張克山，高廣亮，李 琴，趙獻(xiàn)芝,李 靜，王啟貴*

(1.重慶市畜牧科學(xué)院，重慶 402460； 2. 重慶市肉鵝遺傳改良工程技術(shù)研究中心，重慶 402460)

鵝的低繁殖力是養(yǎng)鵝業(yè)產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的關(guān)鍵制約因素，如何提高鵝的產(chǎn)蛋數(shù)是當(dāng)前鵝遺傳育種的主要任務(wù)，鵝的產(chǎn)蛋數(shù)直接受成熟卵泡數(shù)量影響。鵝卵泡發(fā)育是一個(gè)逐級(jí)發(fā)育過(guò)程，在這個(gè)過(guò)程中絕大多數(shù)會(huì)因細(xì)胞凋亡而閉鎖，僅少數(shù)被選擇優(yōu)勢(shì)化而成熟排卵，其中激素是最重要的維持因子之一[1-3]。促性腺激素抑制激素(gonadotropin-inhibitory hormone，GnIH)是下丘腦神經(jīng)肽的一種，也是目前發(fā)現(xiàn)的唯一一種對(duì)卵巢發(fā)育起抑制作用的神經(jīng)肽[4-5]，通過(guò)結(jié)合G蛋白偶聯(lián)受體NPFFR1在下丘腦-垂體-卵巢軸或卵巢水平直接參與調(diào)控性行為、發(fā)情周期、雌激素循環(huán)和卵泡發(fā)育等繁殖相關(guān)進(jìn)程[6-10]。家禽的卵泡成熟存在著周期節(jié)律程序，周期節(jié)律調(diào)控分子又與激素分泌、細(xì)胞增殖凋亡存在分子偶聯(lián)[11-13]。Kim等[14]研究發(fā)現(xiàn)，促性腺激素抑制激素抑制顆粒細(xì)胞Fas/FasL表達(dá)水平，促進(jìn)P53表示，抑制細(xì)胞凋亡。Sen和Hoffmann[15]研究了核心周期調(diào)控基因Clock、Bmal1和Per等在激素釋放和生殖軸靶組織激素敏感性中的作用，證實(shí)下丘腦(視交叉上核、kisspeptin和GnRH神經(jīng)元)、垂體(促性腺激素)、卵巢(卵泡膜和顆粒細(xì)胞)、睪丸(leydig細(xì)胞)以及子宮(子宮內(nèi)膜和子宮肌層)的激素釋放與靶組織的激素敏感性受到周期節(jié)律基因調(diào)控。Kelleher等[16]研究發(fā)現(xiàn)，核心晝夜節(jié)律基因調(diào)控細(xì)胞周期基因(c-Myc、Wee1、cyclinD和p21)的表達(dá)。Angelopoulou等[17]研究發(fā)現(xiàn)，小鼠下丘腦中的GnIH同源類(lèi)似物NPFF通過(guò)NPFFR1受體及其典型信號(hào)通路(Gi/o蛋白和G蛋白偶聯(lián)的內(nèi)向整流鉀通道)抑制GnRH神經(jīng)元的興奮性，參與晝夜節(jié)律、季節(jié)性繁殖和社會(huì)行為調(diào)控。

總之，卵泡的發(fā)育是一個(gè)由激素及其受體、細(xì)胞增殖分化及凋亡、周期節(jié)律等互作調(diào)控的過(guò)程，本試驗(yàn)研究NPFFR1在等級(jí)前卵泡顆粒細(xì)胞過(guò)表達(dá)對(duì)卵泡顆粒細(xì)胞激素分泌和細(xì)胞凋亡的影響，并通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序篩選與卵泡發(fā)育相關(guān)的重要差異表達(dá)基因，揭示其內(nèi)在的基因互作網(wǎng)絡(luò)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

取9只健康產(chǎn)蛋期42周齡四川白鵝進(jìn)行屠宰，按直徑大小采集等級(jí)前小白卵泡(2～4 mm, small white follicle, SWF)、大白卵泡(4～6 mm, large white follicle, LWF)、小黃卵泡(6～8 mm, small yellow follicle, SYF)、大黃卵泡(8～10 mm, large yellow follicle, LYF)和F5～F1等級(jí)卵泡，劃破卵泡釋放卵泡液或卵黃，PBS緩沖液輕輕漂洗卵泡，直至分離顆粒細(xì)胞層，立即置于液氮中速凍后轉(zhuǎn)放入-80 ℃冰箱保存、備用，以進(jìn)行組織總RNA抽提。

