湯亞茹，陽美霞，賈金美，張虹亮，王水蓮

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，長沙 410128)

睪丸間質(zhì)細胞集中散布于睪丸曲精小管間的疏松結(jié)締組織內(nèi)，主要參與睪酮的合成與分泌，雄性機體內(nèi)睪酮95%由睪丸間質(zhì)細胞分泌，睪酮在維持雄性動物的生殖器官分化、雄性動物的第二性征、雄性副性腺的發(fā)育和功能以及維持精子發(fā)生中起著重要的作用[1-2]；睪丸間質(zhì)細胞的數(shù)量、形態(tài)改變和合成分泌睪酮的功能下降都會引起一系列的生殖障礙疾病[3]。

促性腺激素抑制激素(gonadotropin-inhibitory hormone, GnIH)是最初由Tsutsui等[4]在鵪鶉下丘腦中發(fā)現(xiàn)的一類含有精氨酰-苯丙酰胺(RF酰胺)的神經(jīng)肽，在哺乳動物中，GnIH同源物為RF酰胺相關(guān)肽-3(RFamide-relatedpetide，RFRP-3，別稱Npvf)，具有拮抗下丘腦分泌的促性腺激素釋放激素(GnRH)的作用[4-7]。有報道稱，GnIH不僅對動物攝食[8]、行為[9]、應(yīng)激[10]、能量代謝[11]和生物節(jié)律[12]有調(diào)節(jié)作用，而且對動物生殖活動也有重要的調(diào)節(jié)作用。相關(guān)研究表明，哺乳動物的GnIH可通過下丘腦作用于GnRH神經(jīng)元來抑制促性腺激素的釋放與合成[13]，還可直接作用于垂體來抑制促性腺激素(FSH和LH)的合成和分泌[14-15]，進而抑制動物的生殖。GnIH可參與雌性動物季節(jié)性發(fā)情調(diào)節(jié)和發(fā)情時期轉(zhuǎn)換[16]；影響卵泡的發(fā)育、凋亡和黃體化[17]；影響顆粒細胞的增殖和卵巢類固醇的生成[17-18]，從而影響雌性哺乳動物生殖。GnIH還可影響附睪的組織學(xué)變化、生殖細胞數(shù)量、精子的生成和睪酮水平[19-20]，從而影響雄性哺乳動物生殖。但是，GnIH對睪丸間質(zhì)細胞生長發(fā)育的直接影響和對睪丸間質(zhì)細胞睪酮分泌的機制研究尚不完全清晰。本研究通過構(gòu)建GnIH過表達載體并體外轉(zhuǎn)染小鼠睪丸間質(zhì)細胞，探究其對小鼠睪丸間質(zhì)細胞(TM3細胞系)凋亡的效應(yīng)及睪酮合成的調(diào)節(jié)作用，為揭示GnIH在雄性哺乳動物生殖調(diào)控過程中的作用及機制提供科學(xué)理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗樣品

成熟的6～8周雄性ICR小鼠購自斯萊克景達公司。根據(jù)美國國立衛(wèi)生研究院指南對所有小鼠進行實驗動物的護理和使用。飼養(yǎng)環(huán)境溫度維持在(22±3)℃，相對濕度為50%～70%，并保持12 h的明暗循環(huán)。給小鼠飼喂標準日糧并自由飲水。TM3細胞系由本實驗室凍存。

1.2 主要試劑

質(zhì)粒PLVX-IRES-ZsGreen1從長沙市贏潤生物公司購買；DH5α感受態(tài)細胞、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix Ex Taq購自TaKaRa公司；EcoR Ⅰ內(nèi)切酶、BamH Ⅰ內(nèi)切酶、無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提取試劑盒、無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提取試劑盒購自康為試劑公司；RNA提取試劑盒購自天恩澤公司；胎牛血清購自Gibco公司；Opti-MEM、LipofectamineTM2000購自Invitrogen公司；0.25%胰蛋白酶購自碧云天生物技術(shù)研究所；DME/F-12(1∶1)培養(yǎng)基購自浙江天杭生物科技有限公司；小鼠睪酮含量測定試劑盒購自武漢華美公司；細胞凋亡檢測試劑盒購自吉凱生物。

