邱燕華，翟斌濤，尚小飛，周緒正，李 冰，張繼瑜

(中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州畜牧與獸藥研究所 農(nóng)業(yè)部獸用藥物創(chuàng)制重點實驗室甘肅省新獸藥工程重點實驗室，蘭州 730050)

弓形蟲病是由弓形蟲引起的一種重要的人獸共患寄生蟲病，弓形蟲(Toxoplasmagondii)能感染包括人在內(nèi)的所有溫血動物，甚至包括一些冷血動物，并且能寄生于動物機體的所有有核細胞內(nèi)[1-3]。弓形蟲病不僅嚴重影響人類的健康，還造成了巨大的經(jīng)濟損失。當前對于弓形蟲病的治療主要依賴基于乙胺嘧啶的化學療法，該方法雖然可以有效地控制弓形蟲的急性感染，但普遍存在毒副作用大、治療周期長、易復發(fā)和對弓形蟲組織包囊缺乏療效等缺點[4-5]。因此，篩選和研發(fā)出安全且高效的抗弓形蟲藥物任重而道遠。萜類化合物作為天然產(chǎn)物中最多的一部分，已發(fā)現(xiàn)具有多種生物活性，其中包括抗弓形蟲作用，比如青蒿素、熊果酸、百里酚和穿心蓮內(nèi)酯等在體內(nèi)和體外都表現(xiàn)出了良好的抗弓形蟲活性[6-9]。本試驗選擇了26個萜類化合物進行抗弓形蟲活性的篩選，并對篩選出的化合物檜烯進行了一系列體外活性評價。檜烯是一種單萜類化合物，已作為香料添加劑使用，正在探索作為下一代飛機燃料的成分[10]。目前已知檜烯具有多種生物活性，但對弓形蟲的研究未見報道，本研究對其作為抗弓形蟲先導化合物具有一定的參考意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞和弓形蟲 非洲綠猴腎細胞(Vero)購自中國科學院細胞庫；弓形蟲RH-2F購自美國典型菌種保藏中心(ATCC)；弓形蟲Ⅰ型蟲株RH和Ⅱ型蟲株P(guān)ru速殖子由中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所提供，其中RH-2F是表達了β-半乳糖苷酶的弓形蟲RH株，Ⅰ型蟲株RH是強毒株，致死率較高，一般發(fā)生急性感染；而Ⅱ型Pru是弱毒株，毒力相對較弱，一般經(jīng)過急性感染期后在組織內(nèi)形成包囊而轉(zhuǎn)為慢性感染。

1.1.2 藥物與試劑 26個萜類化合物購自源葉、麥克林和邁瑞爾等多家公司。CCK-8試劑購自MCE公司，二甲基亞砜(DMSO)購自Sigma公司。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)以及雙抗等添加劑均購自英濰捷基公司。臺盼藍染色液購自索萊寶公司，Beta-Glo?檢測試劑購自普洛麥格公司，所有抗體均購自Abcam公司。

1.2 細胞培養(yǎng)和弓形蟲的培養(yǎng)與純化

Vero細胞培養(yǎng)于含10% FBS、1% NEAA、1% Glutamax、1% Sodium pyruvate和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基中。3種蟲株用含3%FBS的DMEM培養(yǎng)基于Vero細胞中培養(yǎng)和傳代。弓形蟲多數(shù)溢出細胞時用細胞刮把細胞刮下，27 G 針頭反復抽吸兩次，200×g離心5 min后，用5 μm孔徑的濾膜過濾上清，1 500×g離心10 min，獲得純化后的速殖子，速殖子用培養(yǎng)基重懸，臺盼藍染色，血細胞計數(shù)板計數(shù)后用于后續(xù)試驗與傳代[11]。

1.3 萜類化合物活性的初步篩選

26種萜類化合物(表1)用DMSO溶解成20 mg·mL-1的原液待用。RH速殖子3×105個·mL-1接種于有單層Vero細胞的12孔板中，8 h后試驗組分別加入用培養(yǎng)基配制的高(40 μg·mL-1)、 低(5 μg·mL-1)兩個濃度的不同化合物孵育。對照組僅感染RH但未做其他處理，用只含細胞和培養(yǎng)基的孔作為空白組，每組設(shè)置3個復孔，分別于24、48和72 h時于倒置顯微鏡下觀察。按與對照組相比視野中弓形蟲數(shù)量減少60%以上的標準初步篩選出活性化合物。

