田小歡，劉 茹，孫 艷,任瑞敏，余 梅,3，趙書紅,3，曹建華,3*

(1. 華中農業(yè)大學 農業(yè)動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，武漢 430070； 2. 華中農業(yè)大學 農業(yè)農村部豬遺傳育種重點實驗室，武漢 430070； 3. 華中農業(yè)大學 生豬健康養(yǎng)殖協(xié)同創(chuàng)新中心，武漢 430070)

哺乳動物的基因轉錄主要由RNA聚合酶(RNA polymerase, RNA Pol)執(zhí)行，可分為Pol Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ 3類。雖然3種酶的結構具有相似性，都是高度保守的多亞基組成復合物，且都具有RNA合成功能，但它們識別不同的啟動子區(qū)域，并需要一系列啟動子特異結合的復合物協(xié)同作用才能啟動轉錄[1-2]。RNA Pol Ⅱ(RNAPⅡ或Pol2)作為哺乳動物細胞內最活躍、調節(jié)機制最復雜、研究最多的的一類RNA聚合酶，存在于核質中，是由12個亞基組成的分子量為550 ku的巨大復合物[3]，指導mRNA、snRNA、miRNA和1ncRNA等的合成[4]。RNAPⅡ大亞基的羧基末端(Rbp1)具有獨特的結構，由Y-S-P-T-S-P-S七肽重復序列組成，稱為羧基末端結構域，這段結構在物種間具有保守性。在高等真核生物中，七肽重復52次，絲氨酸2和絲氨酸5是激酶活性的靶點，并經(jīng)歷動態(tài)磷酸化循環(huán)。RNAPⅡ作為一個巨大的蛋白質復合物，由數(shù)十種蛋白質組成，通過各亞基的特異性作用以及基礎轉錄因子和輔因子的協(xié)調作用，在轉錄的起始、延伸和終止等過程中發(fā)揮作用，最近有研究證明，RNA聚合酶的亞基有可能也是轉錄調節(jié)因子的額外靶標[5-6]。聚合酶復合物系統(tǒng)協(xié)同發(fā)揮功能，有效地完成RNA的合成，其研究對于理解生命形式的生長、繁殖和進化至關重要。目前，針對RNAPII的商業(yè)化抗體多是多克隆抗體，批次之間存在較大差異，導致在進行免疫學相關試驗如ChIP-seq時，產生較高的假陽性信號，極大的影響了結果的準確性，因此亟待需要一種特異性強、結合速度快、無批次差異的單克隆抗體。

本試驗利用生物信息學方法針對豬RNAPII設計免疫原，將其化學合成后免疫小鼠，融合獲得雜交瘤細胞，進而提純得到單克隆抗體，從而為豬的生物學研究提供重要的試驗材料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 細胞及供試動物 豬肺泡巨噬細胞系3D4/21(ATCC，CRL-2843)、骨髓瘤細胞系SP2/0(ATCC，BFN60806599)、Bal b/c雌性4～8周齡小鼠(實驗動物中心)。

1.1.2 主要試劑 BCA法蛋白質濃度測定試劑盒(碧云天，貨號P0012)；RPMI1640培養(yǎng)基(Thermo Fisher Scientific，A1049101)；HRP標記的羊抗鼠IgG(Sigma，A9309)、弗氏完全佐劑(Sigma，F(xiàn)5881)、弗氏不完全佐劑(Sigma,F5506)、HAT 混合鹽(Sigma，H0262)；FITC 標記的羊抗鼠 IgG(Thermo Fisher，F(xiàn)2761)；無菌石蠟(環(huán)凱微生物，029110)；小鼠單克隆抗體 Ig 類/亞類/亞型鑒定用 ELISA 試劑盒(洛陽佰奧通實驗材料中心，C060101-L)；G DynaBeads(Life，10004D)；蛋白酶K(Ambion，AM2546)； NEBNext Ultra II DNA prep kit(NEB，E7645s)。