1.3 GnIH過表達載體的構(gòu)建與鑒定

小鼠脫頸處死后取睪丸組織，按RNA提取試劑盒說明書提取睪丸組織RNA。將組織RNA用TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA(-20 ℃保存)。用表1設(shè)計的目的基因GnIH特異性引物(含EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ酶切位點及保護堿基)進行目的基因的擴增、純化及回收。用EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ雙酶切回收的目的片段和表達載體PLVX-IRES-ZsGreen1酶切產(chǎn)物，用T4 DNA連接酶于16 ℃水浴連接過夜。產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入DH5α 感受態(tài)，Amp+LB平板培養(yǎng)，挑取8個單菌落擴大培養(yǎng)，進行質(zhì)粒小提，質(zhì)粒分別進行酶切驗證并送至華大基因公司測序鑒定。鑒定出的正確陽性菌株(含GnIH過表達質(zhì)粒)再擴大培養(yǎng)，采用全式金無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒提取質(zhì)粒(-20 ℃保存)。

表1 GnIH基因引物序列

1.4 TM3細胞培養(yǎng)

復(fù)蘇并培養(yǎng)TM3細胞(離心去除上清二甲基亞砜DMSO；DME/F-12+5% FBS+1%青鏈霉素)，細胞長至90%時進行1∶1傳代(含0.25%EDTA的胰酶消化)和培養(yǎng)，至少傳兩代。試驗前將細胞消化、重懸并接種至新的培養(yǎng)板培養(yǎng)。

1.5 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

TM3細胞以5×105個·孔-1密度鋪板于六孔板中，當細胞融合率到達80%左右時更換為無雙抗無血清培養(yǎng)基(DME/F-12)饑餓處理2～4 h，轉(zhuǎn)染步驟參照Lipofectamine TM 2000說明書進行，試驗分為2組：PLVX-IRES-ZsGreen1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(空質(zhì)粒組)，PLVX-IRES-ZsGreen1-GnIH過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(GnIH過表達組)，每組3個重復(fù)。轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)72 h，顯微鏡視野下觀察熒光并收集細胞和上清液。

1.6 過表達GnIH對TM3細胞凋亡率影響

不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染TM3細胞72 h后收集各組細胞樣，參照凋亡試劑盒說明書PI/FITC雙染色法原理進行試驗，最后利用流式細胞儀檢測TM3細胞凋亡情況，并計算凋亡率。

1.7 TM3細胞睪酮分泌含量測定

收集轉(zhuǎn)染72 h后空質(zhì)粒組和GnIH過表達組的細胞上清液，采用武漢華美小鼠睪酮試劑盒測定各組中睪酮含量，具體步驟按說明書進行；在450 nm波長處依次測量各孔的吸光度(OD值)，并計算睪酮濃度。

1.8 實時熒光定量PCR檢測基因表達

收集空質(zhì)粒組和GnIH過表達組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的TM3細胞，提取細胞RNA，逆轉(zhuǎn)錄后以cDNA為模板進行實時熒光定量PCR，檢測GnIH、睪酮合成相關(guān)酶基因(StAR、P450 scc、3β-HSD、17β-HSD和P450c17)和凋亡相關(guān)基因(Bax、Bcl-2和P53)mRNA 表達量變化。RT-PCR體系為：SYBR?Premix Ex Taq(2×)10 μL、Forward Primer(10 μmol·L-1)0.2 μL、Reverse Primer(10 μmol·L-1)0.2 μL、ROX Reference Dye(50×)0.4 μL、cDNA 2 μL、 dH2O 7.2 μL。 反應(yīng)條件： 95 ℃ 30 s、95 ℃ 5 s、 57 ℃ 30 s、95 ℃ 15 s、61 ℃ 60 s、95 ℃ 15 s、40個循環(huán)， 最后利用CT值分析結(jié)果(β-actin作為內(nèi)參)?；蛞镄蛄腥绫?所示。

表2 qRT-PCR反應(yīng)引物序列

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

所有試驗都獨立重復(fù)3次，結(jié)果用“平均值±標準誤(Means±SEM)”表示。所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析均使用SPSS19.0軟件進行，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。兩組之間的差異顯著性比較用獨立樣本t檢驗進行分析。

