王雪瑩，高 亢，蔡吉垚，張森豪，解偉純，王曉娜,2，崔 文,2，姜艷平,2，周 晗,2，王 麗,2，喬薪瑗,2，徐義剛,2，李一經(jīng),2，唐麗杰,2*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，哈爾濱 150030; 2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物疫病病原生物學重點實驗室東北科學觀測實驗站，哈爾濱 150030)

豬沙門菌病(又稱豬副傷寒)，主要由豬霍亂沙門菌(S.Cholerasuis)、鼠傷寒沙門菌(S.Tyobimurium)，德爾卑沙門菌(S.Derby)和腸炎沙門菌(S.enteritidis)等血清型引起[1-2]。由豬霍亂沙門菌引起的沙門菌病[3]，以1～4月齡多發(fā)，臨床上可分為急性敗血癥、亞急性和慢性三種類型[4]，本病常引起較高的死亡率，其中敗血型病死率達90%，慢性型病死率達25%～50%[5-6]，在仔豬中導致代價高昂的腹瀉病，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失[7]。在過去的幾十年中，抗生素經(jīng)常被用于預防感染[8]。但是，由于抗生素耐藥性的潛在發(fā)展，畜牧業(yè)減少或停止添加這些獸藥的壓力越來越大。因此，如何提高斷乳仔豬的免疫力是一個亟待解決的問題[9]。

乳鐵蛋白肽(lactoferricin and lactoferrin ampin,LFCA)是乳鐵蛋白在酸性環(huán)境條件下經(jīng)胃蛋白酶作用，從其N端釋放的具有活性的多肽，其殺菌、抗氧化，調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)等功能要高于未發(fā)生酶解的乳鐵蛋白[10-13]。在動物生產(chǎn)中使用乳鐵蛋白活性肽，可以降低仔豬的缺鐵性貧血發(fā)病率、提高斷乳仔豬的免疫機能并改善其腸道微生態(tài)環(huán)境[14]，促進斷乳仔豬健康生長，可作為養(yǎng)殖生產(chǎn)中理想的飼用抗生素替代品候選制劑[15]。羅伊氏乳酸桿菌作為動物體內(nèi)廣泛分布的正常菌群，具有良好的益生功能和較強的黏附能力[16-17]。

本研究利用實驗室構建的表達牛乳鐵蛋白肽(LFCA)的無抗性重組菌pPG-LFCA-E/LR-CO21，通過蛋白質(zhì)印跡技術證實乳鐵蛋白肽的表達，并初步評價重組菌對斷乳仔豬生長的影響和對其感染豬霍亂沙門菌的保護作用，為pPG-LFCA-E/LR-CO21作為斷乳仔豬微生態(tài)制劑替代飼用抗生素提供堅實的理論依據(jù)與物質(zhì)基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 表達牛乳鐵蛋白肽的重組豬源羅伊氏乳酸桿菌pPG-LFCA-E/LR-CO21，豬霍亂沙門菌SalmonellaCholeraesuis CVCC79102，金黃色葡萄球菌StaphylococcusaureusCVCC546與大腸桿菌EscherichiacoliCVCC10141，由東北農(nóng)業(yè)大學微生物與免疫學實驗室保存，所有試驗均以指數(shù)生長期的細胞進行。

1.1.2 主要試劑 瓊脂粉、氯霉素、溶菌酶等購自北京索萊寶生物公司。IgG、IL-2、IL-4、IL-12、IL-6的細胞因子ELISA檢測試劑盒購自酶免公司；羅氏染料 LightCycler 480 SYBR Green I Master購自上海羅氏有限公司；LB培養(yǎng)基(酵母提取物0.5 g、胰蛋白胨1 g和氯化鈉1 g，定容至100 mL)；MRS培養(yǎng)基購自青島海博生物技術有限公司；小量質(zhì)粒DNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司

1.1.3 設備儀器 落地式超凈工作臺(Froma Scientific 1829型)；紫外分光光度計(Thermo Fisher)；立式高壓蒸汽滅菌鍋(SANYO)；恒溫搖床(上海知楚儀器有限公司)；-40 ℃超低溫冰箱(Revco公司)；凝膠成像系統(tǒng)(Life Science公司Champ Gel 6000)；轉(zhuǎn)膜儀(BIO-RAD)；切片機(Leica公司RM2235型)；熒光定量PCR儀(ABI Prism?7300型熒光定量PCR儀)

