文 敏，周 欣，趙 超，陳華國，龔小見*

1貴州師范大學(xué) 貴州省山地環(huán)境信息系統(tǒng)與生態(tài)環(huán)境保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2貴州師范大學(xué) 喀斯特山地生態(tài)環(huán)境保護(hù)與資源利用協(xié)同創(chuàng)新中心；3貴州師范大學(xué) 貴州省藥物質(zhì)量控制及評(píng)價(jià)技術(shù)工程實(shí)驗(yàn)室；4貴州師范大學(xué) 天然藥物質(zhì)量控制研究中心，貴陽 550001

滾山珠(PrionobelumqianensisChen)，為澤馬陸科(Zephroniidae)鋸刺馬陸屬(Prionobelum)黔鋸刺馬陸的干燥全蟲，體呈扁長圓柱形，棲息于山坡較潮濕處、枯枝腐葉或石塊下，主要分布于貴州、云南等地區(qū)。滾山珠為藥用全蟲，具有清熱、消腫止痛，舒筋活血等功效，主要用于治療筋脈拘攣、跌打損傷、骨折腫痛等病狀，在《中華本草-苗藥卷》《貴州苗族醫(yī)藥研究與開發(fā)》等書籍中均有記載[1,2]。在貴州苗族地區(qū)，用于炎癥的治療非常廣泛，對(duì)腫瘤的治療效果極其顯著。但是，目前國內(nèi)外關(guān)于滾山珠的相關(guān)基礎(chǔ)研究非常薄弱，更缺乏質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)體系，嚴(yán)重制約了滾山珠藥材的合理開發(fā)和廣泛利用[3,4]。

指紋圖譜是基于對(duì)物質(zhì)群整體作用的認(rèn)識(shí)，借助于波譜或色譜等技術(shù)獲得的中藥化學(xué)成分的波譜或色譜圖，是實(shí)現(xiàn)鑒別產(chǎn)品真實(shí)性、評(píng)價(jià)質(zhì)量一致性和產(chǎn)品穩(wěn)定性的可靠手段[5,6,7]。因此，本研究采用HPLC法建立了滾山珠指紋圖譜，并進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，通過聚類分析[8,9](cluster analysis，CA)、主成分分析[10,11](principal component analysis，PCA)及正交偏最小二乘-判別分析[12,13](orthogonal partial least squares analysis，OPLS-DA)等化學(xué)模式識(shí)別方法，篩選出引起不同批次滾山珠成分差異的主要標(biāo)志性成分，旨在為苗藥滾山珠的質(zhì)量控制及進(jìn)一步研究提供參考[14,15]。

1 儀器與材料

1.1 儀器

DIONEX Ultimate300 高相液相色譜儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)；KQ-300DE 型數(shù)控超聲波清洗器(昆明市超聲儀器有限公司)；明澈TM-D24UV純水/超純水系統(tǒng)(法國Millipore公司)；XS-105DU 十萬分之一和AL204萬分之一電子分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)。

1.2 材料

酪氨酸對(duì)照品(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：140609-201513)；甲醇、乙腈(購于美國TEDIA公司)均為色譜純；食用酒精(購于貴州凱鑫工貿(mào)有限公司)為食品級(jí)；水為超純水；其余試劑均為分析純。滾山珠藥材自采于貴州省各地區(qū)或購于安徽、四川、廣西、云南、海南等地，經(jīng)貴州省生物研究所陳會(huì)明副研究員鑒定為澤馬陸科動(dòng)物黔鋸刺馬陸的全體Prionobelumqianensis的干燥全蟲。具體信息見表1。

表1 24批藥材來源信息Table 1 Source information of 24 batches of medicinal materials

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備

取滾山珠藥材粉末(過60目篩)1.0 g，精密稱定，加70%食用酒精15 mL，超聲提取30 min，過濾，濾液濃縮蒸干，用甲醇定容至10 mL，過0.45 μm微孔濾膜，并置于4 ℃冰箱冷藏備用。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

取酪氨酸對(duì)照品適量，精密稱定，加水制成濃度為27.1 μg/mL的對(duì)照品溶液，并置于4 ℃冰箱冷藏備用。

2.3 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱(250×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇(A)-0.1%乙酸水(B)，梯度洗脫(0～15 min，1%→2% A；15～25 min，2%→8% A；25～30 min，8%→14% A；30～35 min，14%→25% A；35～47 min，25%→65% A；47～70 min，65%→85% A)；檢測波長：254 nm；流速：0.8 mL/min；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：2 μL。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度實(shí)驗(yàn)

