性鹽基氮（total volatile base nitrogen，TVB-N）含量，每組做3 個平行樣品，結(jié)果取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cys-CuNCs的表征

圖1A為Cys-CuNCs、Cys和CuCl2的紫外-可見吸收光譜圖，相比Cys和CuCl2的譜圖，Cys-CuNCs在波長300～400 nm之間出現(xiàn)一個寬吸收峰，而在波長500～600 nm之間沒有明顯的吸收峰。這表明合成的是粒徑較小的CuNCs[21]。從圖1B可以看出，當(dāng)激發(fā)波長為370 nm時，在495 nm波長處出現(xiàn)Cys-CuNCs的熒光發(fā)射峰。插圖為Cys-CuNCs在日光和紫外燈下的照片，日光下Cys-CuNCs呈現(xiàn)淡藍(lán)綠色，紫外燈下發(fā)出明顯的藍(lán)色熒光。這與Cys-CuNCs的熒光發(fā)射波長相對應(yīng)，說明Cys-CuNCs成功合成。

圖1 Cys-CuNCs、Cys和CuCl2的紫外-可見吸收光譜（A）及 Cys-CuNCs的熒光光譜圖（B） Fig. 1 UV-vis absorption spectra of Cys-CuNCs, Cys and CuCl2 (A) and fluorescence spectrum of Cys-CuNCs (B)

從圖2A可見，Cys-CuNCs外觀呈圓粒狀，具有良好的分散性，顆粒大小均勻。進(jìn)一步統(tǒng)計分析，得到粒徑分布圖，如圖2B所示，粒徑集中分布在2～3 nm之間，平均粒徑為2.58 nm。

圖2 Cys-CuNCs的電子顯微鏡圖（A）及粒徑分布圖（B）Fig. 2 TEM image (A) and particle size distribution (B) of Cys-CuNCs

圖3A為Cys-CuNCs和Cys的FTIR譜圖。Cys譜圖中的特征峰可標(biāo)記為在1 598.80 cm－1處的（COO—）不對稱拉伸，3 193.63 cm－1處的（—OH）寬吸收峰以及在2 546.55 cm－1處（—SH）的弱峰。Cys-CuNCs的FTIR光譜與Cys大致相似，但未觀察到—SH的吸收峰，證實了S-Cu的相互作用[22-23]。此外，由于高電子致密金屬銅和Cys結(jié)合導(dǎo)致其偶極矩發(fā)生變化，Cys-CuNCs光譜中其他基團(tuán)的特征振動吸收頻率相對于Cys略有不同。實驗通過X射線光電子能譜（X-ray photoelectron spectroscopy，XPS）技術(shù)研究Cys-CuNCs表面的化合價態(tài)， 從圖3B可知，Cu在932.2 eV和952.5 eV處各有一個峰，而在942 eV處未觀測到明顯的峰，表明Cu表面主要為 Cu（I）和Cu（0）[24]。

圖3 Cys-CuNCs和Cys的FTIR譜圖（A）及Cys-CuNCs中 Cu 2p的XPS圖（B）Fig. 3 FTIR spectra of Cys-CuNCs and Cys (A) and XPS energy spectrum of Cu 2p of Cys-CuNCs (B)

2.2 Cys-CuNCs過氧化物擬酶活性分析

為研究Cys-CuNCs的過氧化物模擬酶活性，實驗以H2O2為底物，TMB為顯色劑，考察模擬酶體系的紫外-可見吸收光譜。如圖4A所示，當(dāng)體系同時含有H2O2、TMB、Cys-CuNCs時，在0～10 min內(nèi)，反應(yīng)體系在652 nm波長處的吸光度逐漸增強(qiáng)，插圖中反應(yīng)體系的顏色相應(yīng)地由無色變?yōu)樗{(lán)色。實驗對不同體系在652 nm波長處吸光度-時間曲線進(jìn)行研究，如圖4B所示，當(dāng)體系中只含H2O2、TMB時或只含Cys-CuNCs、TMB時，652 nm波長處的吸光度在10 min內(nèi)沒有明顯變化，只有同時存在H2O2、TMB、Cys-CuNCs時，652 nm波長處的吸光度增長明顯，表明Cys-CuNCs有明顯的過氧化物模擬酶活性。

