唐雅楠，韓喜桃，劉子琴，杜 紅

北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 102488

糖蛋白是指由寡糖與多肽鏈共價(jià)連接而成的一類結(jié)合蛋白質(zhì)[1]，廣泛存在于植物、動(dòng)物和微生物中[2]。近年來對糖蛋白的研究日益增多，許多研究發(fā)現(xiàn)它具有顯著的藥用功效和保健功能，如免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗疲勞、抗腫瘤等[3]，吸引著包括化學(xué)、生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、食品科學(xué)等眾多學(xué)科在內(nèi)的工作者從事這一領(lǐng)域的研究。這也引起了中醫(yī)藥領(lǐng)域?qū)W者們的關(guān)注，許多學(xué)者對部分中藥材進(jìn)行了相關(guān)研究，如黃芪[4]、枸杞[5]、土鱉蟲[6]等，并取得了一定成果。本文就近年來對中藥糖蛋白的研究作一概述，以期為中藥材物質(zhì)基礎(chǔ)的研究及糖蛋白類藥物的研發(fā)提供參考。

1 糖蛋白提取

糖蛋白兼具多糖和蛋白質(zhì)的某些性質(zhì)，大多數(shù)可溶于水、稀鹽、稀酸和稀堿等溶液，因此，目前用于中藥糖蛋白提取的方法主要有水提、稀鹽溶液和緩沖溶液浸提、酸堿溶液提取以及酶解法[7,8]等。在進(jìn)行提取工藝優(yōu)化時(shí)，常以蛋白質(zhì)提取率或糖提取率為指標(biāo)，也有研究將所得糖蛋白干燥后，以重量法計(jì)算所得粗糖蛋白得率為指標(biāo)。具體見表1。

表1 糖蛋白提取方法Table 1 Methods for glycoprotein extraction

1.1 水浸提法

由于糖蛋白中糖鏈的多羥基結(jié)構(gòu)，大多數(shù)糖蛋白具有高度親水性，因此水提法是糖蛋白提取的常用方法之一。水提法較其他方法更為經(jīng)濟(jì)，且工藝簡單，但提取過程中常產(chǎn)生較多水溶性雜質(zhì)，降低提取率。水提法在進(jìn)行工藝優(yōu)化時(shí)，通?？疾焯崛r(shí)間、提取溫度、提取次數(shù)和料液比。

1.2 鹽溶液浸提法

由于鹽離子能與糖蛋白的蛋白質(zhì)部分結(jié)合，使其不易變性，稀鹽和緩沖溶液浸提法是糖蛋白提取最常用的方法[27]。應(yīng)用該方法進(jìn)行提取，提取率高，且所得糖蛋白完整性和生物活性都較高，但后續(xù)需進(jìn)行脫鹽處理[7]。Deng等[9]在進(jìn)行霍山石斛糖蛋白提取時(shí)，通過SDS-PAGE條帶染色分析，發(fā)現(xiàn)NaCl溶液浸提法獲得的糖蛋白譜帶在濃度、數(shù)量和分子量范圍上都顯著高于水提法。Li[28]從黃芪中提取糖蛋白時(shí)，通過測定蛋白質(zhì)和糖的得率及SDS-PAGE膠圖分析對包括Tris-HCl緩沖液提取、水提、醇提和堿提酸沉在內(nèi)的4種提取方法進(jìn)行比較，結(jié)果以Tris-HCl緩沖液提取法提取率最高。稀鹽溶液浸提法通常需要考察鹽濃度、提取時(shí)間、提取溫度、提取次數(shù)和料液比，緩沖液提取還要考察pH。

1.3 酸堿提取法

糖蛋白中的蛋白質(zhì)是具有等電點(diǎn)的兩性電解質(zhì)，提取溶劑的pH應(yīng)偏離等電點(diǎn)，一般堿性蛋白質(zhì)用偏酸性溶液提取，酸性蛋白質(zhì)則用偏堿性溶液[27]。用酸堿提取法提取糖蛋白時(shí)，要注意提取溶劑不能過酸、過堿，以避免糖蛋白發(fā)生不可逆變化導(dǎo)致活性喪失。