1.2 主要試劑

RNA提取試劑盒購(gòu)自Qiagen公司(73404，德國(guó))；Q5熱啟動(dòng)超保真DNA聚合酶(M0494S，美國(guó)))和平末端/TA 連接酶預(yù)混液(M0367S，美國(guó)) 購(gòu)自NEB公司；限制性?xún)?nèi)切酶EcoR I、Hind Ⅲ、pMD19-T Simple 和DNA Marker DL2000均購(gòu)自寶生物(大連)工程有限公司；DNA片段凝膠回收試劑盒和質(zhì)?？焖俪樘峒兓噭┖匈?gòu)購(gòu)自O(shè)mega(美國(guó))公司；GnIH激素購(gòu)自 phoenix pharmaceuticals公司；反轉(zhuǎn)錄試劑Promega GoScriptTM Reverse Transcription System (A5001，美國(guó))和熒光定量試劑GoTaq?qPCR Master Mix(A6001，美國(guó))均購(gòu)自Promega公司；DMEM/F12培養(yǎng)基、LipofectamineTM3000 Transfection Reagent、胎牛血清、膠原酶均購(gòu)自ThermoFisher Scientific公司；一步法TUNEL檢測(cè)試劑盒購(gòu)自廣州銳博生物科技有限公司。TOP10感受態(tài)細(xì)胞和pcDNA3.1(+)質(zhì)粒由重慶市畜牧科學(xué)院家禽研究所分子實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 NPFFR1在四川白鵝各級(jí)卵泡顆粒細(xì)胞中 RT-qPCR分析

根據(jù)NCBI上發(fā)表的鵝NPFFR1基因序列(登錄號(hào)：XM_013172544.1)，用Primer primer5.0設(shè)計(jì)引物，引物序列見(jiàn)表1；按“1.1”的方法分離顆粒層，將分離的顆粒層用Qiagen試劑盒提取細(xì)胞的總RNA，利用GoScriptTM Reverse Transcription System試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得各樣品的cDNA。利用設(shè)計(jì)的NPFFR1定量引物對(duì)cDNA模板進(jìn)行qPCR檢測(cè)。反應(yīng)體系：2× GoTaq?qPCR Master Mix 5 μL，上、下游引物各0.2 μL，模板cDNA 1 μL， CXR Reference Dye 0.2 μL，ddH2O 3.4 μL。擴(kuò)增條件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min， 40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參基因，ABI7900H進(jìn)行熒光定量檢測(cè)，2-ΔΔCt法計(jì)算NPFFR1 mRNA基因在各階段卵泡細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列

1.4 NPFFR1基因CDS區(qū)克隆及真核表達(dá)載體構(gòu)建

以卵巢組織cDNA為模板，設(shè)計(jì)合適的擴(kuò)增引物克隆NPFFR1基因的CDS區(qū)，反應(yīng)體系：Q5 Hot Start High-Fidelity 2× Master Mix 25 μL，上、下游引物各1 μL，模板cDNA 1 μL， ddH2O 22 μL。擴(kuò)增條件：98 ℃ 30 s；98 ℃ 10 s，58.5 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 2 min；16 ℃ 5 min。1%的瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)后，用膠回收試劑盒回收產(chǎn)物，連接T載體進(jìn)行克隆測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果正確的序列用Hind Ⅲ和EcoR I雙酶切后，克隆到pcDNA3.1(+)質(zhì)粒中，構(gòu)建pcDNA-NPFFR1質(zhì)粒，送樣測(cè)序，將測(cè)序結(jié)構(gòu)正確的質(zhì)粒擴(kuò)大培養(yǎng)，去內(nèi)毒素抽提質(zhì)粒，保存于-20 ℃，以備轉(zhuǎn)染用。

