張曉戰(zhàn)，楊 磊，鄧同煒，趙攀登，彭志鋒，陳露露，郭懿文，夏艷勛，喬宏興，邊傳周*，王 增

(1. 河南牧業(yè)經濟學院動物醫(yī)藥學院，鄭州 450046； 2. 河南農業(yè)大學動物醫(yī)學院，鄭州 450046)

豬塞內卡病毒病是一種新近在豬群暴發(fā)流行的急性傳染病，病原是豬塞內卡病毒(Senecavirus A, SVA)，又稱為塞內加谷病毒(Seneca Valley virus, SVV)，屬于塞內卡毒屬(Senecavirus)，為該病毒屬的唯一成員，且只有一種血清型[1]。SVA基因組為單股正鏈RNA，全長約7.3 kb，包含一個大的開放閱讀框(open reading frame, ORF)，其兩側分別為5′和3′非編碼區(qū)(untranslated region, UTR)。其中，ORF編碼由2181個氨基酸組成的多聚蛋白前體，該多聚蛋白前體在宿主和病毒蛋白酶的共同作用下裂解為12個成熟的病毒蛋白，包括4個結構蛋白和8個非結構蛋白，蛋白布局遵循標準的“L-4-3-4”小核糖核酸病毒基因組的布局，從氨基端到羧基端依次為L-VP4-VP2-VP3-VP1-2A-2B-2C-3A-3B-3C-3D[2]。VP2、VP3和VP1蛋白位于SVA病毒粒子衣殼表面，且能夠與受體蛋白炭疽毒素受體1結合，介導病毒的感染[3]。2C、3A、3C和3D蛋白在病毒復制過程中參與病毒基因組的復制與合成、蛋白合成和前體蛋白酶解等過程，是病毒復制過程中重要的參與者[4-5]。

近年來，隨著分子生物學和細胞生物學的快速發(fā)展，研究人員利用反向遺傳操作技術將外源報告基因插入到病毒基因組中，構建病毒復制子或重組病毒來進行抗病毒蛋白和藥物篩選及細胞受體篩選等過程，大大地提升了病毒學相關研究的進程[6]。截至目前，熒光蛋白或熒光素酶基因已經成功的插入到人冠狀病毒[7]、腸道病毒EV71型[8]、豬瘟病毒[9]、坦布蘇病毒[10]等病原中，能夠穩(wěn)定的伴隨著病毒的復制而表達。其中，增強型的綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)熒光強度高，細胞內表達穩(wěn)定和檢測熒光活性簡便，廣泛的應用到報告病毒的開發(fā)和應用。鑒于此，國內外學者先后將EGFP基因插入到SVA基因組中，成功拯救了表達熒光蛋白的重組毒株，證實重組毒株具有較好的遺傳穩(wěn)定性，且表現(xiàn)與親本株類似的生長特性[11, 12]，但后續(xù)基于該重組毒株篩選抗SVA藥物的研究報道較少。

本研究將EGFP基因引入SVA 毒株CH/HeN-2018基因組2A和2B基因間。為了使EGFP蛋白能夠正常合成，且不影響SVA病毒前體蛋白的翻譯后修飾過程，在EGFP基因末端引入豬捷申病毒1型(porcine teschovirus-1)的2A基因，成功構建pSVA-EGFP載體。隨后轉染細胞，獲得重組報告病毒rCH/HeN-2018-EGFP，并進一步證實該報告病毒能夠穩(wěn)定表達EGFP熒光蛋白，且病毒復制特性與親本毒株相似，能夠滿足后期SVA病毒學試驗的需求。

1 材料與方法

1.1 細胞與病毒

豬腎細胞系PK-15由河南省豬病工程中心實驗室保存，豬源SVA臨床分離株wtCH/HeN-2018分離自2018年河南地區(qū)發(fā)病豬群[13]，重組毒株rCH/HeN-2018由本實驗室構建及拯救[14]。PK-15細胞生長液為含8%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素、100 μg·mL-1鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃含5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。病毒生長所需細胞維持液為含2%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素、100 μg·mL-1鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基。