1.2 抗原多肽制備

豬RNAPII多肽序列來自NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫(XP_020923484.1)，全長為1 959個氨基酸。通過PredictProtein分析蛋白質的二級結構(https://predictprotein.org/)、TMHMM預測跨膜區(qū)(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)、SignalP分析信號肽(http://www.cbs. dtu.dk/services/SignalP/)以及用NCBI(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)對基因的特異性進行分析，同時采用ABCpred預測B細胞表位(https://webs.iiitd.edu.in/raghava/abcpred/)。綜合以上分析結果，選擇靠近C末端的氨基酸序列YSPTSPSYSPTSPS作為抗原進行化學合成，通過巰基偶聯(lián)到KLH(Keyhole Limpet Hemocyanin)上作為免疫原，通過巰基偶聯(lián)到BSA(Bovine Serum Albumin)上作為篩選原。

1.3 動物免疫及抗血清ELISA檢測

1.3.1 動物免疫 使用化學合成的抗原免疫5 只發(fā)育4～8周齡的雌性Bal b/C小鼠，1～6次免疫均采用腹部皮下分點注射，劑量為100 μg·只-1；沖擊免疫時采用尾靜脈注射，劑量為200 μg·只-1。POLR2A-KLH偶聯(lián)蛋白和佐劑以1∶1混勻(首免采用完全弗氏佐劑乳化，二免至六免采用不完全弗氏佐劑乳化)；操作時間：首免3周后進行第二次免疫，二免至六免，間隔均為2周，在六免之后第36天進行沖擊免疫，免疫原用生理鹽水混勻，劑量為200 μg·只-1。 在沖擊免疫3 d后進行采血，血清離心，4 000 r·min-1離心15 min，取上清。

1.3.2 抗血清ELISA檢測 包被POLR2A，用包被緩沖液稀釋至1 μg·mL-1，用1×PBS按照以下梯度稀釋免疫后小鼠血清：1∶1 000，1∶2 000，1∶4 000， 1∶8 000，1∶16 000，1∶32 000，1∶64 000，1∶128 000， 100 μL·孔-1按照稀釋倍數(shù)從小到大依次加入到酶標板中，同時設置陽性血清、未免疫血清陰性對照和PBS空白對照，進行ELISA檢測，計算陽性血清與陰性血清之比(positive/negative，P/N)，當P/N≥2.1時出現(xiàn)相近比值的最大稀釋倍數(shù)，為抗體效價。

1.4 細胞融合及篩選

選擇1只無菌制備且免疫達標的小鼠進行融合和篩選亞克隆[7]，篩選兩次亞克隆后，獲得穩(wěn)定分泌的雜交瘤細胞株。亞克隆細胞株以及建株細胞采用間接ELISA方法檢測：用包被緩沖液稀釋篩選原C-YSPTSPSYSPTSPS + BSA至1 μg·mL-1，用1×PBS緩沖液按照以下梯度進行稀釋1∶1 000，1∶2 000， 1∶4 000，1∶8 000，1∶16 000，1∶32 000，1∶64 000， 1∶128 000，100 μg·孔-1按照稀釋倍數(shù)從小到大依次加入反應孔中，同時設置好陽性(免疫后小鼠血清1∶1 000稀釋)和陰性對照孔(1%BSA)，進行ELISA檢測，用酶標儀測定波長為450 nm處的OD值。

1.5 單克隆抗體腹水的制備、純化和鑒定

1.5.1 單克隆抗體腹水制備 取4～8周齡的雌性Bal b/c小鼠，腹腔注射液體石蠟，然后將對數(shù)生長期的雜交瘤細胞用無血清培養(yǎng)基洗滌并懸起，計數(shù)5×105個·mL-1，懸浮的細胞腹腔注射。約7 d后待小鼠腹部有明顯隆起時開始收集腹水。取出的腹水于4 ℃ 4 000 r·min-1離心10 min。小心吸出中間的腹水收集于離心管中，-20 ℃保存。

1.5.2 單克隆抗體的純化及效價鑒定 采用Protein G親和層析法按說明書從腹水中純化抗體。并使用Bradford測定法測定濃度，通過SDS-PAGE驗證單抗純度，將純化后的抗體保存于-20 ℃，并通過間接ELISA方法檢測效價。