1.5 NPFRR1基因過(guò)表達(dá)對(duì)顆粒細(xì)胞激素分泌的影響

取健康同批次產(chǎn)蛋四川白鵝(42周齡)的卵巢，同“1.3”中方法分離等級(jí)前和等級(jí)卵泡顆粒層，VI膠原酶充分消化分散細(xì)胞，將分散的細(xì)胞分別接種到含10%完全培養(yǎng)基的12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔接種量5×105個(gè)，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%后，LipofectamineTM3000 Transfection Reagent進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，每孔質(zhì)粒量1 μg，重復(fù)9個(gè)孔，設(shè)立空載對(duì)照。將轉(zhuǎn)染72 h的細(xì)胞收集上清液和細(xì)胞沉淀，上清液送上海恒遠(yuǎn)公司，ELASA法檢測(cè)細(xì)胞上清液中雌二醇(estradiol, E2)、孕酮(progesterone, P4)和抗繆勒管激素(anti-Mullerian hormone, AMH)的含量；一部分細(xì)胞沉淀經(jīng)裂解，提取總RNA，一部分細(xì)胞收集，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 顆粒細(xì)胞過(guò)表達(dá)NPFFR1基因的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與分析

分離自大黃卵泡(8～10 mm)的顆粒細(xì)胞同“1.5”中的方法轉(zhuǎn)染構(gòu)建pcDNA3.1-NPFFR1質(zhì)粒，設(shè)立空載對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3個(gè)孔，72 h后收集細(xì)胞送百邁克生物測(cè)序公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，測(cè)序方法和數(shù)據(jù)處理方法見(jiàn)課題組前期研究[18-19]，Illumina Hiseq2000測(cè)序，注釋參考鵝基因組來(lái)自于本課題組測(cè)序拼裝[20]，篩選差異表達(dá)基因(fold change≥2，F(xiàn)DR<0.05)，獲得的差異表達(dá)基因列表上傳MetaScape網(wǎng)站(http://metascape.org)，選擇小鼠進(jìn)行基因功能聚類(lèi)分析。

1.7 NPFFR1基因過(guò)表達(dá)對(duì)顆粒細(xì)胞凋亡的影響

按照“1.5”的方法獲得等級(jí)前卵泡(8～10 mm)顆粒細(xì)胞，接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔接種5× 104個(gè)，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%后，LipofectamineTM3000 Transfection Reagent進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，每孔質(zhì)粒量100 ng，重復(fù)4個(gè)孔，設(shè)立空載對(duì)照。細(xì)胞轉(zhuǎn)染72 h后采用廣州銳博生物科技公司生產(chǎn)的一步法TUNEL檢測(cè)試劑盒按使用說(shuō)明檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，隨機(jī)取3個(gè)點(diǎn)，用ImageJ軟件處理熒光信號(hào)強(qiáng)度。

1.8 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS17.0軟件GLM模塊對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，試驗(yàn)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”的形式表示，采用單因素方差分析，用LSD法和Duncan法進(jìn)行多重比較和差異性子集分類(lèi)，以P<0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 NPFFR1 mRNA在四川白鵝各級(jí)卵泡顆粒細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量

NPFFR1 mRNA在四川白鵝各級(jí)卵泡顆粒細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量結(jié)果如圖1所示，NPFFR1在各階段卵泡顆粒細(xì)胞中均有表達(dá)，在等級(jí)前各階段均處于低水平表達(dá)，但卵泡進(jìn)入等級(jí)階段發(fā)育后，NPFFR1表達(dá)量極顯著上升(P<0.01)，在F5階段達(dá)到高峰，隨后逐漸下降，直到進(jìn)入排卵前卵泡F1階段，出現(xiàn)極顯著下調(diào)表達(dá)(P<0.01)。

相同字母代表差異不顯著(P>0.05)，不同字母代表差異顯著(P<0.05)，大小寫(xiě)字母間代表差異在P<0.01水平顯著The same letter means not significant difference(P>0.05), the different letters mean significant difference (P<0.05), the difference between upper and lower case letters means that the difference is extremely significant at the level of P<0.01圖1 四川白鵝NPFFR1 mRNA在各等級(jí)前和等級(jí)卵泡顆粒細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量Fig.1 The mRNA expression level of NPFFR1 in follicular granulosa cells of Sichuan white geese