1.4 乙醇浸提

采用乙醇浸提法可以提取到部分不溶于水但可溶于乙醇的糖蛋白。Li等[29]采用50%乙醇對山茱萸進(jìn)行提取時(shí)，能夠得到對α-葡萄糖苷酶活性抑制率最高糖蛋白。Lee等[30,31]對龍葵、梔子糖蛋白進(jìn)行研究時(shí)，均采用醇提法進(jìn)行提取，將藥材用95%或99%乙醇于黑暗中浸泡3～4個(gè)月后，經(jīng)硫酸銨沉淀、柱色譜洗脫、透析等分離純化得到糖蛋白純品。但醇提法耗時(shí)久、溶劑耗用量大，生產(chǎn)成本較高，一般應(yīng)用較少。

1.5 酶解法

酶解法能使不溶性糖蛋白分解為可溶性糖肽、游離肽或氨基酸，提高提取效率，并且由于酶的專一性和選擇性，能夠排除部分雜質(zhì)，提高得率。應(yīng)用酶解法提取糖蛋白時(shí)，要綜合考慮酶的種類、用量、酶解時(shí)間和溫度等，但目前酶解法在中藥糖蛋白提取中應(yīng)用較少，酶解條件和酶的種類都還需要進(jìn)一步探討。

1.6 其他設(shè)備輔助提取

為提高效率，在提取糖蛋白時(shí)也會(huì)使用輔助設(shè)備，其中比較常用的是超聲波或微波輔助提取法，這兩種技術(shù)均能夠使原料的細(xì)胞壁易于破碎，有利于糖蛋白的溶出，從而達(dá)到縮短時(shí)間、增加得率的效果。Wang等[10]在進(jìn)行覆盆子糖蛋白提取時(shí)，對水浸提及超聲提取進(jìn)行了比較，超聲提取法可將糖蛋白得率由7.526%提升至10.259%，并將提取時(shí)間由4 h縮短至20 min。Wang[32]應(yīng)用NaCl溶液浸提和超聲提取法提取丹參糖蛋白，發(fā)現(xiàn)超聲提取可提高糖蛋白得率、縮短提取時(shí)間并降低溶劑鹽濃度。Chen等[11]在提取蒲公英糖蛋白時(shí)，對稀鹽溶液浸提及超聲提取進(jìn)行了比較，超聲提取雖然將提取時(shí)間由3 h縮短至15 min，但得率由0.44%下降為0.26%，考慮到該研究提取液未經(jīng)除雜處理，得率下降可能是其他成分溶出增加導(dǎo)致。超聲波或微波輔助提取法除考察料液比、提取溫度、提取時(shí)間和提取次數(shù)外，還需要考察頻率及功率。

目前糖蛋白提取最常用且較為成熟的提取方法為Tris-HCl緩沖液提取，該方法較水提法提取率高，較稀鹽溶液或其他緩沖液提取所需溫度低、時(shí)間短，但將Tris-HCl緩沖液提取與設(shè)備輔助提取相結(jié)合進(jìn)行工藝優(yōu)化的研究較少。此外，超高壓技術(shù)(ultrahigh pressure processing，UHPP)是一種近幾年發(fā)展起來的新型提取技術(shù)，研究[33]表明該提取法由于壓力較高，極大地加快了溶劑浸潤和溶質(zhì)擴(kuò)散過程，能夠縮短提取時(shí)間、提高提取率并減少雜質(zhì)含量，且耗能低，適用于大生產(chǎn)。但超高壓容易影響蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的立體結(jié)構(gòu)，使其變性或失活，目前該方法在中藥糖蛋白提取中應(yīng)用較少[34]，其是否適用于糖蛋白提取、在何種壓力條件下能夠提高提取效率并保證糖蛋白完整性，還要進(jìn)一步探討。