1.5.3 單克隆抗體的亞型鑒定 將獲得的單克隆抗體用小鼠單克隆抗體亞類鑒定試劑盒進行亞型鑒定，按試劑盒說明書操作。

1.6 Western blot進行特異性鑒定

將豬肺泡巨噬細胞3D4/21接種至6孔板上，生長至對數(shù)生長期時收集細胞，提取總蛋白。將總蛋白進行SDS-PAGE電泳，然后轉移到0.45 μm PVDF膜上，在室溫下用5%脫脂乳封閉2 h后，將膜與一抗(1∶1 000稀釋)在4 ℃下孵育過夜。用PBST洗滌3次后，將HRP偶聯(lián)的山羊抗鼠IgG加入膜中，在37 ℃下孵育1 h后，用PBST清洗膜，最后顯影曝光觀察結果。

1.7 ChIP-seq檢測抗體富集性

將 107個豬肺泡巨噬細胞3D4/21與1%甲醛在室溫下交聯(lián)10 min。通過細胞裂解獲得染色質，然后在冰上超聲處理(Sonics, VCX130)6 min。將10 μg ChIP級抗體與 100 μL蛋白G DynaBeads在4 ℃下孵育2 h。將染色質和抗體包被的磁珠在旋轉儀上于4 ℃共免疫沉淀過夜。通過蛋白酶K在55 ℃消化過夜，將ChIP DNA解交聯(lián)。根據(jù)說明書要求，通過使用NEBNextUltra II DNA文庫制備試劑盒，對ChIP DNA進行文庫制備。使用 Illumina HiSeq3000 平臺對ChIP-seq文庫進行高通量測序，使用雙端測序模式(2×150 bp)。

2 結 果

2.1 免疫血清效價檢測

采用上述動物免疫方法中涉及的步驟對5只雌性Bal b/c小鼠進行免疫，5次免疫之后采用ELISA方法檢測血清效價，由圖1可知，1～4號小鼠血清效價均可達到1∶128 000，第五只小鼠血清效價較低，低于1∶50 000，其效價結果與Control組類似。

2.2 細胞融合及陽性克隆篩選

對4號小鼠的細胞融合檢測結果進行分析，共構建10個細胞融合樣本，即1～10號，每個融合細胞樣本存在8個重復，即A-H，再從各個重復中挑選12個融合細胞株進行ELISA檢測，編號為1～12號，一共進行了960株細胞上清檢測。最終，挑選以下 40 株細胞上清(編號分別為1B3、1B5、1E9、1E12、2G1、2H1、2C10、2B11、2B12、3D1、3E5、3H5、3H6、4F2、4E5、4H8、4H9、5G3、5B5、5G7、6A1、6C7、6E9、6B12、7F3、7C4、7A7、7G11、8H4、8D5、8A7、8A8、9A2、9D3、9G4、9C6、10D1、10F2、10H10、10D12)進行Western blot(WB)檢測，結果如圖2所示，共挑選7系8株細胞，編號分別為2B11、3E5、4F2、7A7、8A8、9A2、10F2、10H10，8株細胞上清的WB檢測結果顯示，在250 ku位置處存在明顯條帶，然后根據(jù)WB檢測結果進行兩次或三次亞克隆，最后篩選陽性單克隆進行細胞定株。

采集5只小鼠(編號1～5)的血清進行ELISA檢測，結果以陽性/陰性比值(P/N)表示The sera of 5 mice (numbered 1-5) were collected for ELISA test, and the results were expressed as the positive/negative value (P/N)圖1 血清效價檢測Fig.1 Serum titer test graph

T.曝光時間；1～40.細胞融合上清編號：1B3、1B5、1E9、1E12、2G1、2H1、2C10、2B11、2B12、3D1、3E5、3H5、3H6、4F2、4E5、4H8、4H9、5G3、5B5、5G7、6A1、6C7、6E9、6B12、7F3、7C4、7A7、7G11、8H4、8D5、8A7、8A8、9A2、9D3、9G4、9C6、10D1、10F2、10H10、10D12。A. 1～26號融合上清的Western blot檢測結果；B. 27～40號融合上清的Western blot檢測結果；C. 陽性(AK151-M01、AK151-M04)和陰性抗體對照Western blot圖T. The exposure time; 1-40. Number of cell fusion supernatant: 1B3, 1B5, 1E9, 1E12, 2G1, 2H1, 2C10, 2B11, 2B12, 3D1, 3E5, 3H5, 3H6, 4F2, 4E5, 4H8, 4H9, 5G3, 5B5, 5G7, 6A1, 6C7, 6E9, 6B12, 7F3, 7C4, 7A7, 7G11, 8H4, 8D5, 8A7, 8A8, 9A2, 9D3, 9G4, 9C6, 10D1, 10F2, 10H10, 10D12. A．Western blot detection results of the fusion supernatant of 1-26; B. Western blot detection results of the fusion supernatant of 27-40;C. Western blot diagram of positive (AK151-M01, AK151-M04) and negative antibody control圖2 雜交瘤細胞融合的Western blot檢測結果Fig.2 Western blot test results of hybridoma cell fusion