1.1.4 實驗動物 54只28日齡杜長大斷乳仔豬，購自東北農(nóng)業(yè)大學阿城實驗實習基地。

1.2 目的蛋白的表達鑒定及定量分析

取重組菌pPG-LFCA-E/LR-CO21、空菌pPG/LR-CO21發(fā)酵液在MRS固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，選取線上單個菌落于MRS液體培養(yǎng)基進行擴大培養(yǎng)，再以1∶100接入含有MRS培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中擴大培養(yǎng)。發(fā)酵時發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速為50 r·min-1，溫度37 ℃，pH5.5，提取菌液上清與菌體沉淀蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳和NC轉(zhuǎn)膜。一抗孵育1∶200稀釋的牛乳鐵蛋白肽單克隆抗體4E10，二抗孵育1∶5 000脫脂乳稀釋的HRP標記山羊抗鼠IgG抗體，ECL顯色。

另外利用已知濃度(2 μg·mL-1)人工合成的牛乳鐵蛋白肽作為陽性標準品，用PBS稀釋后檢測蛋白濃度，將蛋白包被96孔酶標板，設3個平行，3次重復試驗，1∶200比例稀釋制備的牛乳鐵蛋白肽單克隆抗體4E10作一抗，TMB顯色后，測定OD450 nm數(shù)值，繪制牛乳鐵蛋白肽濃度的標準曲線。將培養(yǎng)時間為8、10、12、14、16、18、20、22、24 h的重組羅伊氏乳酸桿菌pPG-LFCA/LR-CO21上清和菌體進行ELISA，根據(jù)標準曲線計算重組菌表達牛乳鐵蛋白肽的含量，最終得到重組菌表達牛乳鐵蛋白肽的最佳條件。

1.3 抗菌肽體外抑菌活性的測定

采用牛津杯法測定體外抑菌活性，以東北農(nóng)業(yè)大學微生物與免疫學實驗室保存的S.aureusCVCC546、S. Choleraesuis CVCC79102與E.coliCVCC10141為試驗菌株，將3種細菌懸浮液(OD600 nm=0.5)200 μL分別均勻鋪與于LB平板上。將牛津杯置于培養(yǎng)基表面輕輕按壓，以防漏液。通過將上清液過濾(0.22 μm)以獲得無細胞懸浮液(CFS)，向牛津杯中加入200 μL重組菌pPG-LFCA-E/LR-CO21無細胞上清液或200 μL空菌pPG/LR-CO21無細胞上清液。根據(jù)不同細菌最適生長溫度分別培養(yǎng)12 h。利用游標卡尺測量抑菌圈直徑。

1.4 實驗動物分組及飼喂程序

將54頭28日齡斷乳仔豬，隨機分成4組，前3組每組12個重復(公、母各半)，第4組18個重復。第1組重組菌組(LR-LFCA)，飼喂基礎日糧+1.2×1010CFU·kg-1[18]表達乳鐵蛋白肽的重組羅伊氏乳酸桿菌；第2組為空菌組(LR-CON)，飼喂基礎日糧+1.2×1010CFU·kg-1轉(zhuǎn)入空載體質(zhì)粒的羅伊氏乳酸桿菌；第3組為抗生素組(AB)，飼喂基礎日糧+硫酸新霉素，抗生素的添加量為每日口服200 mg·kg-1的硫酸新霉素；第4組為對照組(CON)，飼喂基礎日糧+MRS液體培養(yǎng)基。飼喂21 d 后，于每個組中隨機挑選6頭，使斷乳仔豬口服感染豬霍亂沙門菌10 mL(4.72×109CFU·mL-1)，連續(xù)口服3 d，設置觀察期，連續(xù)觀察7 d。記錄試驗分組為重組菌組(SC+LFCA)，空菌組(SC+LR-CON)，抗生素組(SC+AB)，感染組(SC)與對照組(CON)。記錄每組斷乳仔豬的精神狀況，采食量以及臨床癥狀，發(fā)病情況。以評價表達牛乳鐵蛋白肽的重組羅伊氏乳酸桿菌對斷乳仔豬的生長性能以及抗感染性能的影響。

1.5 實驗日糧與日常飼養(yǎng)管理

飼養(yǎng)實驗在東北農(nóng)業(yè)大學阿城實驗基地進行，仔豬飼喂基礎日糧，基礎日糧的組成以及營養(yǎng)成分參考文獻[18]。飼喂21 d后，移至隔離屏障系統(tǒng)內(nèi)飼養(yǎng)，觀察各試驗組斷乳仔豬的精神狀態(tài)，采食情況及發(fā)病情況。

1.6 測定指標與方法

1.6.1 生長性能與腹瀉率 通過向四組仔豬飼料分別添加重組菌pPG-LFCA-E/LR-CO21、空菌pPG/LR-CO21、硫酸新霉素、MRS。仔豬自由采食，自由飲水，飼喂21 d。期間記錄每天體重，平均日增重、料重比、腹瀉率來判定對仔豬生長性能的影響。