2 糖蛋白分離純化

糖蛋白的分離純化是指除去雜質(zhì)獲得單一糖蛋白組分的過程，一般流程為先除去提取物中的大量游離蛋白、多糖和小分子雜質(zhì)，再進(jìn)一步分離純化。

2.1 初步純化

初步純化階段要將提取液中的非糖蛋白組分除去，一般是先除去游離蛋白質(zhì)，再除去其他小分子雜質(zhì)，最后得到粗糖蛋白。脫蛋白常用的方法為Sevage試劑法，由于樣品蛋白質(zhì)含量不同，具體次數(shù)和比例需通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證[24]。對于粗糖蛋白中其他小分子雜質(zhì)，一般通過透析法除去[35-37]，也有學(xué)者采用超濾法對糖蛋白進(jìn)行初步純化[38]。除去雜質(zhì)后，常需采用硫酸銨或醇沉的方法，將糖蛋白從提取液中分離出來，對于應(yīng)用堿性溶液提取的糖蛋白，也可以采用堿提酸沉法[39]。

2.2 分級(jí)純化

分級(jí)純化是將粗糖蛋白中的單一組分分離。最常用的方法是陰離子交換柱層析、凝膠柱層析法。陰離子交換柱層析以二乙基氨基乙纖維素(diehlaminoethy)應(yīng)用最為廣泛，適用于分離各種酸性、中性或堿性的糖蛋白；凝膠柱層析由于價(jià)格昂貴，一般在用其他柱層析法處理后再使用。此外還有親和柱層析法、超離心法、區(qū)帶電泳法等。具體方法見表2。

表2 糖蛋白的分離純化Table 2 Separation and purification of glycoprotein

續(xù)表2(Continued Tab.2)

糖蛋白的分離純化技術(shù)已趨于成熟，多采用硫酸銨或乙醇沉淀、Sevage試劑除去游離蛋白、透析除鹽進(jìn)行初步純化，再通過陰離子交換柱層析、凝膠柱層析法、親和柱層析法等進(jìn)行分級(jí)純化。初步純化階段硫酸銨、Sevage試劑的用量及Sevage試劑中正丁醇、氯仿的比例，需要根據(jù)樣品進(jìn)行考察；而分級(jí)純化則需要對洗脫液進(jìn)行追蹤檢測?？傮w而言，目前糖蛋白的分離純化過程還較為復(fù)雜繁瑣，無法適用于大生產(chǎn)，對中藥糖蛋白的進(jìn)一步開發(fā)及應(yīng)用，如新型藥物的研發(fā)、保健食品的開發(fā)等有所限制。

3 糖蛋白結(jié)構(gòu)和組成分析

3.1 糖蛋白的純度鑒定

分離純化得到的糖蛋白在進(jìn)一步分析前需要進(jìn)行純度鑒定，高純度的糖蛋白是結(jié)構(gòu)鑒定的基礎(chǔ)。一般而言，糖蛋白的純度需要兩種以上的方法進(jìn)行驗(yàn)證，常用方法有凝膠層析法、親和層析法、毛細(xì)管電泳法、薄層色譜法和高效液相色譜法，若結(jié)果得到單一對稱的洗脫峰，或顯色位置相同，則證明糖蛋白是均一組分。如Zhang等[42]通過毛細(xì)管區(qū)帶電泳法、聚丙烯酰胺凝膠法、高壓柱層析法等對人參糖蛋白進(jìn)行純度鑒定，所得結(jié)果均顯示單一對稱峰或染色帶位置相同，表明經(jīng)分離純化后得到的人參糖蛋白為均一組分。此外，Shi等[43]采用尺寸排阻色譜-多角度激光光散射聯(lián)用儀(SEC-MALLS)對鎖陽糖蛋白組分CSG-1進(jìn)行分析，所得色譜圖呈對稱峰，表明CSG-1是均一組分。SEC-MALLS法對任何相對分子質(zhì)量(Mr)范圍的高分子化合物，都可獲得樣品洗脫圖中每一級(jí)分點(diǎn)的濃度和Mr，無需對照品即可得到準(zhǔn)確的樣品Mr及其分布[44]，非常適合進(jìn)行聚合物分子量及其分布的測定，但目前在糖蛋白鑒定中應(yīng)用較少。