根據(jù)一亞ELISA檢測結果，共挑選8 系16 株細胞上清(編號分別為2B11C11、2B11G11、3E5A4、3E5H5、4F2B8、4F2A6、7A7B2、7A7F6、8A8C7、8A8A12、9A2G1、9A2A3、10F2E11、10F2D12、10H10H3、10H10A6)進行WB檢測，結果如圖3所示，有5 系共5 株細胞與陽性血清特征一致，編號分別為2B11C11、3E5H5、4F2A6、7A7B2、8A8A12，WB檢測結果表明，在250 ku位置附近存在目標條帶。

T.曝光時間；1～16. 雜交瘤細胞亞克隆編號：2B11C11、2B11G11、3E5A4、3E5H5、4F2B8、4F2A6、7A7B2、7A7F6、8A8C7、8A8A12、9A2G1、9A2A3、10F2E11、10F2D12、10H10H3、10H10A6。A. 一亞上清的Western blot檢測結果；B. 陽性和陰性抗體對照Western blot圖T. The exposure time; 1-16. Number of hybridoma cell subclones: 2B11C11, 2B11G11, 3E5A4, 3E5H5, 4F2B8, 4F2A6, 7A7B2, 7A7F6, 8A8C7, 8A8A12, 9A2G1, 9A2A3, 10F2E11, 10F2D12, 10H10H3, 10H10A6. A. Western blot test result of a sub-supernatant; B. Western blot diagram of positive and negative antibody control圖3 雜交瘤細胞亞克隆的Western blot檢測結果Fig.3 Western blot test results of hybridoma cell subclones

對一亞克隆進行二亞篩選，根據(jù)ELISA檢測結果，挑選3 系10 株細胞(單克隆編號分別為3E5H5E1、3E5H5D2、3E5H5A3、3E5H5A4、4F2B8B2、4F2B8A3、4F2B8G4、4F2B8B9、8A8A12A4、8A8A12C6)進行建株，結果如圖4所示，最終篩選出建株細胞2 系8 株單克隆細胞，編號為3E5H5E1、3E5H5D2、3E5H5A3、3E5H5A4、4F2B8B2、4F2B8A3、4F2B8G4、4F2B8B9。其中，3E5H5E1、3E5H5D2、3E5H5A3、4F2B8B2、4F2B8A3、4F2B8G4、4F2B8B9在250 ku位置附近鑒定到明顯條帶，3E5H5A4有微弱條帶，但其相對于陰性血清來說，能夠判定為陽性。最終，8株單克隆細胞將用于后續(xù)試驗。

T. 曝光時間；1～10. 雜交瘤細胞建株編號：3E5H5E1、3E5H5D2、3E5H5A3、3E5H5A4、4F2B8B2、4F2B8A3、4F2B8G4、4F2B8B9、8A8A12A4、8A8A12C6。A. 建株上清的Western blot檢測結果；B. 陽性和陰性抗體對照Western blot圖T. The exposure time; 1-10. Number of established hybridoma cell lines:3E5H5E1, 3E5H5D2, 3E5H5A3, 3E5H5A4, 4F2B8B2, 4F2B8A3, 4F2B8G4, 4F2B8B9, 8A8A12A4, 8A8A12C6. A. Western blot test results of the supernatant of the established strain; B. Western blot diagram of positive and negative antibody control圖4 雜交瘤細胞建株的Western blot檢測結果Fig.4 Western blot test results of established hybridoma cell lines