所耗標準飼料量與增重之比，稱為耗料增重比，簡稱料重比。反映飼料的質(zhì)量與飼喂效果。計算公式：料重比=飼養(yǎng)期內(nèi)所耗標準飼料量(kg)÷同期增重(kg)

1.6.2 仔豬免疫器官指數(shù) 連續(xù)飼喂21 d后處死仔豬24頭，取出仔豬免疫器官胸腺、脾稱量質(zhì)量，計算每組的免疫器官指數(shù)。

胸腺指數(shù)=胸腺質(zhì)量(g)/仔豬的質(zhì)量(kg)

脾指數(shù)=脾質(zhì)量(g)/仔豬的質(zhì)量(kg)

1.6.3 血清與腸黏液免疫指標 在對斷乳仔豬口服21 d重組菌pPG-LFCA-E/LR-CO21后，進行連續(xù)3 d的豬霍亂沙門菌的感染，設置觀察期7 d，對5組仔豬，每組6個重復，共30頭仔豬進行樣品采集。用無添加劑真空采血管采集仔豬血液，37 ℃孵育2 h，4 ℃孵育12 h，3 000 r·min-1離心10 min，收取上層血清，-40 ℃保存。刮取仔豬十二指腸、空腸、回腸腸黏液，-80 ℃保存。

檢測仔豬血清中IgG，十二指腸、空腸、回腸中sIgA與炎癥因子IL-4、IL-2、IL-12、IL-6含量。按照武漢酶免生物科技有限公司所生產(chǎn)的酶聯(lián)免疫分析試劑盒說明書步驟進行，采用酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)檢測sIgA、IgG與炎癥因子IL-4、IL-2、IL-12、IL-6水平。

1.6.4 仔豬腸道緊密連接蛋白基因轉(zhuǎn)錄水平 取豬霍亂沙門菌感染后5組仔豬十二指腸、空腸、回腸組織樣品(樣品來源同“1.6.3”)，提取總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后獲得cDNA，經(jīng)過Real-time PCR檢測十二指腸、空腸、回腸緊密連接蛋白Claudin-1和ZO-1的基因轉(zhuǎn)錄水平以及TLR4、Myd88和MLCK的基因轉(zhuǎn)錄水平。

1.6.5 腸道組織病理切片 在仔豬感染豬霍亂沙門菌后第7天對仔豬安樂死。收集5組仔豬十二指腸中間、空腸中間和回腸遠端的腸段(樣品來源同“1.6.3”)及肺、肝、脾組織，HE染色的具體操作步驟參照參考文獻[19]。

1.6.6 感染后仔豬腸道黏膜中豬霍亂沙門菌定植量 取實驗室已構建好的SalmonellaCholeraesuis標準質(zhì)粒，以質(zhì)?？截悢?shù)的對數(shù)為縱坐標，以Ct值為橫坐標制作標準曲線。用DEPC水將標準質(zhì)粒10倍遞增稀釋，各稀釋度取2 μL用于熒光定量PCR檢測。將測得的樣品閾值(cycle threshold，Ct)利用標準曲線計算出質(zhì)?？截悢?shù)，再轉(zhuǎn)換成菌數(shù)，乘以稀釋倍數(shù)即得腸黏液中的豬霍亂沙門菌菌數(shù)。

質(zhì)粒拷貝數(shù)=[質(zhì)粒質(zhì)量(g)/質(zhì)粒分子堿基數(shù)× 324.5×2]×6.02×1023

1.7 動物試驗倫理

嚴格按照中國疾病預防控制中心《實驗動物使用和護理指南》和中國衛(wèi)生部《醫(yī)學實驗動物規(guī)則》(1998)的規(guī)定[20]，經(jīng)東北農(nóng)業(yè)大學動物保護和使用委員會批準。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

利用Excel對數(shù)據(jù)初處理，GraphPad Prism 8.0.2.263對數(shù)據(jù)處理及圖像繪制, Two-way ANOVA對數(shù)據(jù)進行因素分析。統(tǒng)計學結(jié)果由Rversion 3.5.3分析獲得。P<0.05表示差異有顯著性意義，P<0.01表示差異極顯著[21]。

2 結(jié) 果

2.1 目的蛋白的表達鑒定及定量分析

重組菌pPG-LFCA-E/LR-CO21經(jīng)37 ℃發(fā)酵培養(yǎng)16～18 h，制備蛋白樣品，Western blot鑒定發(fā)現(xiàn)，約在38 ku處出現(xiàn)特異性反應條帶，如圖1，說明融合蛋白LFCA-EGFP在重組菌中成功表達。