3.2 糖蛋白糖肽鍵連接類型鑒別

糖肽鍵是糖鏈和肽鏈的連接鍵。N-型糖肽鍵和O-型糖肽鍵，前者對堿穩(wěn)定，后者可在NaOH作用下發(fā)生β-消除反應(yīng)，使糖肽鏈上的絲氨酸、蘇氨酸分別轉(zhuǎn)化為在240 nm處產(chǎn)生明顯紫外吸收的α-氨基丙烯酸和α-氨基丁烯酸?；诖?，研究人員[45,46]一般取糖蛋白樣品溶于氫氧化鈉溶液中反應(yīng)，以溶于水的樣品為對照，比較240 nm處的紫外吸收峰，對糖蛋白的糖肽鍵類型進(jìn)行初步判斷。

3.3 糖蛋白糖鏈的結(jié)構(gòu)分析

對于糖鏈結(jié)構(gòu)的分析方法多樣，如凝集素法、高碘酸氧化、Smith降解、甲基化反應(yīng)、紅外光譜法、核磁共振等[2]。Zhao等[22]采用凝集素微陣列技術(shù)，以熒光強(qiáng)度為標(biāo)準(zhǔn)篩選出與生姜糖蛋白特異性結(jié)合的5種凝集素：VVA、ConA、STL、LCA 及 LEL，由此推測出生姜糖蛋白可能存在GlaNAc、mannose、GlcNAc、mannose和LacNAC等糖鏈結(jié)構(gòu)。Sun等[35]通過紅外光譜分析、Smith降解和高碘酸氧化推測，升麻糖蛋白組分CF-Ⅰ的糖鏈結(jié)構(gòu)為α-吡喃型糖苷鍵，主要以1→4、1→6糖苷鍵連接而成。Du[47]對從薏苡仁糖蛋白組分TDBP-a、b進(jìn)行紅外光譜分析，結(jié)果顯示二者均含有吡喃環(huán)。

3.4 單糖及氨基酸的組成分析

在對糖蛋白中單糖組成進(jìn)行分析時(shí)，最常采用的方法是將糖蛋白衍生化處理或水解后，使用氣相色譜法進(jìn)行分析，如Li等[48]對黃芪糖蛋白進(jìn)行糖腈乙酸酯衍生物法處理后，進(jìn)行氣相色譜分析；Wang[49]對蘭州百合糖蛋白進(jìn)行三氟乙酸水解、糖腈乙酸酯衍生化處理后采用 GC-MS分析；此外，紙層析法[32]、薄層色譜法[42]、高效液相色譜法[50]等也常常使用。對氨基酸組成的分析，一般選擇酸水解后使用氨基酸自動(dòng)分析儀進(jìn)行分析[32,42]，也有學(xué)者采用高效液相色譜法[49,50]。

目前糖蛋白在結(jié)構(gòu)方面的探索還不夠深入，主要集中于對多糖與氨基酸組成及含量的分析、糖鏈及糖肽鏈的初步判斷上。而糖蛋白作為寡糖與多肽鏈共價(jià)相連的結(jié)合蛋白，其單糖與氨基酸的組成、含量及排列順序，糖鏈、肽鏈及糖肽鏈的結(jié)構(gòu)都可能影響糖蛋白的藥理活性，因此對糖蛋白結(jié)構(gòu)的探索還有待進(jìn)一步深入。

4 中藥糖蛋白的藥理作用

研究發(fā)現(xiàn)從中藥材中提取得到的糖蛋白具有一種或多種藥理活性，主要包括免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗腫瘤等，具體見表3。

表3 中藥糖蛋白的藥理作用Table 3 Pharmacological actions of glycoprotein from Chinese materia medica

4.1 免疫調(diào)節(jié)作用

肉桂糖蛋白[51]能夠增強(qiáng)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)活性，對B細(xì)胞產(chǎn)生免疫球蛋白(Ig)和單核細(xì)胞產(chǎn)生白細(xì)胞介素(IL-1)有促進(jìn)作用；山藥[52]及丹參[53]糖蛋白均能明顯增強(qiáng)小鼠免疫器官胸腺器官指數(shù)及巨噬細(xì)胞吞噬功能，促進(jìn)T細(xì)胞的增殖、分化及體液免疫中抗體的生成，這表明以上三者對非特異性免疫、體液免疫和細(xì)胞免疫作用均有增強(qiáng)作用，其中山藥糖蛋白可能是通過調(diào)節(jié)MAPK和NF-κB信號(hào)通路來發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的；蘭州百合糖蛋白[49]能夠明顯促進(jìn)RAW 264.7細(xì)胞的增殖、釋放NO及分泌TNF-α的能力，且呈現(xiàn)一定的濃度依賴性，表明蘭州百合糖蛋白能促進(jìn) RAW 264.7細(xì)胞的大量增殖，并激活其免疫功能。

