吳琦

[關鍵詞] 三葉青黃酮;STAT3信號通路;膀胱癌;細胞增殖;細胞凋亡

[中圖分類號] R735.7? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2021）17-0025-04

Effect and mechanism research of cloverleaf flavonoids regulated STAT3 signaling pathway on proliferation and apoptosis of bladder cancer cells

WU Qi

Department of Urinary Surgery， the People's Hospital of Lishui City in Zhejiang Province， Lishui? ?323000， China

[Abstract] Objective To analyze the effect and mechanism of cloverleaf flavonoids regulated STAT3 signaling pathway on the proliferation and apoptosis of bladder cancer cells. Methods Bladder cancer T24 cells were divided into the control group，the low-dose group and the high-dose group，and treated with the blank medium，50 μg/mL cloverleaf flavonoids and 100 μg/mL cloverleaf flavonoids， respectively. Flow cytometry was used to detect the cell apoptosis， and MTT method was used to detect the apoptosis inhibition rates of T24 cells. The levels of Caspase-3， Caspase-9， Bax， Bcl-2， STAT3 and β-actin were detected by Western blot. Results The inhibitory rate of cell proliferation of bladder cancer cells in the high-dose group was significantly higher than that in the low-dose group， and the difference was statistically significant （P<0.05）. The apoptosis rates of bladder cancer cells in the control group， the low-dose group and the high-dose group were significantly different， and the apoptosis rate in the high-dose group was the highest， and the differences were statistically significant（P<0.05）. The expression levels of Caspase-3， Caspase-9， Bax， Bcl-2 and STAT3 were significantly different among all groups， and the expression levels of Caspase-3， Caspase-9 and Bax were the highest in the high-dose group， while the levels of Bcl-2 and STAT3 were the lowest， and the differences were statistically significant （P<0.05）. Conclusion Cloverleaf flavonoids regulate STAT3 signaling pathway to inhibit proliferation and promote apoptosis of bladder cancer cells.

[Key words] Cloverleaf flavonoids; STAT3 signaling pathway; Bladder cancer; Cell proliferation; Cell apoptosis

膀胱癌是現(xiàn)階段臨床中較為常見的尿路上皮系統(tǒng)惡性腫瘤，一般情況下患者術后極易復發(fā)，且多種藥物治療效果和預防方案均不理想，并具有一定的毒副作用[1]。三葉青（Lespedeza buergeri miq）具有祛風化痰、清熱解毒、活血止痛功效，臨床中多用于對肺炎、小兒高熱驚厥等癥狀進行治療，且現(xiàn)也多用于對各類腫瘤進行治療[2]。有學者采用三葉青對腫瘤患者進行治療，可有效延緩患者生命，抑制腫瘤生長，改善患者生命征象等[3]。雖然三葉青是臨床常用藥，但其藥理相關研究還有待進一步分析和完善[4]。大量研究結果顯示，生物類黃酮多具有明確的抗腫瘤效果，因而對三葉青的成分進行鑒定和分析具有十分重要的意義[5]。前期對三葉青成分分離和鑒定分析發(fā)現(xiàn)三葉青富含黃酮[6]，為進一步探討三葉青在膀胱癌中的應用效果，本研究利用三葉青黃酮對膀胱癌細胞進行干預，分析三葉青黃酮調控STAT3信號通路對膀胱癌細胞增殖、凋亡的影響及作用機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 三葉青黃酮制備

取1000 g三葉青塊根，利用堿性稀醇提取法提取三葉青黃酮7.6 g，后利用聚酰胺層析后分別利用不同濃度（10%、30%、50%、70%、95%）乙醇洗脫，真空干燥后稱重，分別標記HT10、HT30、HT50、HT70、HT95并合并樣品分別取2 mg，使用200 μLDMSO溶解，震蕩全部溶解后，加入1640培養(yǎng)基（800 μL）中，調整濃縮液濃度為20 mg/mL，置于4℃冰箱中保存。