1.4 活性化合物的細胞毒性檢測

對于初步篩選得到的活性化合物，采用CCK-8法測定其對Vero細胞的毒性。Vero細胞1×105個·mL-1， 接種于96孔板，培養(yǎng)12 h后，加入各濃度的化合物。以未加化合物的孔為對照組，只含培養(yǎng)基的孔為空白組。培養(yǎng)24 h后加入CCK-8試劑，作用1～2 h后于酶標儀內(nèi)測定各孔D450 nm值，獨立的試驗重復3次。用Graph Pad Prism 8.3繪圖并計算95%的細胞存活率，以此作為化合物對Vero細胞的最大安全濃度[12]。

1.5 活性化合物對弓形蟲增殖的影響

12孔板的單層細胞中加入濃度為2×105個·mL-1的RH速殖子。入侵8 h后加入各濃度為安全濃度的活性化合物孵育，并以0.25% DMSO為對照組，分別于培養(yǎng)24、48和72 h時Giemsa染色觀察結(jié)果[13]。

1.6 檜烯對RH-2F的抑制作用

用表達β-半乳糖苷酶的弓形蟲RH-2F株用于生長抑制測定[14]。從Vero細胞中收獲新鮮活力強的RH-2F速殖子，調(diào)整RH-2F的濃度為1×105個·mL-1。 以此配制各濃度的檜烯，以0.25%DMSO為對照組，只含培養(yǎng)基的為空白組。培養(yǎng)12 h后加入Beta-Glo?檢測試劑，作用30 min后于光度計中檢測發(fā)光值[15-16]。

1.7 檜烯對細胞內(nèi)RH的抗增殖作用

將1×105個·mL-1的RH速殖子接種于有單層Vero細胞的12孔板爬片中，入侵4 h后，加入檜烯作用24和48 h，0.25%DMSO為陰性對照組，10 μg·mL-1的乙胺嘧啶為陽性對照。用4%多聚甲醛固定，抗原修復，10%山羊血清封閉，0.2%Triton X-100通透，選擇用兔抗弓形蟲多克隆抗體對弓形蟲進行標記，二抗為山羊抗兔lgG H&L(Alexa Fluor?488)，DAPI染核[17]。染色封片后于共聚焦顯微鏡下觀察拍照。

1.8 檜烯對細胞內(nèi)Pru的抗增殖作用

1.8.1 Giemsa染色 6孔板的單層細胞中加入濃度為1.5×105個·mL-1的Pru速殖子。入侵12 h， 用DPBS洗去未入侵的速殖子，并加入濃度為80 μg·mL-1的檜烯，同時設(shè)置陽性對照和陰性對照。分別于培養(yǎng)24和48 h時Giemsa染色觀察結(jié)果。

1.8.2 細胞免疫熒光 將1×105個·mL-1的Pru速殖子接種于12孔板中的單層Vero細胞的爬片中，入侵6 h后加入檜烯作用24 h，同時設(shè)置陽性對照和陰性對照。固定、封閉，通透和染色。小鼠抗弓形蟲單克隆抗體為一抗，二抗為山羊抗小鼠lgG H&L(Alexa Fluor?647)，DAPI染核。封片后于共聚焦顯微鏡下觀察拍照。

1.9 檜烯對RH的抗入侵作用

將含有各濃度檜烯的1×105個·mL-1的RH速殖子在培養(yǎng)箱中處理1 h后接種于單層Vero細胞中，0.25%DMSO為陰性對照組，10 μg·mL-1的乙胺嘧啶為陽性對照。入侵2 h后，盡量用PBS將未入侵的速殖子洗去。固定、抗原修復和封閉后用小鼠抗弓形蟲單克隆抗體對細胞外的弓形蟲進行標記，二抗為山羊抗小鼠lgG H&L(Alexa Fluor?647)。0.2%Triton X-100通透后選擇用兔抗弓形蟲多克隆抗體對細胞內(nèi)的弓形蟲進行標記，二抗為山羊抗兔lgG H&L(Alexa Fluor?488)，DAPI染核[18-19]。封片后于共聚焦顯微鏡下隨機選擇10個視野觀察拍照并計數(shù)。按公式入侵率(%)=試驗組細胞內(nèi)弓形蟲數(shù)/陰性對照組細胞內(nèi)弓形蟲數(shù)×100%計算。

1.10 結(jié)果統(tǒng)計及分析

用GraphPad Prism 8.3進行IC50的計算及繪圖，并檢驗(t檢驗)組間數(shù)據(jù)的顯著性，安全濃度于GraphPad官網(wǎng)計算。細胞免疫熒光圖片使用軟件ZEN 2.6進行處理。**.P<0.01、***.P<0.001和****.P<0.000 1都代表相同時間點試驗組與對照組比較存在極顯著差異。