M.預染蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準；1.重組菌菌體沉淀；2.重組菌菌體上清；3.陰性對照M.Prestained protein marker; 1.Recombinant cell precipitation; 2.Recombinant cell supernatant; 3.Negative control圖1 重組菌表達蛋白的Western blot鑒定Fig.1 Identification of protein expressed in recombinant Lactobacillus reuteri by Western blot

用ELISA方法制作牛乳鐵蛋白肽的標準曲線，用于牛乳鐵蛋白肽的定量。根據(jù)結(jié)果，繪制牛乳鐵蛋白肽標準曲線。檢測培養(yǎng)至不同時間點的重組菌對牛乳鐵蛋白肽的表達量，根據(jù)牛乳鐵蛋白肽標準曲線，檢測發(fā)現(xiàn)重組菌培養(yǎng)18 h后牛乳鐵蛋白肽的表達量最大，菌體的最大表達量為1.41 μg·mg-1，上清的最大表達量為0.81 μg·mL-1，結(jié)果如表1所示。

表1 重組菌表達乳鐵蛋白肽的ELISA檢測

2.2 抗菌肽的體外抑菌活性

利用牛津杯法測定重組菌pPG-LFCA-E/LR-CO21的抑菌活性，對于金黃色葡萄球菌、豬霍亂沙門菌與大腸桿菌，重組菌pPG-LFCA-E/LR-CO21抑菌圈直徑分別為1.250、0.860和0.960 cm，與空菌pPG/LR-CO21抑菌圈直徑存在顯著差異(P<0.05)，證明重組菌表達的牛乳鐵蛋白肽對所檢測的致病菌均有不同程度的抑制作用，具有抑菌活性。

2.3 重組菌pPG-LFCA-E/LR-CO21對斷乳仔豬生長性能的影響

將斷乳仔豬連續(xù)口服重組菌21 d，檢測重組菌對仔豬生長性能的影響，結(jié)果如圖2A，結(jié)果表示，與CON組相比，LFCA組仔豬日增重極顯著增高(P<0.01)。 如圖2B，與CON組相比，LFCA組仔豬料重比極顯著降低(P<0.01)，AB組與CON組差異不明顯(P>0.05)。由此可得，在斷乳仔豬飼料中添加pPG-LFCA-E/LR-CO21，可對斷乳仔豬的生長性能起到一定的促進作用。

2.4 重組菌pPG-LFCA-E/LR-CO21對斷乳仔豬免疫器官指數(shù)的影響

在對斷乳仔豬連續(xù)口服21 d pPG-LFCA-E/LR-CO21后，每組隨機抽取3頭仔豬，剖檢取其脾與胸腺，檢測四組仔豬的免疫器官指數(shù)。由圖3A得知，LR-LFCA組脾指數(shù)相對于CON組顯著增高(P<0.05)。LR-CON組、AB組與CON組無顯著差異。由圖3 B可得，LR-LFCA組胸腺指數(shù)相對于CON組極顯著增高(P<0.01)，LR-CON組相對于CON顯著組增高(P<0.05)，AB組與CON組相比無明顯差異(P>0.05)。表明重組菌可以促進仔豬的生長及免疫器官的發(fā)育。

*.P< 0.05 vs CON；**.P< 0.01 vs CON圖2 重組羅伊氏乳桿菌對斷乳仔豬生長的影響Fig.2 Effect of recombinant Lactobacillus reuteri on the growth of weaned piglets

2.5 斷乳仔豬飼喂重組菌pPG-LFCA-E/LR-CO21后抗豬霍亂沙門菌感染的效果分析

2.5.1 重組菌對感染后仔豬腹瀉率的影響 在對斷乳仔豬口服21 d重組菌pPG-LFCA-E/LR-CO21后，對仔豬進行連續(xù)3 d的豬霍亂沙門菌的感染，設置觀察期，觀察7 d，由圖4可知，在斷乳仔豬均感染豬霍亂沙門菌后，試驗組與對照組均出現(xiàn)不同程度的發(fā)病癥狀。SC組仔豬精神沉郁狀態(tài)及腹瀉情況最為嚴重，出現(xiàn)水樣腹瀉。SC+LR-CON組與SC+LR-LFCA組仔豬狀況呈現(xiàn)不同程度的減輕，SC+LR-LFCA組仔豬在感染6 d時腹瀉率為0，與SC組相比大幅度降低。由圖5可知，在斷乳仔豬感染豬霍亂沙門菌后，SC+LR-LFCA，SC+LR-CON與SC組斷乳仔豬日增重均呈現(xiàn)不同程度的降低。且SC+LR-LFCA組仔豬日增重降低幅度最小，達到接近抗生素組效果。