在雜交瘤細胞建株之后，對篩選的雜交瘤細胞進行培養(yǎng)，結果如圖5所示，細胞活力較強，形態(tài)為圓形，達到試驗的要求，可進一步凍存?zhèn)溆谩?/p>

雜交瘤細胞呈高折射率圓形，說明細胞活力強。放大倍數(shù)為100×，視窗放大倍數(shù)為400×，標尺是100 μmHybridoma cells are round with high refractive index, indicating strong cell viability. The magnification is 100×, the window magnification is 400×, and the scale is 100 μm圖5 雜交瘤細胞的低密度圖Fig.5 Microscopic image of hybridoma cells

2.3 單克隆抗體腹水制備及效價檢測

制備分泌RNAPII單克隆抗體的雜交瘤細胞株3E5H5A3的小鼠腹水，通過Bradford測定法對抗體濃度進行檢測，結果為2.74 mg·mL-1。利用間接 ELISA 方法對提純后的單克隆抗體以及流穿模式下粗提抗體的效價進行檢測，即抗體和流穿。通過計算陽性血清與陰性血清的比值(Positive/Negative，P/N)，當P/N≥2.1時出現(xiàn)相近比值的最大稀釋倍數(shù)為抗體效價。結果如圖6所示，提純后的單克隆抗體及流穿模式下抗體的效價均能達到1∶128 000， 達到了抗體效價的要求。

圖6 豬RNAPⅡ單克隆抗體效價檢測結果Fig.6 Porcine RNAPⅡ monoclonal antibody titer test results

2.4 單克隆抗體亞類、特異性鑒定

利用小鼠單克隆抗體 Ig 類/亞類/亞型鑒定 ELISA 試劑盒對建株細胞的單克隆抗體進行亞類鑒定，抗體重鏈為IgG 2A型，輕鏈為Kappa型。

2.5 單克隆抗體在染色質免疫共沉淀(ChIP-seq)中的初步應用

2.5.1 制備的單克隆抗體與商業(yè)化抗體的相關性比較 本研究制備的豬RNAPⅡ單克隆抗體(JCLab)與某商業(yè)化單抗(Xcompany)在ChIP-seq試驗中具有高度相關性(r=0.89)，表明二者具有良好的一致性，結果如圖7所示。

圖7 本研究制備的單抗與商業(yè)化單抗的Pearson相關性Fig.7 Pearson correlation between the monoclonal antibody prepared in this study and the commercial monoclonal antibody

2.5.2 制備的單克隆抗體與商業(yè)化鼠源單抗比較 豬RNAPⅡ單克隆抗體ChIP-seq效果對比(chr2:6 400 000～6 900 000)。將本研究制造的豬源鼠單抗與某公司商業(yè)化鼠源單抗進行ChIP-seq試驗，由圖8可知，本抗體的ChIP-seq峰(JCLab)與對照組(Xcompany)之間二者具有高度一致性，說明本單克隆抗體具有良好的ChIP效果。

圖8 本研究制備的豬源鼠單克隆抗體與商業(yè)抗體的ChIP-seq富集IGV視圖Fig.8 Use the IGV view to show the ChIP-seq enrichment of monoclonal antibodies prepared in this study and commercial antibody

豬RNAPⅡ單克隆抗體ChIP富集效果(fingerprint)強于某商業(yè)化單抗。由圖9可知，試驗對照為基因組Input，結果顯示，兩種抗體對RNAP Ⅱ都有顯著富集。與某商業(yè)化單抗(Xcompany)相比，本研究制造的豬源鼠單抗(JCLab)在ChIP-seq試驗中，富集曲線更加陡峭且集中，表明其RNAPII富集效果強于前者。

圖9 本研究制備的豬源RNAPⅡ單克隆抗體與某商業(yè)化抗體的ChIP-seq富集效率圖Fig.9 ChIP-seq enrichment map of pig-derived mouse monoclonal antibody prepared in this study and commercial antibody