此外，許多學(xué)者發(fā)現(xiàn)黃芪糖蛋白具有免疫抑制作用。Yang等[54]發(fā)現(xiàn)黃芪糖蛋白在T細(xì)胞增殖早期對其有抑制作用，在高濃度(10 μg/mL)下能顯著抑制雙向混合淋巴反應(yīng)，該反應(yīng)相當(dāng)于體外的同種異體排斥反應(yīng)，說明黃芪糖蛋白能夠抑制排異反應(yīng)。Zhao[55-57]、Zhang[58,59]、Xing[60]、Zhang[61]等學(xué)者發(fā)現(xiàn)黃芪糖蛋白對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠的關(guān)節(jié)炎癥及實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)小鼠的臨床癥狀有緩解作用，研究發(fā)現(xiàn)黃芪糖蛋白能夠通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)因子Fas、FasL、Bax、Bcl-2的表達(dá)水平誘導(dǎo)脾細(xì)胞凋亡，上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子Foxp3的表達(dá)，顯著降低外周血中 CD3+CD28+、CD3+CD278+細(xì)胞的比例，抑制促炎趨化因子CCL2和CCL5的表達(dá)，減少炎性因子的釋放，且實(shí)驗(yàn)顯示黃芪糖蛋白在抑制其他炎性因子如TNF-α、IL-2的同時(shí)能夠提高IFN-γ的分泌，表明黃芪糖蛋白在發(fā)揮免疫抑制作用的同時(shí)能夠在一定程度上避免其他感染，表現(xiàn)出雙向調(diào)節(jié)的優(yōu)勢，為代替目前常用但毒副作用較大的免疫抑制劑如硫唑嘌呤、環(huán)磷酰胺等[62]提供了可能。

4.2 降血糖作用

α-糖苷酶抑制劑是治療2型糖尿病的常用藥物之一，其通過與α-糖苷酶的競爭性抑制，延緩寡糖、淀粉等的分解，減緩葡萄糖吸收速度，達(dá)到降糖目的[63]，其不良反應(yīng)相對較小，但目前臨床應(yīng)用較多的藥物如阿卡波糖等，也存在用藥后可能出現(xiàn)腸胃不適、腹脹等問題[64]。而中藥治療糖尿病則具有多靶點(diǎn)、多途徑、生物效應(yīng)相對緩和、不良反應(yīng)少等優(yōu)點(diǎn)[65]，研究發(fā)現(xiàn)許多中藥糖蛋白具有α-糖苷酶抑制活性。

Sharma[66]、Yang等[67]均從山藥中分離得到了具有α-糖苷酶抑制作用的糖蛋白純品，Yang認(rèn)為其抑制能力的強(qiáng)弱可能與多糖含量有關(guān)。Qiao[68]從淫羊藿中分離純化得到的淫羊藿糖蛋白組分Ⅱ，能夠抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性，抑制作用較阿卡波糖緩和。Tang等[69]分離得到分子量約118.8 kDa的山茱萸糖蛋白GoGP，能夠抑制α-淀粉酶活性，其抑制類型表現(xiàn)為反競爭抑制。Zhao等[70]發(fā)現(xiàn)桔梗糖蛋白對α-葡萄糖苷酶的抑制作用隨濃度增大而增加，其抑制能力及抑制趨勢與陽性藥阿卡波糖相近。