*.P<0.05 vs CON；**.P<0.01 vs CON圖3 重組羅伊氏乳桿菌對斷乳仔豬免疫器官指數(shù)的影響Fig.3 Effect of recombinant Lactobacillus reuteri on immune organ index of weaned piglets

圖4 重組羅伊氏乳桿菌對感染豬霍亂沙門菌仔豬腹瀉率變化的影響Fig.4 Effect of recombinant Lactobacillus reuteri on diarrhea rate of weaned piglets

圖5 重組羅伊氏乳桿菌對感染豬霍亂沙門菌仔豬日增重變化的影響Fig.5 Effect of recombinant Lactobacillus reuteri on daily gain of weaned piglets

以上結(jié)果表明，在飼料中添加pPG-LFCA-E/LR-CO21，可顯著降低斷乳仔豬的腹瀉率，提高斷乳仔豬的日增重。證實了pPG-LFCA-E/LR-CO21對斷乳仔豬感染豬霍亂沙門菌的保護作用。

2.5.2 重組菌對感染后仔豬腸黏液sIgA以及血清中IgG的影響 在對斷乳仔豬口服21 d重組菌pPG-LFCA-E/LR-CO21后，對仔豬進行連續(xù)3 d的豬霍亂沙門菌的感染，觀察7 d后檢測仔豬血清中IgG與十二指腸、空腸、回腸中sIgA含量。IgG抗體水平標準曲線為：y=11.526x-0.677 6；sIgA抗體水平標準曲線為：y=22.712x-1.291 7。如圖6可得，重組菌可以有效地提高免疫球蛋白的含量，其中SC+LR-LFCA組血清總IgG的抗體水平較SC組差異極顯著(P<0.01)，和SC+AB組相比極顯著提高IgG的抗體水平(P<0.01)。由結(jié)果圖7可得，SC+LR-LFCA組十二指腸、空腸、回腸黏液中sIgA抗體水平較SC組差異極顯著(P<0.01)，和SC+AB組相比極顯著提高sIgA的抗體水平(P<0.01)。 這表明重組菌pPG-LFCA-E/LR-CO21能夠顯著提高斷乳期仔豬的黏膜免疫能力。

**.P<0.01 vs SC；#.P<0.05 vs SC+LR-LFCA； ##.P<0.01 vs SC+LR-LFCA圖6 仔豬感染Salmonella Choleraesuis后血清IgG含量Fig.6 Serum IgG levels in piglets infected with Salmonella Choleraesuis

**.P<0.01 vs SC；*.P<0.05 vs SC；#.P<0.05 vs SC+LR-LFCA； ##.P<0.01 vs SC+LR-LFCA圖7 仔豬感染Salmonella Choleraesuis后腸黏液中sIgA含量Fig.7 sIgA content in intestinal mucus of piglets infected with Salmonella Choleraesuis

2.5.3 重組菌對感染后仔豬腸道緊密連接蛋白基因轉(zhuǎn)錄水平的影響 利用Real-time PCR檢測十二指腸、空腸、回腸組織中緊密連接蛋白Claudin-1和ZO-1的基因轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果如圖8 A、B所示，發(fā)現(xiàn)仔豬感染SC后回腸緊密連接蛋白ZO-1和Claudin-1的基因轉(zhuǎn)錄水平降低。與SC組相比，SC+LR-CON組和SC+LR-LFCA組仔豬十二指腸、空腸、回腸緊密連接蛋白ZO-1和Claudin-1的基因轉(zhuǎn)錄水平顯著增加(*P<0.05；**P<0.01)，但是SC+LR-LFCA組優(yōu)于SC+LR-CON組。且SC+LR-LFCA組與SC+AB組無明顯差異(P>0.05)。

**.P<0.01 vs SC；*.P<0.05 vs SC; #.P<0.05 vs SC+LR-LFCA； ##.P<0.01 vs SC+LR-LFCA圖8 仔豬感染Salmonella Choleraesuis后腸黏液中緊密連接蛋白的基因轉(zhuǎn)錄水平Fig.8 Transcription levels of tight junction proteins in the intestinal mucus of piglets infected with Salmonella Choleraesuis

2.5.4 重組菌對感染后仔豬腸道TLR4、Myd88和MLCK基因轉(zhuǎn)錄水平的影響 腸上皮細胞與細胞之間的緊密連接蛋白的表達受到多種信號通路的調(diào)控，包括:Rho/Rho激酶通路、蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)通路、MLCK(myosin Light chain kinase，MLCK)通路和MAPK(mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路等。