3 討 論

在多細胞生物中，基因的轉錄調控是生物體或細胞行使特定功能的重要途徑[8]。RNA聚合酶Ⅱ作為基因轉錄過程中的核心因子，以一種高度調控的方式合成RNA，在轉錄調控過程中發(fā)揮重要作用，RNA聚合酶Ⅱ復合物在所有的哺乳動物中是高度保守的，負責大多數(shù)基因產物的表達調控[9-11]。其中一種就是RNA聚合酶沿著DNA移動時存在停留現(xiàn)象，這種功能失調會導致基因表達水平過高或過低，進而產生疾病[12-13]。真核生物蛋白編碼基因的轉錄起始于啟動子DNA上的起始前復合物(pre-initiation-complex，PIC)的形成，包含RNAPⅡ和轉錄因子[14]。增強子通過RNA聚合酶Ⅱ介導的染色質成環(huán)與所調控基因的啟動子區(qū)域靠近，通過相互作用實現(xiàn)對基因的調控。為了探索啟動子與增強子相關的染色質相互作用，使用RNA聚合酶Ⅱ染色質相互作用與配對末端標簽(ChIA-PET，全稱)方法進行研究，捕捉到RNA聚合酶Ⅱ參與的相互作用[15]。目前的研究表明，真核生物RNA聚合酶Ⅱ在轉錄起始后的暫停中發(fā)揮著重要的作用，并作為一種廣泛的基因調控機制被研究[16]。RNA聚合酶Ⅱ暫停是轉錄過程中一般的調節(jié)步驟[17-19]。Zatreanu等[20]利用TFIIs的突變體對人類細胞的RNA Pol Ⅱ進行特異性誘導，進而使其暫停。結果表明，TFIIs突變表達導致延伸速率變慢，基因末端的聚合酶相對消耗增加、RNA Pol Ⅱ暫停水平提高，同時影響到mRNA的剪接和終止[20-21]。研究表明，RNA Pol Ⅱ穩(wěn)定性調控對于DNA損傷修復至關重要，RNA Pol Ⅱ自身在賴氨酸上的泛素化修復是DNA損傷反應中的重點，當DNA受到損傷時，轉錄的延伸將會受到限制[22-23]。Quintero-Cadena等[24]構建的數(shù)據(jù)驅動模型同時證明了RNA聚合酶Ⅱ長度的變化會導致轉錄、相分離發(fā)生紊亂，Abraham等[25]研究表明，核仁中的RNA聚合酶Ⅱ作為一種新的核糖體生物發(fā)生的主調節(jié)因子，對健康和疾病具有重要的影響。Kulaeva 等[26]研究表明，RNA聚合酶Ⅱ與轉錄因子、組蛋白修飾以及染色質構象的相互作用和真核生物的基因表達調控息息相關，以上研究表明了RNA聚合酶Ⅱ在真核生物的基因轉錄、生長發(fā)育以及疾病發(fā)生中承擔著重要的任務，是當代分子生物學研究的重要課題之一。而RNA聚合酶Ⅱ抗體作為試驗的基本材料在市場上一直存在批次間差異較大和富集性不強等問題，導致試驗結果差異較大，因此，亟待需要特異性強、效價高的RNA聚合酶Ⅱ單克隆抗體為研究提供基本的試驗材料，本研究完善了以往研究中RNA聚合酶Ⅱ抗體的缺點，得到重鏈217 ku，為IgG 2A型，輕鏈63 ku，為Kappa型的RNA聚合酶II單克隆抗體，將得到的單克隆抗體進行初步應用，并與商業(yè)化RNA聚合酶Ⅱ抗體的染色質免疫共沉淀試驗結果進行比較，富集性更強、特異性更好且無批次間的差異，可為染色質三維構象的解析提供試驗材料。

4 結 論

本研究獲得鼠源單克隆細胞株，并成功構建了豬RNA聚合酶Ⅱ單克隆抗體。將其初步應用染色質免疫共沉淀ChIP-seq試驗，將本研究抗體數(shù)據(jù)與某公司商業(yè)化抗體數(shù)據(jù)結果進行比較，獲得較為相似結果，但其效率獲得明顯提高。本研究所獲得的RNA聚合酶Ⅱ單克隆抗體容易標準化，在不同批次中存在的差異較小，特異性較強。本研究構建的單抗為研究轉錄過程中的延伸、暫停機制提供了重要的生物學材料。