1.2 細胞培養(yǎng)及分組

本研究所用人膀胱癌T24細胞購自上海細胞生物學研究所，T24細胞使用RPMI 1640完全培養(yǎng)基，置于37℃、CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，細胞達對數(shù)生長期后進行傳代培養(yǎng)，且將細胞分為空白組、低濃度組（50 μg/mL）、高濃度組（100 μg/mL）。

1.3 方法

將細胞依照分組分別使用空白培養(yǎng)基、50 μg/mL三葉青黃酮、100 μg/mL三葉青黃酮對各組細胞進行干預。干預48 h后收集各組細胞并調整細胞終濃度至1×106個/mL，吸取細胞加入Annexin V/FITC（上海前塵生物科技，40302ES20）5 μL和20 μg/mL碘化丙啶（艾美捷科技，4830-250-03）10 μL，室溫避光孵育15 min，加入400 μL磷酸鹽緩沖溶液，后使用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。將細胞懸液接種于96孔板，加入15 μL噻唑藍（蘇州海恒生物醫(yī)藥，298-93-1）溶液，孵育4 h后棄上清液，加入150 μL二甲基亞砜，震蕩10 min后使用562 nm波長進行檢測，測定光密度，計算各組三葉青黃酮對T24細胞的抑制率。干預48 h后收集各組細胞，加入RIPA裂解液（碧云天生物科技，P0013B）冰上處理5 min，后使用超聲勻漿提取總蛋白，使用10% SDS-PAGE電泳分離后并轉至PVDF膜，使用牛血清白蛋白（湖北麥凱斯精化科技，9048-46-8）封閉1 h，分別加入Caspase-3（CST，9662S）、Caspase-9（CST，9502S）、Bax（CST，14796S）、Bcl-2（CST，2807S）、STAT3（CST，9139S）、β-actin（CST，4970L）一抗抗體，4℃孵育過夜，TBST清洗3次后室溫孵育辣根過氧化物酶標記二抗1 h，TBST沖洗3次，后使用ECL試劑盒檢測顯影。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗;計數(shù)資料以[n（%）]表示，組間比較采用χ2檢驗，使用flowjo軟件分析流式細胞術檢測使用，采用ImageJ分析Western-blot檢測結果，以α=0.05作為檢驗標準。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 高劑量組和低劑量組細胞增殖抑制率情況比較

高劑量組的膀胱癌細胞細胞增殖抑制率為（73.28±14.61）%，明顯高于低劑量組的（23.52±8.08）%，差異有統(tǒng)計學意義（t=22.395，P<0.05）。

2.2 各組細胞凋亡率比較

對照組膀胱癌細胞凋亡率為（1.21±0.23）%、低劑量組為（11.35±0.94）%、高劑量組為（26.48±1.05）%，高劑量組中細胞凋亡率最高，差異有統(tǒng)計學意義（F=13.021，P<0.05）。

2.3 各組細胞蛋白表達水平比較

對照組、低劑量組、高劑量組膀胱癌細胞中Caspase-3、Caspase-9、Bax、Bcl-2、STAT3表達水平有明顯差異，其中高劑量組細胞Caspase-3、Caspase-9、Bax表達水平最高，Bcl-2、STAT3水平最低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表1、圖1。

3 討論

膀胱癌是發(fā)生在膀胱黏膜的泌尿系統(tǒng)常見惡性腫瘤，也是目前臨床中最為常見的惡性腫瘤之一[7]。有研究指出，膀胱癌的臨床發(fā)病率占我國泌尿生殖系腫瘤第1位[8]。任何年齡均可能發(fā)生膀胱癌，隨著年齡增長患者發(fā)病率也呈現(xiàn)增加趨勢，膀胱癌病理類型包括膀胱鱗狀細胞癌、膀胱尿路上皮癌、膀胱腺癌，還包括膀胱小細胞癌、膀胱透明細胞癌、膀胱類癌等罕見病理類型[9]。一般情況下，膀胱癌病因復雜，既有外在環(huán)境因素也有遺傳因素，職業(yè)接觸芳香胺、吸煙是明確的致病危險因素[10]。90%以上膀胱癌患者最為顯著的臨床表現(xiàn)是血尿，常表現(xiàn)間歇性、無痛性、肉眼全程血尿，有時也表現(xiàn)為鏡下血尿，血尿可僅出現(xiàn)1次或持續(xù)數(shù)天等，也可自行停止或減輕[11]?；颊哐蜃灾古c服藥等巧合的出現(xiàn)可能給患者造成病愈錯覺。目前臨床多采用手術或化療方案對膀胱癌患者進行治療，但其臨床療效仍有待進一步改善和提高[12]。