2.2 鵝NPFFR1基因CDS區(qū)克隆及pcDNA3.1(+)-NPFFR1真核表達(dá)質(zhì)粒載體構(gòu)建

NPFFR1特異性引物PCR擴(kuò)增后產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠檢測(cè)獲得了單一的特異性條帶，大小與預(yù)期目的條帶1 200 bp相符(圖2A)，將測(cè)序結(jié)果正確的片段經(jīng)雙酶切后插入pcDNA3.1(+)空載體中，質(zhì)粒酶切結(jié)果如圖2B所示，成功構(gòu)建了pcDNA3.1(+)-NPFFR1真核表達(dá)質(zhì)粒載體；將構(gòu)建成功的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染卵泡顆粒細(xì)胞，RT-PCR檢測(cè)過(guò)表達(dá)效率，結(jié)果如圖2C所示，顆粒細(xì)胞轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-NPFFR1質(zhì)粒后，NPFFR1極顯著上調(diào)表達(dá)(P<0.001)。

2.3 NPFFR1過(guò)表達(dá)對(duì)鵝卵泡顆粒細(xì)胞分泌激素的影響

ELISA檢測(cè)鵝卵泡顆粒細(xì)胞過(guò)表達(dá)NPFFR1基因后，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中E2、P4和AMH 的含量，結(jié)果如表2所示，過(guò)表達(dá)NPFFR1后，對(duì)等級(jí)前卵泡顆粒細(xì)胞分泌E2無(wú)顯著影響(P>0.05)，但顯著下調(diào)等級(jí)卵泡顆粒細(xì)胞E2濃度(P<0.05)；過(guò)表達(dá)NPFFR不論是對(duì)等級(jí)前還是等級(jí)后顆粒細(xì)胞P4分泌都沒(méi)有顯著影響(P>0.05)，但不論是否過(guò)表達(dá)NPFFR1，等級(jí)前顆粒細(xì)胞上清液的P4含量顯著高于等級(jí)階段顆粒細(xì)胞(P<0.05)；過(guò)表達(dá)NPFFR1顯著減少了等級(jí)前顆粒細(xì)胞分泌AMH(P<0.05)，而對(duì)等級(jí)顆粒細(xì)胞影響不顯著(P>0.05)。

表2 顆粒細(xì)胞上清液中E2、P4和AMH的含量

A. NPFFR1基因完整CDS區(qū)擴(kuò)增結(jié)果；B. 構(gòu)建的pcDNA3.1-NPFFR1質(zhì)粒雙酶切鑒定；C. 顆粒細(xì)胞過(guò)表達(dá)NPFFR1效率檢測(cè)。***. P<0.001A. The cloning result of the CDS region in NPFFR1; B. The pcDNA3.1-NPFFR1 plasmid confirmed by dual-enzyme digestion; C. The transfection efficiency of the pcDNA3.1-NPFFR1 plasmid in the granulosa cells.***. P<0.001圖2 NPFFR1基因真核表達(dá)載體構(gòu)建和過(guò)表達(dá)效率檢測(cè)Fig.2 Construction of the pcDNA3.1(+)-NPFFR1 plasmid and its overexpression in the granulosa cells

2.4 NPFFR1基因?qū)β雅菁?xì)胞凋亡的影響

顆粒細(xì)胞過(guò)表達(dá)NPFFR1后，相比于對(duì)照組，紅色熒光信號(hào)增強(qiáng)，TUNEL染色陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)明顯多于對(duì)照組(圖3)。過(guò)表達(dá)NPFFR1，促進(jìn)了顆粒細(xì)胞的凋亡。

圖3 過(guò)表達(dá)NPFFR1對(duì)顆粒細(xì)胞凋亡的影響(400×)Fig.3 Effect of NPFFR1 overexpression on apoptosis of granulosa cells(400×)

2.5 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析結(jié)果與驗(yàn)證

顆粒細(xì)胞過(guò)表達(dá)NPFFR1前后，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)與參考基因組比對(duì)結(jié)果如表3所示，匹配率介于87.90%～89.49%。共篩選到267個(gè)差異表達(dá)基因，其中148個(gè)顯著上調(diào)，119個(gè)顯著下調(diào)。對(duì)這些差異表達(dá)基因進(jìn)行功能聚類(lèi)分析后發(fā)現(xiàn)，其主要富集到胞內(nèi)進(jìn)程(GO：00009987)、繁殖進(jìn)程(GO:0022414)、生物調(diào)節(jié)(GO:0065007)、細(xì)胞增殖(GO:0008283)、節(jié)律進(jìn)程(GO:0048511)等，篩選與卵泡發(fā)育密切相關(guān)的基因AMH、FOS(proto-oncogene, AP-1 transcription factor subunit)、Clock(clock circadian regulator)、ANTXR2(cell adhesion molecule 2)和Per(period circadian regulator)等進(jìn)行qPCR驗(yàn)證，結(jié)果顯示(圖4)，AMH顯著下調(diào)表達(dá)(P<0.05)，F(xiàn)OS、Clock、ANTXR2和Per分別極顯著(P<0.01)和顯著(P<0.05)上調(diào)表達(dá)，與測(cè)序結(jié)果相一致。