2 結(jié) 果

2.1 26個萜類化合物抗弓形蟲活性的初步篩選

26個萜類化合物以高濃度(40 μg·mL-1)和低濃度(5 μg·mL-1)兩個濃度進行初步篩選，與對照組相比視野中弓形蟲數(shù)量減少60%以上判定為有效。結(jié)果如表1，初步篩選出了檜烯、莪術(shù)烯和環(huán)黃芪醇3個活性化合物。

表1 萜類化合物初篩結(jié)果

2.2 活性化合物的細胞毒性

篩選得到的檜烯、莪術(shù)烯和環(huán)黃芪醇對Vero細胞的IC50分別為147.3、31.32和104.7 μg·mL-1(圖1)。 根據(jù)GraphPad Prism 8.3擬合的曲線斜率和IC50值計算出各個化合物對Vero細胞的最大安全濃度，檜烯、莪術(shù)烯和環(huán)黃芪醇的最大安全濃度依次為81.74、17.38 和50.15 μg·mL-1。選擇以檜烯80 μg·mL-1、莪術(shù)烯17 μg·mL-1和環(huán)黃芪醇50 μg·mL-1用于后續(xù)試驗。

圖1 活性化合物的細胞毒性Fig.1 Cytotoxicity of active compounds

2.3 活性化合物對弓形蟲增殖的影響

Giemsa染色分析發(fā)現(xiàn)莪術(shù)烯(17 μg·mL-1)、環(huán)黃芪醇(50 μg·mL-1)和檜烯(80 μg·mL-1)3個化合物中檜烯對弓形蟲的作用顯著，雖然在24和48 h時檜烯組仍然可觀察到少量的納蟲泡，但是72 h時檜烯組細胞中未觀察到納蟲泡和速殖子，而對照組中已無細胞結(jié)構(gòu)，視野中全是RH速殖子(圖2 A3)。莪術(shù)烯和環(huán)黃芪醇雖然可以抑制RH的增殖，但是在24、48 h時細胞中都存在納蟲泡或速殖子，72 h時速殖子已從細胞內(nèi)逸出，遍布細胞外(圖2)。

紅色箭頭所指為RH速殖子或納蟲泡，放大倍數(shù)為400×The red arrow points to Pru tachyzoites or parasitophorous vacuole, and the magnification is 400×圖2 萜類活性化合物對弓形蟲RH株增殖的影響Fig.2 Effect of terpenoid active compound on the proliferation of T. gondii RH strain

2.4 檜烯對RH-2F的抑制作用

檜烯對RH-2F的IC50為90.76 μg·mL-1，檜烯256 μg·mL-1作用12 h時RH-2F的存活率僅為16.87%。隨著劑量的遞減，存活率遞增，檜烯對RH-2F的作用呈劑量依賴性(圖3)。

圖3 檜烯對RH-2F的抑制作用Fig.3 Inhibitory effect of sabinene on RH-2F

2.5 檜烯對細胞內(nèi)RH的抗增殖作用

24 h時與DMSO組相比RH明顯減少，雖未見散在速殖子，但多見納蟲泡(圖4 B1)。48 h時與DMSO相比只有很少的RH速殖子，未觀察到納蟲泡(圖4 B2)。同乙胺嘧啶相比，檜烯雖然在24 h時活性更差，但在48 h時活性相當(圖4)。

2.6 檜烯對細胞內(nèi)Pru的抗增殖作用

2.6.1 Giemsa染色觀察 24 h時Giemsa染色結(jié)果與DMSO相比檜烯組中弓形蟲明顯減少，但仍可見少量蟲體。48 h時乙胺嘧啶中可觀察到小的納蟲泡，但在檜烯中未發(fā)現(xiàn)，而此時DMSO視野中已被大大小小的納蟲泡和蟲體占據(jù)(圖5)。

2.6.2 細胞免疫熒光觀察 24 h時的細胞免疫熒光結(jié)果表明，檜烯對細胞內(nèi)的弓形蟲Ⅱ型蟲株P(guān)ru的抗增殖效果顯著，可以抑制Pru納蟲泡的形成。DMSO組中隨處可見納蟲泡，檜烯組視野中只有極少零星散在的Pru，與乙胺嘧啶相比數(shù)量和大小都小得多(圖6)。

2.7 檜烯對RH的入侵抑制作用

檜烯對RH具有極顯著的抗入侵作用(P<0.001)，并且呈劑量依賴性，40 μg·mL-1時入侵率為63.22%，120 μg·mL-1時入侵率為19.50%，都比陽性對照乙胺嘧啶(Pyr)的72.99%要低(圖7)。