4.3 對神經(jīng)系統(tǒng)的作用

Song等[71]研究發(fā)現(xiàn)人參糖蛋白能夠通過升高海馬內(nèi)單胺類遞質(zhì)的含量，如5-HT及其代謝產(chǎn)物，以逆轉(zhuǎn)利血平誘導(dǎo)的體溫降低和眼瞼下垂，對行為絕望模型小鼠具有保護(hù)作用。Lv[72]、Luo等[73]發(fā)現(xiàn)人參糖蛋白能夠提高記憶獲得障礙模型小鼠或老年癡呆模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力、減輕Aβ25-35誘導(dǎo)的大鼠記憶障礙癥狀，研究發(fā)現(xiàn)人參糖蛋白能夠抑制Aβ25-35誘導(dǎo)的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y 細(xì)胞凋亡，阻止其DNA合成期的中止，降低NO的釋放及iNOS活性[74,75]，從而有效保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞。Wang等[76]發(fā)現(xiàn)人參糖蛋白具有鎮(zhèn)靜安眠及鎮(zhèn)痛[77]作用，能夠顯著降低小鼠自主活動(dòng)次數(shù)，減少閾下劑量戊巴比妥鈉所致小鼠的睡眠潛伏期、延長睡眠時(shí)間；在高劑量(40 mg/kg)下其鎮(zhèn)痛活性遠(yuǎn)高于阿司匹林；純化得到的三種組分PGG1、PGG2、PGG3，以蛋白質(zhì)含量最高的PGG3鎮(zhèn)痛作用最強(qiáng)，推測人參糖蛋白鎮(zhèn)痛作用的強(qiáng)弱與蛋白質(zhì)含量有一定關(guān)系。

4.4 對心血管系統(tǒng)的作用

Ding等[78,79]研究發(fā)現(xiàn)天麻糖蛋白能夠顯著延長小鼠的凝血時(shí)間、出血時(shí)間和血漿復(fù)鈣時(shí)間，降低血小板聚集率，對ADP致血小板凝集血栓的形成有抑制作用；也能夠降低急性血瘀模型大鼠高切、中切的全血黏度和血漿黏度，及紅細(xì)胞聚集指數(shù)，減少大鼠體外形成的血栓長度、濕重和干重；對人血漿凝血酶時(shí)間(TT)和活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)有明顯延長作用，表明天麻糖蛋白具有顯著的抗凝、抗栓作用。Wei等[80]研究發(fā)現(xiàn)天麻糖蛋白能夠提高SOD活力及NO含量，降低MDA含量及MPO活性，以改善胃黏膜局部的血液循環(huán)、清除氧自由基達(dá)到保護(hù)胃黏膜的作用。

4.5 抗腫瘤作用

中藥糖蛋白主要是通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞增殖及血管形成，同時(shí)調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能來實(shí)現(xiàn)抗腫瘤目的。

Deng等[38]從霍山石斛中純化得到的相對分子質(zhì)量為22.5、19.8 kDa的糖蛋白組分RG1、RG2對人肝癌細(xì)胞HepG2有毒活性，表明二者可能是霍山石斛抗腫瘤活性的物質(zhì)基礎(chǔ)之一。Han等[6]從土鱉蟲內(nèi)提取純化得到的糖蛋白組分1對Hela細(xì)胞和食管癌 Eca109 細(xì)胞有明顯抑制作用；Li等[81]從地鱉體內(nèi)分離純化得到的纖溶活性蛋白(EFP)，對雞胚尿囊膜新生血管生成有良好的抑制作用，紅外光譜特征吸收峰推斷EFP為一種糖蛋白。Sun[82]、Lee[30]和Oh等[83]發(fā)現(xiàn)龍葵糖蛋白各組分能夠?qū)θ巳橄侔㎝CF-7細(xì)胞及HeLa細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性，其中對MCF-7細(xì)胞毒性較強(qiáng)的SNL-I能夠抑制1，2-二甲基肼(DMH)誘導(dǎo)的結(jié)腸癌小鼠模型結(jié)腸黏膜上癌前病變，即異位隱窩灶(ACF)的產(chǎn)生[84]。研究顯示龍葵糖蛋白能夠抑制細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)磷酸化、增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)和凋亡相關(guān)蛋白前體(pro-caspase-3和pro-PARP)的表達(dá)及NF-κB、AP-1的活性，促進(jìn)細(xì)胞色素c的釋放、caspase-8及caspase-3的活化和PARP裂解，降低iNOS、COX-2的表達(dá)及血漿中硫代巴比妥酸反應(yīng)物質(zhì)(TBARS)含量，表明龍葵糖蛋白能夠通過抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡、抑制促炎癥蛋白和因子表達(dá)及抗氧化來發(fā)揮抗腫瘤作用。