精密吸取滾山珠供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，以4號(hào)酪氨酸色譜峰為參照峰(S)，計(jì)算得到各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD<0.32%，相對(duì)峰面積的RSD<1.16%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取滾山珠供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件，分別在0、4、8、16、24、36 h進(jìn)樣測定，以4號(hào)酪氨酸色譜峰為參照峰(S)，計(jì)算得到各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD<0.43%，相對(duì)峰面積的RSD<1.31%，表明供試品溶液在36 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批滾山珠樣品6份，每份1.0 g，精密稱定，按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以4號(hào)酪氨酸色譜峰為參照峰(S)，計(jì)算得到各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD<0.52%，相對(duì)峰面積的RSD<1.56%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5 指紋圖譜建立

分別取24批滾山珠各1.0 g，按“2.1”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄各色譜圖。采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)”對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以S1號(hào)樣品的色譜圖為參照?qǐng)D譜，時(shí)間窗寬度為0.1 min中位數(shù)法生成對(duì)照?qǐng)D譜R，經(jīng)多點(diǎn)校正后進(jìn)行色譜峰匹配，建立24批樣品的疊加圖譜及對(duì)照?qǐng)D譜，標(biāo)定22個(gè)共有峰，經(jīng)與對(duì)照品比對(duì)，確定4號(hào)色譜峰為酪氨酸(見圖1～3)。指紋圖譜的共有峰保留時(shí)間及峰面積見表2。

圖1 24批藥材的HPLC疊加指紋圖譜Fig.1 HPLC superposed fingerprints of 24 batches of medicinal materials

圖2 藥材HPLC對(duì)照指紋圖譜Fig.2 HPLC control fingerprints of medicinal materials

圖3 酪氨酸對(duì)照品溶液的HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of tyrosine reference

2.6 相似度評(píng)價(jià)

相似度評(píng)價(jià)采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)”對(duì)24批滾山珠的HPLC指紋圖譜進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，結(jié)果見表3。24批滾山珠指紋圖譜的相似度除花溪S8在0.739以外，其余均在0.844～0.957之間，表明24批樣品間差異較小。

2.7 聚類分析

運(yùn)用SPSS.26軟件，采用組間聯(lián)結(jié)法，以平方歐式距離為測度對(duì)24批滾山珠樣品進(jìn)行聚類分析(見圖4)。24批樣品聚為3類：第一類是S1、S3、S4、S5、S15、S16、S19、S20，它們來自2020年于貴州省以外的各省采購的樣品；第二類是S8，它是來自2018年采集于貴州省花溪區(qū)；第三類是S2、S6～S7、S9～S14、S17～S18、S21～S24，它們除S9、S24以外都是來自2015～2016年間在貴州省內(nèi)各地采集的。聚類分析結(jié)果表明各批次總體差異性較小，其差異性表現(xiàn)出明顯的地域差異性，可能與其生長環(huán)境、生長年限和氣候條件等有關(guān)，但具體原因有待進(jìn)一步研究。

圖4 24批藥材樣品的聚類分析Fig.4 Cluster analysis of 24 batches of medicinal materials

2.8 主成分分析

以共有峰的相對(duì)峰面積為變量，利用SPSS26軟件對(duì)24批樣品進(jìn)行主成分分析，計(jì)算相關(guān)矩陣的特征值及其方差貢獻(xiàn)率[11]。以特征值>1為提取標(biāo)準(zhǔn)，得到了前5個(gè)主成分的累積方差貢獻(xiàn)率為89.063%，能夠較好的代表指紋圖譜中的大部分信息，結(jié)果見表4。從成分載荷矩陣表可以看出，第一主成分的獨(dú)立方差貢獻(xiàn)率為43.640%，主要反映色譜峰1～5、8、11、12、13、17、18、20、21的信息；第二主成分的獨(dú)立方差貢獻(xiàn)率為20.679%，主要反映色譜峰6、7、9、10、14～16的信息；第三主成分的獨(dú)立方差貢獻(xiàn)率為10.762%，主要反映色譜峰4、6、19的信息；第四主成分的獨(dú)立方差貢獻(xiàn)率為9.235%，主要反映色譜峰22的信息；第五主成分的獨(dú)立方差貢獻(xiàn)率為4.748%，主要反映色譜峰1的信息。