經(jīng)過Real-time PCR檢測，與SC組相比，SC+LR-LFCA組顯著降低了致病菌導致的仔豬腸道TLR4基因的轉(zhuǎn)錄水平升高，進而降低了Myd88基因轉(zhuǎn)錄水平，最終降低了MLCK基因轉(zhuǎn)錄水平(P<0.05，P<0.01)。且SC+LR-LFCA組效果與SC+AB組相近，表明pPG-LFCA-E/LR-CO21可作為一種斷乳仔豬的替代抗生素的有前途的飼料添加劑。SC+LR-CON組也可以降低致病菌導致的TLR4、Myd88和MLCK基因轉(zhuǎn)錄水平的升高，但是沒有達到SC+LR-LFCA組水平，結(jié)果如圖9A、B、C圖。表明重組菌pPG-LFCA-E/LR-CO21組有效調(diào)控MLCK信號通路，斷乳期仔豬口服pPG-LFCA-E/LR-CO21顯著緩解了致病菌感染導致的這一現(xiàn)象。

**.P<0.01 vs SC；*.P<0.05 vs SC; #.P<0.05 vs SC+LR-LFCA； ##.P<0.01vs SC+LR-LFCA圖9 仔豬感染Salmonella Choleraesuis后腸黏液中TLR4、Myd88和MLCK的基因轉(zhuǎn)錄水平Fig.9 TLR4, Myd88 and MLCK gene transcription levels in the intestinal mucus of piglets infected with Salmonella Choleraesuis

2.5.5 重組菌對感染后仔豬腸道黏膜中豬霍亂沙門菌定植量的影響 取實驗室已構建好的S.Choleraesuis 標準質(zhì)粒，以質(zhì)?？截悢?shù)的對數(shù)為縱坐標，以Ct值為橫坐標制作標準曲線，Real-time PCR方法檢測結(jié)果如圖10。SC+LR-LFCA組與SC+LR-CON組腸黏液中豬霍亂沙門菌數(shù)量極顯著低于SC組(P<0.01)，SC+LR-LFCA與SC+LR-CON組相比前者效果更明顯，在十二指腸、空腸，回腸中SC+LR-LFCA組極顯著低于SC+LR-CON組(P<0.01)，結(jié)腸中SC+LR-LFCA組顯著低于SC+LR-CON組(P<0.05)。盲腸中SC+LR-LFCA組與SC+LR-CON組無明顯差異，但SC+LR-LFCA組腸黏液中豬霍亂沙門菌數(shù)量低于SC+LR-CON組。且在十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸、盲腸中，SC+LR-LFCA組豬霍亂沙門菌定植量與SC+AB組相近且差異不明顯(P>0.05)。

2.5.6 重組菌對感染后仔豬腸道炎癥因子表達量的影響 按照劑量加入試劑盒中提供標準品，讀取OD450 nm的數(shù)值，根據(jù)數(shù)值繪制炎癥因子IL-4、IL-2、 IL-12、IL-6含量與OD450 nm的陽性標準曲線，制得標準曲線回歸方程：y=41.377x-2.049 5(IL-4)；y= 133.09x-17.711(IL-2)；y=150.3x-22.778(IL-12)；y=449.88x-201.6(IL-6)。

與SC組相比，SC+LR-LFCA組十二指腸中仔豬腸黏液中IL-4含量差異不顯著(P>0.05)，但有上升的趨勢，空腸與回腸中仔豬腸黏液中IL-4含量極顯著提高(P<0.01)。且空腸與回腸中SC+LR-LFCA組與SC+AB組無明顯差異。

與SC組相比，SC+LR-LFCA組空腸中仔豬腸黏液中IL-2含量極顯著降低(P<0.01)，回腸與十二指腸中仔豬腸黏液中IL-2含量無明顯差異(P>0.05)。但在空腸中，SC+LR-LFCA組與SC+AB組IL-2含量差異不明顯且含量較相近。

與SC組相比，SC+LR-LFCA組十二指腸、回腸中仔豬腸黏液中IL-12含量極顯著降低(P<0.01)，空腸中仔豬腸黏液中IL-12含量顯著降低(P<0.05)。且SC+LR-LFCA組與SC+AB組IL-12含量差異不明顯且含量較相近(P>0.05)。

與SC組相比，SC+LR-LFCA組十二指腸、空腸、回腸中仔豬腸黏液中IL-6含量極顯著降低(P<0.01)，且十二指腸中SC+LR-LFCA組與SC+AB組IL-12含量差異不明顯且含量較相近(P>0.05)。

**.P<0.01 vs SC；*.P<0.05 vs SC; #.P<0.05 vs SC+LR-LFCA； ##.P<0.01vs SC+LR-LFCA圖10 腸黏液中Salmonella Choleraesuis數(shù)Fig.10 The number of Salmonella Choleraesuis in intestinal mucus