表3 顆粒細(xì)胞過(guò)表達(dá)NPFFR1基因轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與參考鵝基因組的匹配率

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，NPFFR1基因在各級(jí)卵泡顆粒細(xì)胞中均有表達(dá)，在卵泡由等級(jí)前向F5等級(jí)卵泡發(fā)育過(guò)程中，顆粒細(xì)胞中的NPFFR1極顯著上調(diào)表達(dá)(P<0.01)，在排卵的F1級(jí)階段，又出現(xiàn)顯著下調(diào)表達(dá)(P<0.05)，提示NPFFR1可能直接參與了卵泡發(fā)育的這些重要過(guò)程。目前已有大量試驗(yàn)表明，禽類(lèi)和哺乳動(dòng)物中GnIH的同源類(lèi)似物RFRP3，除了在下丘腦抑制GnRH神經(jīng)元激活以釋放促性腺激素[21-23]，在卵巢組織也局部表達(dá)，可抑制許多脊椎動(dòng)物的類(lèi)固醇生成和卵泡發(fā)育[24-26]。

A.鵝卵泡顆粒細(xì)胞過(guò)表達(dá)NPFFR1基因后功能變化；B.Real-time PCR方法驗(yàn)證差異表達(dá)基因A.The gene function enrichment for the differentially expressed genes in the granulosa cells overexpressed NPFFR1; B.The validation of DEGs by real-time PCR圖4 顆粒細(xì)胞過(guò)表達(dá)NPFFR1轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析與驗(yàn)證Fig.4 Analysis and validation of transcriptome data of NPFFR1 overexpression in granulosa cells

Henningsen等[27]研究發(fā)現(xiàn)，在敘利亞倉(cāng)鼠中，RFRP3及其受體NPFFR1強(qiáng)烈受到光周期調(diào)控，通過(guò)kisspeptin節(jié)律性地調(diào)節(jié)促排卵黃體生成激素分泌；Biran等[28]證實(shí)，RFRP3及其受體(NPFFR1和NPFFR2)在貓卵巢中表達(dá)，低濃度RFRP3能降低體外培養(yǎng)的腔前卵泡存活率，促進(jìn)孕酮分泌。家禽的卵泡發(fā)育是一個(gè)等級(jí)發(fā)育過(guò)程，大量的卵泡在等級(jí)前卵泡發(fā)育過(guò)程中會(huì)凋亡閉鎖，只有極少數(shù)卵泡被選擇優(yōu)勢(shì)化進(jìn)入等級(jí)卵泡發(fā)育成熟并排卵，這個(gè)過(guò)程中顆粒細(xì)胞發(fā)揮著重要作用[29]?，F(xiàn)有的研究表明，等級(jí)前顆粒細(xì)胞不論在形態(tài)還是功能上都與等級(jí)顆粒細(xì)胞有著明顯差異[30-32]。本研究發(fā)現(xiàn)，在鵝等級(jí)卵泡顆粒細(xì)胞中過(guò)表達(dá)NPFFR1可顯著下調(diào)雌二醇分泌(P<0.05)，而對(duì)AMH分泌，在兩個(gè)階段的顆粒細(xì)胞則出現(xiàn)與E2相反的結(jié)果；盡管過(guò)表達(dá)NPFFR1對(duì)等級(jí)前后顆粒細(xì)胞分泌的P4影響均不顯著，但由表2可知，等級(jí)前顆粒細(xì)胞和等級(jí)顆粒細(xì)胞分泌P4濃度存在著顯著差異(P<0.05)，這也進(jìn)一步提示，NPFFR1對(duì)卵泡顆粒細(xì)胞激素分泌的影響存在階段性差異。