1.2 質粒與主要試劑

含CH/HeN-2018株全基因組感染性克隆pwtSVA由本實驗室構建及保存[14]；含有EGFP基因的pEGFP-C1由本實驗室保存。DMEM培養(yǎng)基、opti-MEM培養(yǎng)基及0.25%-EDTA胰酶購自Gibco公司；胎牛血清購自四季青天杭生物公司；無縫克隆試劑盒、Lipo6000TM轉染試劑和CCK-8溶液為碧云天生物公司產品；細胞培養(yǎng)瓶及細胞培養(yǎng)板為NEST公司產品；病毒RNA提取試劑盒購、質粒提取試劑盒和膠回收試劑盒購自天根生化生物公司；高保真DNA聚合酶和反轉錄試劑盒購自TOYOBO生物；黃芩苷、姜黃素和DMSO購自索萊寶生物公司。

1.3 攜帶EGFP標簽重組SVA病毒的構建與拯救

1.3.1 pSVA-EGFP感染性克隆載體的構建 以實驗室前期構建的含CH/HeN-2018株全基因組感染性克隆pwtSVA為基礎，在基因組2A和2B蛋白間插入EGFP-P2A基因，構建載體pSVA-EGFP。其中，P2A為豬捷申病毒1型2A基因，其編碼的2A蛋白具有高效的體內自我剪切活性[15]。將P2A基因由蘇州鴻訊生物公司合成，并克隆連接至pEGFP-C1載體中EGFP基因末端，獲得pEGFP-P2A載體。分別利用SVA-2B F/SVA-2A R和EGFP F/P2A R引物對(表1)，以載體pwtSVA和pEGFP-P2A為模板進行PCR，PCR產物進行DpnI限制性內切酶37 ℃消化4 h后經膠回收，獲得基因片段PSVA和PE-2A。將片段PSVA和PE-2A按照濃度比例1∶4進行配比，與等量的2X Seamless Cloning Mix緩沖液混合，50 ℃連接15 min，連接產物轉化DH10B感受態(tài)細胞，經菌液PCR和測序鑒定陽性克隆，獲得重組載體pSVA-EGFP(圖1)。

表1 引物信息

圖1 攜帶EGFP標簽重組SVA病毒載體的構建策略Fig.1 Schematic representation of the construction of recombinant SVA vector with EGFP gene

1.3.2 SVA重組熒光病毒的拯救 參照文獻報道的方法[14]拯救SVA重組病毒。鋪PK-15細胞于6孔板， 待其匯合度至80%左右，吸取5 μL轉染試劑Lipo6000TM，在opti-MEM溶液背景下與2.5 μg重組質粒pSVA-EGFP混合均勻，室溫孵育5 min，隨后轉染入狀態(tài)良好的PK-15細胞。轉染后4 h更換細胞維持液，間隔24 h觀察細胞熒光表達情況。繼續(xù)培養(yǎng)2 d，凍融細胞，離心，收取上清，即為重組毒rCH/HeN-2018-EGFP P0代。隨后接種PK-15細胞，盲傳至出現(xiàn)明顯細胞病變，觀察綠色熒光表達情況，記錄病毒傳代次數，獲得重組毒rCH/HeN-2018-EGFP。

1.3.3 SVA重組熒光病毒的生長曲線 將生長良好PK-15細胞鋪于96孔細胞培養(yǎng)板中，待其匯合度至85%左右時，將96孔細胞培養(yǎng)板中生長液吸棄，PBS洗滌2次，每孔加入100 μL細胞維持液。分別取臨床分離株wtCH/HeN-2018、重組毒株rCH/HeN-2018和rCH/HeN-2018-EGFP病毒液用細胞維持液進行10倍倍比稀釋，稀釋度從10-1到10-10，將各個稀釋度的SVA病毒稀釋液加入96孔板，每孔100 μL，每個稀釋度做8個重復。同時設置陰性對照組。逐日觀察病變情況并記錄，按照Reed-Muench氏法計算病毒滴度TCID50。

鋪PK-15細胞于12孔板，待其匯合度至85%時，按照病毒感染復數MOI為0.1分別接種wtCH/HeN-2018、rCH/HeN-2018和rCH/HeN-2018-EGFP，37 ℃孵育1 h后PBS洗滌兩次，添加細胞維持液繼續(xù)培養(yǎng)。在12、24、36和48 hpi收取細胞上清。各毒株每個時間段設置3個重復。隨后按照Reed-Muench氏法計算病毒滴度TCID50。