2 結(jié) 果

2.1 GnIH過表達質(zhì)粒PCR和測序鑒定

陽性質(zhì)粒GnIH過表達質(zhì)粒經(jīng)內(nèi)切酶EcoRⅠ、BamHⅠ雙酶切后切下約567 bp的GnIH基因片段和8 204 bp的載體片段，條帶較明顯(圖1A)。GnIH過表達質(zhì)粒送至華大基因公司進行序列測定，將測序所得的序列在NCBI中進行序列比對，顯示構(gòu)建序列與目的基因堿基序列一致(圖1B)，表明GnIH過表達質(zhì)粒構(gòu)建成功。

A. GnIH過表達質(zhì)粒雙酶切電泳圖，泳道1.1 kb Plus DNA Ladder;泳道2.空質(zhì)粒雙酶切;泳道3.GnIH過表達質(zhì)粒雙酶切;泳道4.Trans2K DNA Marker. B. GnIH過表達質(zhì)粒測序后比對結(jié)果，Query.比對序列; Sbjct.目標序列A. Dual-enzyme digestion of GnIH overexpression plasmid electropherogram, Lane 1. 1 kb Plus DNA Ladder; Lane 2. Dual-enzyme digestion of empty plasmid; Lane 3. Dual-enzyme digestion of GnIH overexpression plasmid; Lane 4. Trans2K DNA marker. B. Result of sequence comparison of GnIH overexpression plasmid, Query. Alignment sequence; Sbjct. Target sequence圖1 GnIH過表達質(zhì)粒PCR和測序鑒定Fig.1 PCR and sequencing identification of GnIH overexpression plasmid

2.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率鑒定

空載體質(zhì)粒和GnIH過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染TM3細胞72 h，熒光顯微鏡觀察各孔細胞中綠色熒光蛋白的表達情況，各組轉(zhuǎn)染效率為60%左右(圖2A、B)，滿足后續(xù)實驗的要求。轉(zhuǎn)染72 h后收集細胞，用qRT-PCR法檢測不同轉(zhuǎn)染組TM3細胞中GnIH基因的表達量，結(jié)果顯示，過表達組GnIHmRNA與空質(zhì)粒組相比極顯著升高(P<0.01)，表明GnIH過表達載體構(gòu)建成功并在TM3細胞中表達(圖2C)。

A. 空質(zhì)粒組；B. GnIH過表達組；C. GnIH mRNA的相對表達量；組間比較:*.P<0.05;**.P<0.01.下同A. Empty plasmid group; B. GnIH overexpression group; C. Relative expression of GnIH mRNA; Comparison among groups:*.P<0.05;**.P<0.01.The same as below圖2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率鑒定Fig.2 Plasmid transfection efficiency identification

2.3 過表達GnIH對TM3細胞凋亡的影響

空載體質(zhì)粒和GnIH過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染TM3細胞72 h后收集細胞，用流式細胞術(shù)和qRT-PCR法分別檢測不同轉(zhuǎn)染組細胞凋亡情況和細胞凋亡相關(guān)基因P53、Bax/Bcl-2 mRNA的表達情況。結(jié)果表明，細胞轉(zhuǎn)染不同質(zhì)粒后，過表達組細胞凋亡率(20.38±1.20)%相比于空質(zhì)粒組細胞凋亡率(7.24±0.59)%顯著增加，且差異極顯著(P<0.01,圖3C)；與空質(zhì)粒組相比，GnIH過表達組P53 mRNA表達量極顯著上調(diào)(P<0.01)；過表達組Bax/Bcl-2比值與空質(zhì)粒組相比極顯著增大(P<0.01,圖3D)。

2.4 過表達GnIH對TM3細胞睪酮合成與分泌的影響

空載體質(zhì)粒和GnIH過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染TM3細胞，72 h后收集細胞培養(yǎng)液和細胞，用ELISA和qRT-PCR法分別檢測不同轉(zhuǎn)染組睪酮分泌水平和睪酮合成相關(guān)酶基因(StAR、P450scc、3β-HSD、17β-HSD和P450c17)mRNA表達水平。結(jié)果表明，與空質(zhì)粒組相比，過表達組睪酮分泌水平極顯著下降(P<0.01,圖4A)；過表達組StAR、3β-HSD和P450c17 mRNA表達量與空質(zhì)粒組相比顯著降低(P<0.05)，P450 scc mRNA表達量與空質(zhì)粒組相比極顯著降低(P<0.01)，17β-HSDmRNA表達量在兩組間差異不顯著(P>0.05,圖4B)。