黃酮是三葉青中主要有效成分，不僅對炎癥有良好的治療效果，對腫瘤細胞具有一定的抑制作用[13]?，F(xiàn)研究多集中于三葉青黃酮對乳腺癌細胞、肝癌細胞、胃癌細胞的抑制作用，且研究顯示三葉青黃酮主要通過調控基質蛋白蛋白酶水平抑制腫瘤增殖，促進其凋亡[14]。但其對膀胱癌的作用活性仍有待進一步分析研究，因此本研究利用冷凝回流法對三葉青中黃酮進行提取，并通過檢測其生物學活性結果顯示，三葉青黃酮可有效抑制膀胱癌細胞增殖，誘導細胞凋亡。

Caspase-3和Caspase-9在細胞凋亡過程中扮演重要角色，也是關鍵的細胞凋亡執(zhí)行分子，細胞內多種凋亡信號均可激活體內Caspase-3和Caspase-9細胞凋亡功能[15]。檢測細胞中Caspase-3和Caspase-9可反映細胞中Caspase-3和Caspase-9影響活化水平，以了解并分析細胞凋亡狀態(tài)[16]。腫瘤細胞會合成并分泌大量免疫抑制分子，影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。STAT3是最為重要的STATs 家族成員，屬于核轉錄因子，參與調控細胞凋亡、增殖、分化等信號轉導通路，STAT3異?；罨瘯⑴c包括肺癌、膀胱癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，是最為常見的癌基因之一，阻斷STAT3可作為治療腫瘤的新靶點[17]。本研究結果顯示，使用高劑量三葉青黃酮對膀胱癌細胞干預后可有效增強膀胱癌細胞的增殖抑制率，并可有效提高腫瘤細胞凋亡率。進一步分析發(fā)現(xiàn)，使用三葉青黃酮對T24細胞干預后可有效提高Caspase-3、Caspase-9、Bax水平，有效降低Bcl-2和STAT3水平。分析認為，三葉青黃酮可有效調節(jié)并改善T24細胞中Caspase-3、Caspase-9、Bax并抑制Bcl-2和STAT3水平，三葉青黃酮可有效激活膀胱癌細胞凋亡通路，促進細胞凋亡，其可能與三葉青黃酮可調控和抑制STAT3表達，進而引起細胞凋亡信號通路出現(xiàn)級聯(lián)反應密切相關[18]。有學者指出，在膀胱癌患者病變組織中，Caspase-3和Caspase-9處于抑制狀態(tài)，STAT3處于高表達狀態(tài)[19]。通過本研究分析認為，三葉青黃酮干預后可有效提高腫瘤細胞中Caspase-3和Caspase-9水平并顯著抑制STAT3的表達，其可能與三葉青黃酮可激活體內細胞凋亡途徑而改變主要的凋亡標志蛋白水平，故在臨床中膀胱癌患者可采用三葉青黃酮輔助治療，有助于輔助提高常規(guī)化療的臨床療效，提高患者治療質量并改善患者預后質量。

綜上所述，三葉青黃酮調控STAT3信號通路抑制膀胱癌細胞增殖并促進其凋亡。但并未深入分析其基因水平改變及分子生物學機制，有待后續(xù)深入研究并分析。

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（收稿日期：2020-12-30）