1.4 基于SVA重組熒光病毒檢測抗病毒藥物

1.4.1 姜黃素和黃芩苷細胞毒性試驗 將生長良好PK-15細胞鋪于96孔細胞培養(yǎng)板中，待其匯合度至90%左右時，PBS洗滌細胞2次后添加細胞維持液，分別加入終濃度10、20、40 μmol·L-1姜黃素和55、110、220 μmol·L-1黃芩苷。每組3個重復，同時設置DMSO對照組和空白組。培養(yǎng)48 h后，加入1/10體積的CCK-8溶液，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)1.5 h，酶標儀測OD450 nm值。計算(OD藥物組-OD空白組)/(ODDMSO組-OD空白組)比值，分析不同濃度藥物對PK-15細胞增殖的影響。

1.4.2 姜黃素和黃芩苷對SVA熒光毒復制的影響 將生長良好PK-15細胞鋪于96孔細胞培養(yǎng)板中，待其匯合度至90%左右時，更換維持液，分別加入終濃度20 μmol·L-1姜黃素和110 μmol·L-1黃芩苷，同時設置DMSO對照組和空白組，每組3個重復。置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)預處理2 h后，每孔加入0.1 MOI的rCH/HeN-2018-EGFP。在12、24、36和48 hpi觀察各組細胞內熒光表達情況。48 hpi收取細胞上清，按照Reed-Muench氏法計算病毒滴度TCID50。

1.4.3 姜黃素和黃芩苷對SVA野毒株復制的影響 將生長良好PK-15細胞鋪于24孔細胞培養(yǎng)板中，待其匯合度至90%左右時，更換維持液，設置終濃度20 μmol·L-1姜黃素、終濃度110 μmol·L-1黃連素、DMSO對照組和空白組，每組3個重復。預處理2 h后，每孔加入0.1 MOI的wtCH/HeN-2018，48 hpi收取細胞上清，按照Reed-Muench氏法計算病毒滴度TCID50。

2 結 果

2.1 rCH/HeN-2018-EGFP重組熒光病毒的拯救

將重組載體pSVA-EGFP轉染PK-15細胞，轉染后12 h時觀察到部分細胞中存在綠色熒光，48 h時綠色熒光細胞增多，但無明顯的細胞病變現(xiàn)象。rCH/HeN-2018-EGFP盲傳至P2代時，在48 hpi出現(xiàn)明顯的細胞的病變，80%細胞變圓、皺縮，且在感染細胞中觀察到明顯的綠色熒光；60 hpi感染70%細胞脫落，貼壁細胞病變，內含明顯綠色熒光(圖2A)。自P2代，rCH/HeN-2018-EGFP病毒病變時間穩(wěn)定，在48 hpi誘使感染細胞明顯病變，80%感染細胞脫落。通過PK-15細胞感染試驗，測定P3代的rCH/HeN-2018-EGFP病毒滴度為107.76TCID50·0.1 mL-1(圖2B)。

圖2 rCH/HeN-2018-EGFP熒光觀察(A)、重組病毒病毒效價(B)和不同代次重組病毒RT-PCR檢測(C)Fig.2 Observation of the fluorescence of rCH/HeN-2018-EGFP(A)，the virus titer of rCH/HeN-2018-EGFP(B) and the result of the RT-PCR assays for different passages of recombinant SVA virus(C)

2.2 rCH/HeN-2018-EGFP重組熒光病毒的生長特性

為進一步分析SVA重組熒光病毒遺傳穩(wěn)定性，將rCH/HeN-2018-EGFP連續(xù)在PK-15細胞傳代10次，分析其病毒感染時熒光和基因組穩(wěn)定性。熒光觀察結果表明，P3～P10代次的rCH/HeN-2018-EGFP在感染過程中均能觀察到大量的綠色熒光細胞。針對CH/HeN-2018株1D和2B基因設計上下游引物(SVA-3394F/SVA-3665R)，RT-PCR試驗證實各代次rCH/HeN-2018-EGFP中含有EGFP基因，能夠克隆出1 055 bp的目的條帶，而不含有EGFP基因的野毒株wtCH/HeN-2018克隆出272 bp的目的條帶(圖2C)。此外，對P10代病毒RT-PCR產物進行測序，發(fā)現(xiàn)EGFP-P2A基因序列沒有出現(xiàn)突變的現(xiàn)象。