3 討 論

在雄性動物中，睪丸間質(zhì)細胞的凋亡會嚴重影響雄性動物的生殖[1-3]。現(xiàn)有文獻報道稱，GnIH也可影響雄性生殖，如誘導(dǎo)雄性成年鳥類的睪丸凋亡和曲細精管退化[21]；誘導(dǎo)大鼠附睪細胞凋亡[19]；影響小鼠生殖細胞的增殖和凋亡來抑制精子形成[20]。Bax、Bcl-2、P53均是參與調(diào)控細胞凋亡的關(guān)鍵細胞因子，Bcl-2是一種具有抑制凋亡作用的癌基因，而Bax是具有促進細胞凋亡作用的基因，兩者可通過形成二聚體而發(fā)揮調(diào)控細胞凋亡的作用[22-23]。Bax與Bcl-2兩基因表達量的比值體現(xiàn)了細胞生理情況，比值升高說明細胞趨向于凋亡，而比值降低表明細胞趨向于健康狀態(tài)[24-25]。P53同樣作為促進細胞調(diào)亡的關(guān)鍵基因，是Bax與Bcl-2的上游調(diào)控基因，正常情況下P53可以上調(diào)Bax和下調(diào)Bcl-2的表達來促進細胞發(fā)生凋亡[26-28]。在褪黑素對睪丸間質(zhì)細胞凋亡影響的研究中發(fā)現(xiàn)，細胞內(nèi)Bcl-2表達水平上升， Bax表達水平下降[29]。但目前尚無GnIH與睪丸間質(zhì)細胞關(guān)系的研究。本研究也證實了GnIH過表達組細胞凋亡率顯著增加，Bax/Bcl-2比值過表達組顯著高于空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組，過表達組P53 mRNA表達量也顯著上調(diào)。這些結(jié)果說明GnIH對睪丸無論是精子形成還是間質(zhì)細胞發(fā)育均有抑制作用。

A.空質(zhì)粒組；B. GnIH過表達組；C. 細胞凋亡率統(tǒng)計圖；D. 凋亡相關(guān)基因表達水平A.Empty plasmid group; B. GnIH overexpression group; C. Apoptosis rate statistics chart; D. Apoptosis-related gene expression level圖3 過表達GnIH對TM3細胞凋亡的影響Fig.3 Effect of overexpression of GnIH on the apoptosis in TM3 cells

機體內(nèi)的睪酮主要由睪丸間質(zhì)細胞合成[1-3]。本研究構(gòu)建了GnIH過表達重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染至TM3細胞72 h后發(fā)現(xiàn)，GnIH能抑制睪丸間質(zhì)細胞睪酮的合成。這一結(jié)果與Anjum等[20]和Zheng等[30]研究報道一致。目前，GnIH抑制睪丸間質(zhì)細胞睪酮合成的機理研究較少，本研究檢測了間質(zhì)細胞中類固醇合成相關(guān)酶基因水平，結(jié)果表明，過表達組睪酮合成酶基因StAR、P450scc、3β-HSD和P450c17 mRNA表達量與空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組相比顯著降低，這一結(jié)果更進一步證明GnIH能抑制睪酮合成。

A.GnIH過表達對TM3細胞睪酮分泌的影響；B. GnIH過表達對TM3細胞睪酮合成相關(guān)酶基因表達的影響A.Effect of GnIH overexpression on the secretion of testosterone in TM3 cellsl; B. Effect of GnIH overexpression on gene expression of testosterone synthesis-related enzymes in TM3 cells圖4 GnIH過表達對TM3細胞睪酮合成與分泌的影響Fig.4 Effect of GnIH overexpression on the synthesis and secretion of testosterone in TM3 cells

4 結(jié) 論

本研究成功構(gòu)建了GnIH過表達載體，GnIH過表達可誘導(dǎo)TM3細胞凋亡，抑制睪酮合成相關(guān)酶的表達，進而抑制睪酮分泌。