4.6 抗氧化作用

體內(nèi)自由基過量會(huì)損傷體內(nèi)生物大分子而造成機(jī)體損傷，癌癥、衰老等都與自由基過量有關(guān)[85]，因此，具有抗氧化活性的物質(zhì)一直受到人們的廣泛關(guān)注，在對中藥糖蛋白的研究過程中發(fā)現(xiàn)，許多中藥糖蛋白都具有較強(qiáng)的抗氧化活性。

玉竹[21]及蒲公英[86,87]糖蛋白均被發(fā)現(xiàn)具有較強(qiáng)的體外抗氧化活性，對羥基自由基、超氧陰離子自由基和DPPH自由基具有較強(qiáng)的清除作用，對脂質(zhì)過氧化具有抑制作用；二者均能提高小鼠血清、肝臟和腦組織中超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)及谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性，降低丙二醛(MDA)含量[88,89]。從山藥[17,90]、海馬[91]和丹參[92,93]中分離得到的各級(jí)糖蛋白純品，也具有較強(qiáng)的體外抗氧化活性，其中海馬糖蛋白組分HG-11和HG-21，以疏水性氨基酸和芳香族氨基酸含量較高的HG-21活性較強(qiáng)；山藥糖蛋白純品CYG1和CYG2，以多糖含量較高的CYG-2活性稍強(qiáng)。

4.7 抗衰老作用

衰老主要表現(xiàn)為機(jī)體全身各組織、器官的退行性變化，使細(xì)胞變性、萎縮、數(shù)量減少、組織脫水以致大部分臟器重量減輕[94]，在年齡增長過程中，生物體內(nèi)產(chǎn)生的抗氧化劑或酶類物質(zhì)如SOD、GSH-Px逐漸下降，過氧化脂質(zhì)逐漸增多，造成過氧化損傷，加速衰老[95]。因此，除了臟器指數(shù)、細(xì)胞形態(tài)等，體內(nèi)抗氧化酶活性、MDA含量也常作為評(píng)價(jià)衰老的指標(biāo)。

Zhang[45]通過血清代謝組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)志糖蛋白主要通過核苷酸代謝、碳水化合物合成代謝及糖代謝等通路發(fā)揮作用，其對D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老小鼠的臟器指數(shù)、血清中過氧化氫酶(CAT)及腦組織中超氧化物歧化酶(SOD)的活力均有增強(qiáng)作用，能夠減緩器官萎縮、降低腦組織中丙二醛(MDA)的含量。Qi[96]發(fā)現(xiàn)覆盆子糖蛋白能夠改善衰老小鼠體重增長緩慢的現(xiàn)象、緩解臟器損傷、提高體內(nèi)抗氧化酶活性，其中經(jīng)純化得到的體外抗氧化活性最強(qiáng)的組分GP3，能夠降低H2O2損傷下的TCMK-1、NRK-52E細(xì)胞的死亡率及β-半乳糖苷酶活性；RT-PCR及Western-blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明GP3能使衰老小鼠腎臟中Klotho基因表達(dá)增多[97]。故推測覆盆子糖蛋白可能是通過清除體內(nèi)有害自由基、修復(fù)臟器損傷，同時(shí)調(diào)節(jié)體內(nèi)抗衰老基因Klotho的表達(dá)水平來實(shí)現(xiàn)抗衰老作用的。

4.8 抗炎作用

中藥糖蛋白的抗炎機(jī)制主要是通過抑制NF-κB、AP-1等信號(hào)通路，降低iNOS和COX-2等促炎介質(zhì)的轉(zhuǎn)錄水平，從而抑制炎性因子如TNF-α、IL-6等的分泌，最終達(dá)到抗炎目的。