為驗證SVA重組熒光病毒與親本株之間生長特性的差異，分別將wtCH/HeN-2018、rCH/HeN-2018和rCH/HeN-2018-EGFP感染PK-15細胞，分析病毒生長曲線。試驗結果表明，wtCH/HeN-2018、rCH/HeN-2018和rCH/HeN-2018-EGFP 3種病毒在PK-15細胞中表現(xiàn)相似的生長曲線。均在感染后12、24和36 hpi病毒滴度逐步明顯上升，在36 hpi病毒滴度達到最高值。wtCH/HeN-2018和rCH/HeN-2018在48 hpi病毒滴度略有下降，而rCH/HeN-2018-EGFP在36 hpi 和48 hpi病毒滴度差異不明顯(圖3)。

2.3 基于rCH/HeN-2018-EGFP檢測姜黃素和黃芩苷抗SVA活性

為分析SVA重組熒光病毒作為抗SVA病毒藥物篩選工具的可行性，本研究進一步以SVA重組熒光病毒為研究對象，檢驗姜黃素和黃芩苷體外抑制SVA復制的影響。細胞毒性試驗結果表明姜黃素和黃芩苷藥物終濃度為20和110 μmol·L-1處理PK-15細胞時，其細胞活性與対照度無明顯差異(圖4)。姜黃素和黃芩苷藥物預處理PK-15細胞2 h后，接種0.1MOI的rCH/HeN-2018-EGFP 24 h，發(fā)現(xiàn)姜黃素處理組和黃芩苷處理組綠色熒光細胞數量較DMSO處理組明顯減少，其中，黃芩苷處理組減少極顯著(圖5A)。48 hpi時，觀察到黃芩苷處理組綠色熒光細胞數量較DMSO處理組多，但黃芩苷處理組存在較多細胞貼壁，貼壁細胞呈現(xiàn)綠色熒光，而DMSO處理組細胞脫落達70%左右。結果表明，黃芩苷和姜黃素藥物菌能夠抑制rCH/HeN-2018-EGFP體外復制，其中，黃芩苷能夠抑制效果較顯著。

2.4 姜黃素和黃芩苷體外抑制wtCH/HeN-2018增殖活性

為進一步證實姜黃素和黃芩苷體外抑制SVA增殖的效果，使用wtCH/HeN-2018對姜黃素和黃芩苷抗SVA效果進行評價。結果表明，48 dpi時，黃芩苷處理組和姜黃素處理組細胞病變的程度較緩和，可見較多細胞貼壁，而DMSO處理組細胞病變明顯，細胞脫落達85%左右。收取細胞上清進行病毒滴度試驗，結果表明，黃芩苷處理組病毒毒價明顯低于DMSO處理組，其中，黃芩苷處理組48 dpi病毒毒價與DMSO處理組相差100倍左右，抑制效果顯著(圖5B)，進一步證實黃芩苷藥物對SVA體外復制具有明顯的抑制效果。

姜黃素 1.0× 代表20 μmol·L-1，黃芩苷1.0× 代表110 μmol·L-11.0× curcumin represent of 20 μmol·L-1，1.0× baicalin represent of 110 μmol·L-1圖4 不同濃度藥物處理對PK-15細胞生長的影響(A)和對細胞活性的影響(B)Fig.4 Effect of drugs at different concentration on the growth and viability of PK-15 cells

圖5 姜黃素和黃芩苷處理對rCH/HeN-2018-EGFP(A，24 hpi)和wtCH/HeN-2018(B，48 hpi)復制的影響Fig.5 Effect of curcumin and baicalin treatment on the replication of rCH/HeN-2018-EGFP(A，24 hpi)and wtCH/HeN-2018(B，48 hpi)