3 討 論

弓形蟲病是世界上最具破壞性的人畜共患病之一，全球約有20億人感染[20]。因預防手段的有限，當前對于弓形蟲病的措施主要是化學療法，但是當前的治療藥物存在諸多缺陷[5]。基于瘧原蟲和弓形蟲擁有共同的祖先和相似的生物學特性，治療弓形蟲病新藥的一個潛在來源就是重新利用針對瘧疾開發(fā)的藥物[21]。當前已有很多研究表明，很多對瘧原蟲有效的化合物，同時也對弓形蟲有效，如磺胺嘧啶、乙胺嘧啶、青蒿素、本芴醇和阿托伐醌等化合物[21-24]。萜類化合物是天然產(chǎn)物中最大的一類，近期對于其在抗癌和抗真菌,尤其是抗瘧疾方面引起了廣泛的關(guān)注[25]。因此，本研究首先以高低兩個濃度從26個萜類化合物中初步篩選出了檜烯、莪術(shù)烯和環(huán)黃芪醇這3個具有抗弓形蟲活性的化合物。經(jīng)細胞毒性試驗確定3個化合物的安全濃度范圍，以安全濃度進行抗弓形蟲活性評價。3個化合物的細胞毒性都呈劑量依賴性，其中檜烯的細胞毒性最小，安全濃度范圍最廣，同時檜烯的抗弓形蟲活性最好。

藍色熒光為細胞核，綠色熒光為RH，放大倍數(shù)為400×The blue fluorescence is the nucleus, the green fluorescence is Pru, and the magnification is 400×圖4 檜烯對細胞內(nèi)弓形蟲RH株增殖的影響Fig.4 Effect of sabinene on the proliferation of intracellular T. gondii RH strain

檜烯是重要的天然雙環(huán)單萜，可以用作調(diào)味劑、香料添加劑、精細化學品和高級生物燃料，同時也具有抗真菌、抗炎和預防骨骼肌萎縮等生物活性[26-28]。雖然檜烯具有殺蟲作用，檜烯對赤擬谷盜(TriboliumcastaneumHerbst)和玉米象(Sitophiluszeamais)等昆蟲具有顯著的驅(qū)避作用和熏蒸毒性，但沒有關(guān)于檜烯對弓形蟲有活性的研究報道[29]。本研究通過Giemsa染色、細胞免疫熒光和生物化學發(fā)光等方法證明了檜烯對弓形蟲有顯著活性，但未對檜烯的抗弓形蟲作用機制進行探究。有研究表明檜烯是鼠傷寒沙門菌(SalmonellaTyphimurium)靶蛋白L-天冬酰胺酶的有效抑制劑，可以通過抑制L-天冬酰胺酶的活性對鼠傷寒沙門菌起作用[30]。L-天冬酰胺酶催化天冬酰胺水解為天冬氨酸和氨。另外，L-天冬酰胺酶參與氨基酸(如賴氨酸、蛋氨酸和蘇氨酸)的生物合成[31]。除人類外，L-天冬酰胺酶存在于各種生物中，如動物、植物和各種微生物，其中就包括弓形蟲[32-33]。但檜烯是否是通過抑制L-天冬酰胺酶來抑制弓形蟲的增殖和入侵還未得知，有必要進行進一步的研究以闡明抑制機制。

紅色箭頭所指為Pru速殖子或納蟲泡，放大倍數(shù)為400×The red arrow points to Pru tachyzoites or parasitophorous vacuole, and the magnification is 400×圖5 檜烯對細胞內(nèi)弓形蟲Pru株增殖的影響(Giemsa染色)Fig.5 Effect of sabinene on the proliferation of intracellular T. gondii Pru strain(Giemsa staining)

藍色熒光為細胞核，紅色熒光為Pru，放大倍數(shù)為400×The blue fluorescence is the nucleus, the red fluorescence is Pru, and the magnification is 400×圖6 檜烯對細胞內(nèi)弓形蟲Pru株增殖的影響(細胞免疫熒光)Fig.6 Effect of sabinene on the proliferation of intracellular T. gondii Pru strain(cellular immunofluorescence)

**.P<0.01; ***.P<0.001; ****.P<0.000 1圖7 檜烯對RH的入侵抑制作用Fig.7 Inhibition effect of sabinene on RH invasion

4 結(jié) 論

從萜類化合物中篩選出了抗弓形蟲活性化合物檜烯，檜烯不僅對Vero細胞有較低的毒性，對弓形蟲的強毒Ⅰ型蟲株(RH)和弱毒Ⅱ型蟲株(Pru)都有顯著的抗增殖作用，而且對Ⅰ型蟲株(RH)的入侵有極顯著的抑制作用，檜烯可作為潛在的抗弓形蟲先導化合物。

致 謝

由衷地感謝原中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所朱興全研究員和賀君君博士饋贈的弓形蟲RH和Pru蟲株。