為了進(jìn)一步研究NPFFR1過(guò)表達(dá)對(duì)顆粒細(xì)胞的作用，本研究使用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的方法，篩選了一些與卵泡發(fā)育密切相關(guān)的繁殖進(jìn)程(GO:0022414)相關(guān)的重要差異表達(dá)基因，其中包含AMH、FOS、Clock和Per等。AMH是由早期發(fā)育階段卵泡顆粒細(xì)胞特異性產(chǎn)生的一種性激素，其血清含量是原始卵泡池大小的一個(gè)重要指標(biāo)[33]，在人類(lèi)中直接影響著婦女的生殖時(shí)長(zhǎng)[34-35]，在本研究中，NPFFR1過(guò)表達(dá)抑制了顆粒細(xì)胞AMH的濃度，佐證了NPFFR1作為GnIH受體對(duì)繁殖的抑制作用。FOS是細(xì)胞增殖凋亡的重要調(diào)節(jié)基因，在卵泡發(fā)育中，F(xiàn)SH、LH等促性腺激素都可快速而短暫的促進(jìn)卵泡顆粒細(xì)胞表達(dá)FOS，在排卵前起促進(jìn)前列腺素釋放的作用[36-37]。生物節(jié)律在大多數(shù)組織細(xì)胞中廣泛存在，F(xiàn)ahrenkrug等[38]首先在大鼠的卵巢上發(fā)現(xiàn)一個(gè)晝夜節(jié)律鐘，其核心鐘基因Per1和Per2在24 h內(nèi)有顯著的震蕩節(jié)律表達(dá)現(xiàn)象。Sellix[39]研究發(fā)現(xiàn)，卵巢的每一種細(xì)胞類(lèi)型，包括卵泡膜細(xì)胞、顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞，都有一個(gè)與卵泡生長(zhǎng)、類(lèi)固醇激素合成和排卵過(guò)程有關(guān)的分子鐘，使得卵泡發(fā)育有著明顯的時(shí)序性；Chen等[40]也證實(shí)，人卵巢的晝夜節(jié)律時(shí)鐘與類(lèi)固醇生成之間存在潛在的關(guān)系，睪酮影響顆粒細(xì)胞晝夜節(jié)律基因表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)NPFFR1顯著或極顯著(P<0.05或(P<0.01))上調(diào)了Clock和Per的表達(dá)。進(jìn)一步檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)NPFFR1使得凋亡熒光信號(hào)強(qiáng)度增強(qiáng)，細(xì)胞凋亡數(shù)量增加，而節(jié)律基因與細(xì)胞的增殖凋亡是密切相關(guān)的。Wang 等[41]給雄性大鼠睪丸內(nèi)注射不同劑量的RFRP3引起了大鼠的劑量依賴(lài)性組織學(xué)改變：附睪管等精子數(shù)量減少，變性增多，附睪上皮細(xì)胞空泡化，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自噬相關(guān)基因caspase-3、Bcl-2、Beclin-1和Atg5的表達(dá)。Anjum等[42-43]研究表明，RFRP3結(jié)合其受體顯著降低了睪丸細(xì)胞增殖和存活標(biāo)志物(如PCNA和Bcl2)水平，增加了凋亡標(biāo)志物如caspase3和PARP蛋白表達(dá)，抑制LHR和甾體生成酶、P450 scc和3β-HSD表達(dá)，抑制甾體的生成。NPFFR1上調(diào)了核心節(jié)律基因表達(dá)，并促進(jìn)了顆粒細(xì)胞的凋亡，由此推測(cè)，顆粒細(xì)胞NPFFR1與核心節(jié)律基因可能存在著功能上的互作，這種互作影響卵泡顆粒細(xì)胞的凋亡。

4 結(jié) 論

在等級(jí)前和等級(jí)顆粒細(xì)胞中過(guò)表達(dá)NPFFR1基因，分別顯著抑制了等級(jí)前和等級(jí)顆粒細(xì)胞內(nèi)AMH和E2分泌，促進(jìn)了顆粒細(xì)胞凋亡，調(diào)控了核心節(jié)律基因Clock和Per的轉(zhuǎn)錄水平，鑒于細(xì)胞凋亡、激素分泌與生物鐘節(jié)律基因間的分子與功能耦合，推測(cè)NPFFR1可能從激素、細(xì)胞凋亡和生物節(jié)律等多個(gè)環(huán)節(jié)影響卵泡顆粒細(xì)胞，參與調(diào)控卵泡的時(shí)序等級(jí)發(fā)育。