3 討 論

病毒的反向遺傳技術是以獲得的病毒基因組序列為基礎，利用分子克隆技術構建病毒的感染性克隆模擬真實病毒粒子感染宿主，并復制、傳代，形成具有感染性的新病毒粒子的過程。自1981年Racaniello和Baltimore[16]首次建立了脊髓灰質炎病毒的反向遺傳操作系統(tǒng)以來，研究人員建立了針對副黏病毒、冠狀病毒、黃病毒、皰疹病毒、細小病毒等病毒的反向遺傳操作系統(tǒng)，該技術極大地擴展了人們對病毒的可操作性，推動了病毒學的快速發(fā)展。研究人員利用反向遺傳操作技術將綠色熒光蛋白、紅色熒光蛋白和熒光素酶等外源報告基因插入到病毒基因組中，構建病毒復制子或重組病毒，實現(xiàn)了抗病毒藥物的體外快速篩選過程。Li等[9]構建的綠色熒光蛋白標記的豬瘟病毒，并以此作為工具用毒簡化了血清中豬瘟中和抗體檢測試驗流程。申梁[7]將海參螢火蟲酶基因插入到人冠狀病毒HCoV-OC43基因組中，重組病毒rOC43-ns2DelRluc生長特性與親本株類似，可穩(wěn)定高效表達Rluc基因，并成功應用HCoV-OC43易感細胞和敏感藥物的篩選研究中。研究人員先后將海參螢火蟲酶和FMDV 2A蛋白的融合基因插入到寨卡病毒、登革熱病毒和坦布蘇病毒基因組結構基因第25氨基酸之后，拯救的重組病毒能夠穩(wěn)定表達熒光素酶蛋白，且應用到抗病毒蛋白和抗病毒藥物的篩選中[10, 17]。本研究中將EGFP基因和豬捷申病毒1型2A蛋白的融合基因插入到SVA基因組的2A和2B基因間，獲得了能夠穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白SVA重組病毒。

目前，在獸醫(yī)臨床中存在多種可用的抗病毒的藥物制劑，且實踐證明存在較好的動物疫病治療效果。關于抗病毒藥物的有效成分研究是近年來國內外研究的熱點方向。黃芪多糖、板藍根多糖、黃芩苷、姜黃素、山藥多糖、白藜蘆醇、牛膝多糖等成分能夠通過多種途徑抑制病毒的復制，具有較好的抗病毒治療療效[18]。為驗證所拯救的重組熒光SVA病毒是否能夠應用于抗病毒藥物的篩選試驗，本研究選用黃芩苷和姜黃素兩種藥物進行病毒抑制試驗。結果表明，黃芩苷具有明顯抑制SVA病毒復制的效果，能夠明顯降低rSVA-EGFP感染細胞的熒光表達量，且緩和病毒感染所造成病變現(xiàn)象的發(fā)生。黃芩苷是一類中藥黃芩主要活性成分，為黃酮類化合物，具有抵御病原微生物感染、抗炎和抗癌等多種生物功能[19]。Li等[20]研究表明黃芩苷能處理能夠明顯抑制EV71病毒體外復制過程，且降低感染細胞的凋亡。Qian等[21]研究表明，黃芩苷能夠降低禽白血病ALV-J感染時病毒細胞內化過程和感染性病毒粒子的產生，從而抑制ALV-J體外復制。Chen等[22]研究表明，黃芩苷和黃芩苷磷脂復合物能夠在體外明顯抑制鴨病毒性肝炎1型DHAV-1體外復制的能力，且黃芩苷能夠減弱DHAV-1內部核糖體進入位點的生物功能，從而影響病毒蛋白的翻譯過程。Geng等[23]證實黃芩苷能夠促進機體M1巨噬細胞極化，激活機體I型干擾素信號通路，從而抑制流感病毒復制。

自2014年起，SVA先后在多個美洲和亞洲養(yǎng)豬業(yè)發(fā)達國家暴發(fā)流行，如美國、巴西、加拿大、中國、泰國、哥倫比亞、越南等[1, 24]。2015年，SVA疫情首次在我國珠三角養(yǎng)豬密集地區(qū)暴發(fā)，隨后蔓延至湖北、河南、山東、福建、黑龍江、甘肅等多個省市地區(qū)，已經給我國養(yǎng)豬業(yè)帶來了一定的經濟損失[25]。鑒于目前國內外尚無可用SVA商品化疫苗上市，多數的SVA疫苗生物制品尚處于研發(fā)初級階段，到臨床應用存在較長的時間間隔，不能有效地解決當前防控SVA疫情的難題。本研究基于SVA反向遺傳操作系統(tǒng)構建并拯救SVA熒光毒株，為體外篩選具有抗SVA病毒活性的藥物提供一種快速有效的工具，能夠促進SVA防控藥物研發(fā)和致病機制的研究進程，符合防控SVA疫情當前階段的迫切需求。

4 結 論

將EGFP基因和豬捷申病毒1型2A蛋白的融合基因插入到SVA基因組的2A和2B基因間，獲得了能夠穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白SVA重組病毒，可以作為一種工具報告病毒應用于抗SVA藥物和蛋白的篩選過程。