圖4 H2O2＋TMB＋Cys-CuNCs體系的紫外-可見吸收光譜（A）及 不同反應(yīng)體系在652 nm波長處的吸光度-時間曲線（B）Fig. 4 UV-vis spectra of H2O2 + TMB + Cys-CuNCs (A) and absorbance-time curves of different reaction systems at 652 nm (B)

2.3 擬酶動力學(xué)分析

為確定擬酶的動力學(xué)參數(shù)，實驗分別改變TMB和H2O2的濃度，在最適條件下測定反應(yīng)體系在652 nm波長處的吸光度，運(yùn)用米氏方程獲得最大反應(yīng)速率Vmax和米氏常數(shù)Km。為得到更好的實驗條件，首先對緩沖液體系及其pH值進(jìn)行優(yōu)化，經(jīng)過實驗得知，采用NaAc緩沖體系，pH 4.4時，Cys-CuNCs對H2O2、TMB混合溶液有最大的吸光度，因此確定緩沖體系的最佳條件。動力學(xué)分析實驗結(jié)果表明，固定H2O2濃度調(diào)節(jié)TMB濃度，當(dāng)TMB濃度為1 mmol/L時，初速率達(dá)到最大值；固定TMB濃度調(diào)節(jié)H2O2濃度，當(dāng)H2O2濃度為12.5 mmol/L 時，初速率達(dá)到最大值。從表1可知，以TMB和H2O2為反應(yīng)底物時，Cys-CuNCs的Km值分別為 0.41 mmol/L和2.85 mmol/L，均比辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）的Km值低，說明Cys-CuNCs對TMB和H2O2的親和力均優(yōu)于HRP，可以實現(xiàn)對H2O2的靈敏檢測。

表1 Cys-CuNCs和HRP的酶動力學(xué)參數(shù)比較Table 1 Comparison of enzyme kinetic parameters between Cys-CuNCs and HRP

2.4 利用Cys-CuNCs檢測H2O2結(jié)果

由于制備的Cys-CuNCs具有良好的過氧化物模擬酶活性，利用Cys-CuNCs催化H2O2氧化TMB使溶液變藍(lán)的方法檢測H2O2。如圖5A所示，隨著H2O2濃度不斷增加，652 nm波長處的吸光度也逐漸增加。以H2O2濃度和652 nm波長處的吸光度建立線性關(guān)系，如圖5B所示，在5～100 μmol/L范圍內(nèi)H2O2濃度與吸光度呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為y=0.001 4x+0.032 7（y為652 nm波長處的吸光度，x為H2O2濃度（μmol/L）），R2為0.994 6，檢出限為0.8 μmol/L。結(jié)果表明，基于Cys-CuNCs模擬酶活性，可實現(xiàn)對H2O2的靈敏檢測。

圖5 加入不同濃度H2O2后H2O2＋TMB＋Cys-CuNCs體系的紫外-可見吸收光譜（A）和H2O2濃度對吸光度的影響（B）Fig. 5 UV-Vis spectra of H2O2 + TMB + Cys-CuNCs system added with different concentrations of H2O2 (A) and effect of different H2O2 concentrations on absorbance (B)