這些結(jié)果表明斷乳期仔豬口服pPG-LFCA-E/LR-CO21可以提高仔豬腸黏液中抑炎因子的含量，降低仔豬腸黏液中促炎因子的含量，提高仔豬的抗炎能力。

2.5.7 重組菌對感染后仔豬腸黏膜組織病理學影響 在觀察期結(jié)束后處死仔豬，剖檢取出主要病變組織，肺、肝、脾和十二指腸、空腸、回腸。4%多聚甲醛固定做石蠟切片及HE染色以觀察各組主要組織器官的病理組織學變化情況見圖11。由圖11可知，SC+LFCA組與SC+AB組少量炎性細胞及嗜酸性粒細胞浸潤，SC+LR-CON組及SC組固有層較多炎性細胞浸潤，黏膜上皮細胞部分變性壞死。

圖11 仔豬感染Salmonella Choleraesuis后的組織病理切片(100×)Fig.11 Histopathological section of piglets infected with Salmonella Choleraesuis (100×)

SC組、SC+LR-CON組、SC+AB組肺均出現(xiàn)不同程度的炎性細胞浸潤與肺泡上皮細胞增生的情況，SC+LFCA組增生及浸潤情況均較輕。SC組脾淋巴細胞輕度減少，SC+LR-CON組、SC+AB組未見病變。肝組織出現(xiàn)不同程度的肝細胞變性萎縮的情況，且SC組可見竇狀隙可見少量嗜中性粒細胞浸潤，肝細胞大面積變性萎縮，SC+AB組與SC+LFCA組部分肝細胞輕度變性。

感染后仔豬空腸皺縮，回腸腸絨毛嚴重破損，重組菌組腸絨毛的破損情況較輕，保持了腸絨毛的完整性?？站M一定程度上也緩解了SC對腸絨毛造成的損傷，但沒有重組菌效果顯著。表明重組菌可有效改善腸黏膜絨毛表面的破損情況。

3 討 論

我國是養(yǎng)豬生產(chǎn)大國，生豬養(yǎng)殖規(guī)模占全球的50%左右[22]。據(jù)統(tǒng)計，仔豬斷乳前后因腹瀉死亡量占總死亡量的49.11%，飼用促生長抗生素在養(yǎng)殖業(yè)作為藥物飼料添加劑使用在過去數(shù)十年間曾成為動物健康的保障，并發(fā)現(xiàn)給動物飼喂低劑量的抗生素可以刺激生長。但抗生素濫用可能帶來耐藥菌、致畸、致癌等嚴重后果[23]。根據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部194號文件，自2021年1月1日，飼料中全面禁止添加促生長類藥物飼料添加劑(中藥類除外)的商品飼料[24]，以維護食品安全及公共衛(wèi)生。在動物生產(chǎn)中，少用、限用或禁用抗生素已成必然趨勢，飼用抗生素替代品的生產(chǎn)與使用迫在眉睫。近年來研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加抗菌肽可以緩解斷乳仔豬腹瀉，提高斷乳仔豬生長性能[25]。牛乳鐵蛋白肽作為抗菌肽的一種，對乳酸桿菌的生長具有一定程度的促進作用[26-27]。乳酸菌除本身具有的益生特性外，還可以作為外源基因的遞呈載體，具有可以直接飼喂不需要純化的優(yōu)點[28-31]。羅伊氏乳酸桿菌作為動物體內(nèi)廣泛分布的正常菌群，具有良好的益生功能和較強的黏附能力[17，32]。

本實驗室利用前期構建的將EGFP與牛乳鐵蛋白肽LFcin和Lfampin進行融合表達的表達質(zhì)粒pPG612-LFCA-EGFP，并將其電轉(zhuǎn)入從仔豬腸道內(nèi)分離得到的具有較好的抗逆性和較強黏附性的羅伊氏乳酸桿菌LR-CO21中，獲得了表達EGFP連牛乳鐵蛋白肽(LFCA-EGFP)融合蛋白的重組菌pPG-LFCA-E/LR-CO21。本研究利用構建好的重組菌對斷乳仔豬口服該重組菌，通過分析仔豬日增重、料重比及免疫器官指數(shù)來評價重組菌對新生仔豬生長性能的影響。結(jié)果表明重組菌組的仔豬日增重、胸腺指數(shù)極顯著高于正常對照組(P<0.01)，料重比極顯著降低(P<0.01)，脾指數(shù)顯著提高(P<0.05)，且與抗生素組無明顯差異(P>0.05)。表明口服重組菌促進仔豬生長發(fā)育。趙東方[33]的試驗也表明本實驗室分離到的羅伊氏菌株具有促進仔豬發(fā)育的特性。