表4 24批藥材主成分特征值及方差貢獻(xiàn)率Table 4 Characteristic value and variance contribution rate of 24 batches of medicinal materials

利用SIMCA 14.1軟件計(jì)算主成分得分(見圖5)。結(jié)果表明24批藥材可大致分為三類，S1、S3、S4、S5、S15、S16、S19、S20為第一類；S8為第二類；S2、S6、S7、S9～S14、S17、S18、S21～S24為第三類，其結(jié)果與聚類分析結(jié)果一致。

圖5 24批藥材主成分分析得分Fig.5 Score of principal component analysis of 24 batches of medicinal materials

2.9 正交偏最小二乘判別分析

采用SIMCA 14.1軟件對(duì)各樣品共有峰峰面積進(jìn)行正交偏最小二乘判別分析，結(jié)果見圖6。不同批次樣品可聚為3類，與聚類分析和主成分分析結(jié)果一致。提取模型中的22個(gè)變量的VIP值(見圖7)，變量重要性投影值(VIP)是篩選差異性化合物的重要指標(biāo)，VIP值越高，對(duì)組間差異的影響越大[16]。以VIP>1為閾值，色譜峰從大到小分別為17號(hào)峰(VIP=3.155 9)、2號(hào)峰(VIP=1.459 1)、1號(hào)峰(VIP=1.437 8)、12號(hào)峰(VIP=1.032 5)、11號(hào)峰(VIP=1.020 7)，表明這5個(gè)色譜峰是影響滾山珠藥材間質(zhì)量差異的主要標(biāo)志性成分，在之后的研究中應(yīng)多關(guān)注這幾個(gè)成分。

圖6 24批藥材正交偏最小二乘判別分析得分Fig.6 Score of orthogonal partial least squares discriminant analysis for 24 batches of medicinal materials

圖7 藥材的正交偏最小二乘判別分析VIP值Fig.7 VIP value of orthogonal partial least squares discriminant analysis

3 討論

3.1 色譜條件優(yōu)化

試驗(yàn)前期考察了甲醇、乙腈洗脫系統(tǒng)對(duì)色譜峰分離效果的影響，結(jié)果顯示甲醇為流動(dòng)相時(shí)分離效果較好，且基線平穩(wěn)；考察了甲醇-0.1%甲酸水和甲醇-0.1%乙酸水的分離效果，最終選擇分離效果較好的甲醇-0.1%乙酸水系統(tǒng)；分析了210～400 nm處全波長掃描的圖譜，顯示在254 nm下出峰數(shù)量多，基線平穩(wěn)，信號(hào)響應(yīng)值大；通過考察不同流速(0.8、1.0、1.2 mL/min)、柱溫(25、30、35、40 ℃)對(duì)色譜峰的影響，確定選擇流速為0.8 mL/min，柱溫25 ℃。

3.2 供試品溶液制備方法優(yōu)化

試驗(yàn)前期考察了超聲和回流2種提取方式，發(fā)現(xiàn)其提取效率無明顯差別，故選擇操作較簡單的超聲提??；比較了水、甲醇、食用酒精作為提取溶劑，結(jié)果顯示，食用酒精提取時(shí)色譜峰數(shù)目多、響應(yīng)值較大。并比較不同濃度食用酒精(30%、50%、70%、90%)的提取效果，結(jié)果表明，70%食用酒精提取時(shí)色譜峰響應(yīng)值較大。綜合考慮，選用70%食用酒精超聲提取作為供試品溶液的制備方法。

3.3 小結(jié)

本研究首次建立了苗藥滾山珠的指紋圖譜，24批樣品指紋圖譜的相似度在0.739～0.957，指認(rèn)了1個(gè)成分。通過化學(xué)模式識(shí)別分析，建立了滾山珠的聚類分析、主成分分析和正交偏最小二乘判別分析的分類模型，明確了樣品之間的歸類情況。24批樣品聚為3類，篩選得到影響滾山珠藥材間質(zhì)量差異的5個(gè)主要標(biāo)志性成分。

綜上所述，本研究建立的HPLC指紋圖譜方法穩(wěn)定、可靠、重復(fù)性好，可為苗藥滾山珠藥材的質(zhì)量控制提供參考。