2.5 利用Cys-CuNCs檢測Hx

根據(jù)文獻(xiàn)報道[25]，在XOD的催化下，Hx與溶解氧反應(yīng)生成H2O2。方程式如下：

為得到更好的檢測效果，對上述反應(yīng)的孵育溫度和孵育時間進(jìn)行優(yōu)化。單因素試驗結(jié)果表明，當(dāng)孵育溫度30 ℃、反應(yīng)時間1 h時，反應(yīng)體系有最大的吸光度，因此在后續(xù)實驗中選擇30 ℃和1 h作為反應(yīng)體系的孵育溫度和孵育時間。XOD催化下產(chǎn)生的H2O2與Hx的量直接相關(guān)，Cys-CuNCs可催化H2O2，使其與TMB反應(yīng)，溶液變藍(lán)色，反應(yīng)體系在652 nm波長處的吸光度增加。依據(jù)上述原理，可實現(xiàn)對Hx的比色檢測。以Hx濃度和652 nm波長處的吸光度建立線性關(guān)系，Hx濃度與652 nm波長處的吸光度在4～100 μmol/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性方程為y=0.001 8x+0.022 1，R2=0.992 0（y為652 nm波長處吸光度，x為Hx濃度（μmol/L）），檢出限為1.2 μmol/L。 圖6為不同濃度Hx對反應(yīng)體系顏色的影響，隨著Hx濃度升高，反應(yīng)體系的顏色從無色透明逐漸變?yōu)樗{(lán)色，從而實現(xiàn)對Hx的比色測定。

圖6 Hx系列濃度反應(yīng)體系的顏色 Fig. 6 Color of reaction system with the different Hx concentrations

2.6 Cys-CuNCs的選擇性

為研究魚肉中可能存在的干擾物對傳感器性能的影響，實驗分別以葡萄糖、乳酸、抗壞血酸、尿酸為干擾物，在相同條件下測試這些物質(zhì)在652 nm波長處吸光度的變化。如圖7所示，添加等量物質(zhì)（100 μmol/L）后，Hx在652 nm波長處的吸光度有顯著變化，而添加其他物質(zhì)后，吸光度變化不明顯（A其他＜0.15AHx），表明所建立方法對Hx檢測有較好的選擇性和抗干擾能力。

圖7 不同干擾物對體系吸光度的影響Fig. 7 Effects of different interferents on the absorbance of the system

2.7 實際樣品的檢測

每隔5 h對25 ℃貯藏的草魚肉按照2.5節(jié)進(jìn)行處理，之后進(jìn)行Hx和TVB-N含量的測定，結(jié)果如圖8所示。草魚魚肉隨著時間變化，Hx和TVB-N含量變化趨勢基本一致，將Hx含量與TVB-N含量建立相關(guān)性，可實現(xiàn)對魚肉新鮮度的評價。在貯藏期0～20 h時，Hx和TVB-N含量增長較為平緩，此時魚肉品質(zhì)較為新鮮。在貯藏20 h后，Hx和TVB-N含量變化較為明顯，在此之后魚肉的變質(zhì)速率明顯加快。在30 h時，魚肉的TVB-N含量超過國標(biāo)規(guī)定的限定值（20 mg/100 g）[26]，此時魚肉已不再新鮮，所對應(yīng)的Hx含量為（1.09±0.02）mg/5 g。 因此，可以認(rèn)為當(dāng)魚肉中Hx含量超過（1.09± 0.02）mg/5 g時魚不再新鮮。

圖8 草魚死后25 ℃貯藏過程中Hx和TVB-N含量變化的關(guān)系圖Fig. 8 Relationship between the changes of hypoxanthine and TVB-N contents in grass carp muscle during postmortem storage at 25 ℃

3 結(jié) 論

本研究通過室溫攪拌法得到Cys穩(wěn)定的Cys-CuNCs，并對Cys-CuNCs的形貌、元素組成、表面官能團(tuán)和發(fā)光特征進(jìn)行表征。通過分析反應(yīng)體系的紫外-可見吸收光譜，驗證了Cys-CuNCs具有良好的過氧化物模擬酶活性，在此基礎(chǔ)上，實現(xiàn)對H2O2的靈敏檢測。結(jié)合XOD催化Hx生成H2O2的反應(yīng)，建立了一種檢測Hx的比色分析方法。Hx濃度在4～100 μmol/L內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系，檢出限為1.2 μmol/L。將該方法應(yīng)用于草魚魚肉中Hx含量的測定，同時根據(jù)魚肉中的TVB-N含量，建立Hx和新鮮度的相關(guān)性，實現(xiàn)對魚肉新鮮度的判斷。該檢測方法簡便快捷、靈敏可靠，研究結(jié)果將為其他肉類新鮮度檢測方法的改良積累基礎(chǔ)資料。