Lee等[98,99]發(fā)現(xiàn)從梔子中分離得到的分子量為27 kDa的糖蛋白能夠增強(qiáng)抗氧化酶(SOD和GPx)活性，清除體內(nèi)氧自由基以抑制其對AP-1和NF-κB的激活，從而抑制受二者調(diào)控的炎性因子TNF-α、IL-6、COX-2、iNOS的表達(dá)，達(dá)到抑制炎癥反應(yīng)的目的。Xia等[100]發(fā)現(xiàn)蒲公英糖蛋白能夠顯著上調(diào)受脂多糖刺激的RAW264.7細(xì)胞內(nèi)IκB-α的蛋白表達(dá)，并下調(diào)P-IκB-α的蛋白表達(dá)，表明蒲公英糖蛋白可能是通過抑制NF-κB信號(hào)通路的活化，以減少炎癥因子等的生成實(shí)現(xiàn)抗炎效果的。

糖蛋白藥理活性廣泛，大部分與原藥材保持一致，如龍葵能夠通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡、調(diào)控細(xì)胞周期等發(fā)揮抗腫瘤作用[101]，與龍葵糖蛋白藥理作用相似；有些中藥糖蛋白的藥理活性甚至強(qiáng)于目前普遍認(rèn)為的藥材有效成分，Wang等[77]研究發(fā)現(xiàn)相同劑量下人參糖蛋白表現(xiàn)出遠(yuǎn)高于人參總皂苷的鎮(zhèn)痛作用，這提示我們某些中藥糖蛋白可能是中藥材發(fā)揮藥效的重要基礎(chǔ)；但也存在相反的情況，如黃芪具有免疫增強(qiáng)作用，其糖蛋白卻有較強(qiáng)的免疫抑制活性。故糖蛋白與其原藥材之間藥理活性的關(guān)系及糖蛋白本身藥理活性的影響因素尚不明確，如海馬糖蛋白的抗氧化活性可能與疏水性氨基酸和芳香族氨基酸含量有關(guān)，山藥糖蛋白的抗氧化活性則與多糖含量有關(guān)。

5 結(jié)語

目前對中藥糖蛋白的研究，除了存在富集純化過程復(fù)雜、無法適應(yīng)大生產(chǎn)，結(jié)構(gòu)研究不夠深入，藥理活性影響因素不明確等問題，還存在其他問題：如前文提到某些中藥糖蛋白的藥理活性或可強(qiáng)于目前普遍認(rèn)為的有效成分，是中藥材發(fā)揮藥效的重要基礎(chǔ)，那么對于許多沒有明確指標(biāo)性成分作為質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)的中藥材，糖蛋白是否可以成為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的評(píng)價(jià)指標(biāo)之一？但針對此方面，對中藥糖蛋白與普遍認(rèn)為的有效成分之間的比較，以及以糖蛋白為指標(biāo)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)的相關(guān)研究還少見報(bào)道。此外，中醫(yī)臨床用藥要進(jìn)行炮制或配伍，對中藥材進(jìn)行炮制或配伍時(shí)，是否會(huì)引起糖蛋白含量或結(jié)構(gòu)的改變，糖蛋白的改變是否與藥效改變有所聯(lián)系，這些都未見報(bào)道。

雖然對中藥糖蛋白的研究還存在很多問題和困難，但中藥糖蛋白的研究無疑是具有重要意義的：除了能夠?yàn)橹兴幓A(chǔ)研究提供新思路，還能為中藥新藥研發(fā)提供參考。如前文所述黃芪糖蛋白的免疫抑制作用相較于目前常用的免疫抑制劑，具有毒副作用小、雙向調(diào)節(jié)的優(yōu)勢；對新生血管生成有良好抑制作用的地鱉蟲糖蛋白或可作為抗血管生成類藥物參與腫瘤的臨床治療；而具有α-糖苷酶抑制作用的中藥糖蛋白則有著藥理作用廣泛、作用效果更加緩和的優(yōu)勢。因此，中藥糖蛋白作為多靶點(diǎn)、高療效、低毒性的中藥活性成分，為新藥研發(fā)提供了參考，具有廣闊的應(yīng)用前景。