同時，體外抑菌試驗結(jié)果顯示，重組菌對S.Choleraesuis CVCC10141、E.coliCVCC10141與S.aureusCVCC546的生長都有一定的抑制作用，這與于淑媛等[34]所敘述的牛乳鐵蛋白肽在宿主菌中表達了抑菌活性相一致。乳鐵蛋白肽雖然具有廣譜的抑菌作用，但由于其抑菌機制與鐵離子有關，因此對鐵離子需求低的乳酸桿菌基本不抑制。在給斷乳仔豬口服重組菌后感染豬霍亂沙門菌，發(fā)現(xiàn)給斷乳仔豬口服重組菌顯著緩解了感染豬霍亂沙門菌引起的仔豬體重的降低，而且顯著降低的仔豬的腹瀉率，與抗生素組差異不顯著。斷乳仔豬口服空菌雖然可以降低仔豬腹瀉率，但是與感染組相比，并未達到顯著水平。Yi等[35]的研究也證實給仔豬飼喂抗菌肽Cathelicidin-WA可以降低仔豬感染致病菌后的腹瀉率。

免疫球蛋白是哺乳動物發(fā)生免疫應答所產(chǎn)生的效應因子[36]，通過促進單核巨噬細胞的吞噬作用，中和細菌內(nèi)毒素以及中和病毒抗原，在抗感染中發(fā)揮主要作用，能夠反映機體特異性免疫水平。細菌感染引起的炎癥反應往往與細胞膜表面模式識別受體(PRR)TLRs有關，細菌或者LPS可以通過激活TLRs，進而激活NF-κB信號通路，引起下游的多種促炎因子表達。近些年研究發(fā)現(xiàn)，抗菌肽可能通過TLRs調(diào)控免疫反應，多種抗菌肽(Lfcin B、LL-37、LFP-20和pBD2等)可以通過阻斷細菌或者LPS激活TLR，抑制下游炎癥反應[37]。高彥華[38]的研究表明，豬抗菌肽PR-39可以提高仔豬免疫球蛋白IgA和IgG水平。趙雪芹[39]的研究發(fā)現(xiàn)，抗菌肽可有效抵御小鼠感染沙門菌，降低沙門菌感染介導的炎性因子IL-2、IL-6、TNF-α的釋放，具有良好的抗炎效果。本研究通過檢測仔豬血清中IgG含量和腸黏膜中sIgA含量發(fā)現(xiàn)，與空菌組以及抗生素組相比，給斷乳仔豬口服pPG-LFCA-E/LR-CO21顯著增加了仔豬血清中IgG水平和腸黏液中sIgA、IL-4水平，并顯著降低了炎癥因子IL-2、IL-12、IL-6的量。說明重組菌可以通過調(diào)節(jié)炎性因子的分泌調(diào)節(jié)機體炎癥，激活機體免疫系統(tǒng)，增強機體黏膜免疫的免疫能力。

腸道形態(tài)和結(jié)構的完整性與腸道健康密切相關。有研究表明豬霍亂沙門菌感染會引起仔豬腸絨毛萎縮甚至造成腸黏膜壞死。Tang等[40]研究表明在仔豬飼料中添加由巴斯德畢赤酵母(KM71)XS10表達乳鐵蛋白肽(由中國科學院亞熱帶農(nóng)業(yè)研究所生產(chǎn))可以增加仔豬腸絨毛高度，提高飼料轉(zhuǎn)化率。本研究發(fā)現(xiàn)斷乳仔豬感染豬霍亂沙門菌后，仔豬空腸、回腸絨毛皺縮并且表面破損嚴重，而在口服重組菌后使仔豬感染豬霍亂沙門菌，仔豬的回腸絨毛脫落、縮短和表面破損情況顯著緩解，說明給斷乳仔豬口服重組菌能有效改善仔豬斷乳后感染豬霍亂沙門菌造成的腸道損傷，從而有利于促進仔豬的生長。

綜上表明，斷乳仔豬口服重組菌pPG-LFCA-E/LR-CO21提高仔豬抗豬霍亂沙門菌感染的能力，維護了斷乳仔豬的腸道微生態(tài)健康，同時增強仔豬免疫功能，這表明分泌牛乳鐵蛋白肽的豬源羅伊氏乳酸桿菌pPG-LFCA-E/LR-CO21作為微生態(tài)制劑替代飼用抗生素具有一定的應用前景。

4 結(jié) 論

飼料中添加表達牛乳鐵蛋白肽的重組豬源羅伊氏乳酸桿菌pPG-LFCA-E/LR-CO21可提高斷奶仔豬平均日增重，降低料重比及腹瀉率，提高免疫器官指數(shù)及機體的免疫應答能力，對斷奶仔豬的生長具有一定的促進作用；還可抵抗豬霍亂沙門菌的感染，對腸道黏膜具有保護作用，增強斷奶仔豬的抵抗力。