普元柱，蘇 燦，朱屹韜，肖清青，張?chǎng)澹詈悻?，周榮毅

1云南中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，昆明 650500；2云南省科學(xué)技術(shù)院，昆明 650051

人口老齡化是當(dāng)今中國(guó)和世界所面臨的一道難題。人口老齡化不僅帶來(lái)適齡勞動(dòng)力減少、國(guó)家和家庭的養(yǎng)老負(fù)擔(dān)增加等問(wèn)題，還帶來(lái)一系列健康問(wèn)題。研究證實(shí)，衰老是心腦血管疾病、糖尿病、癌癥、神經(jīng)退行性疾病等諸多復(fù)雜疾病的危險(xiǎn)因素[1]。雖然衰老不可阻止，但可通過(guò)熱量限制、基因操作、藥物干預(yù)等方式延緩衰老[1]。更重要的是，延緩衰老不僅延長(zhǎng)機(jī)體壽命，而且明顯改善機(jī)體健康狀況。如，在大多數(shù)慢性疾病中，限制食物攝入量可有效降低癥狀嚴(yán)重程度；二甲雙胍、雷帕霉素在多個(gè)模式生物中顯示能延長(zhǎng)壽命，流行病學(xué)研究表明人類適量服用二甲雙胍、雷帕霉素可預(yù)防許多癌癥的發(fā)生，降低神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病率[1]。因此，延緩衰老是降低老年相關(guān)疾病發(fā)生率的有效方法之一。

中醫(yī)自古強(qiáng)調(diào)養(yǎng)生保健，不治已病治未病，中醫(yī)藥抗衰老受到越來(lái)越多的關(guān)注。燈盞細(xì)辛Erigeronbreviscapus(Vant.) Hand.-Mazz.是治療心腦血管疾病等老年性疾病的常用中藥，其活性成分主要是黃酮類和咖啡酰類成分。研究發(fā)現(xiàn)黃酮類成分燈盞花素可對(duì)抗D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老，改善小鼠記憶障礙及肝、腎異常變化，但其作用機(jī)制仍不清楚[2,3]。而燈盞細(xì)辛中的咖啡酰類成分是否具有抗衰老作用，目前仍未見(jiàn)報(bào)道。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一種基于受體理論和生物網(wǎng)絡(luò)技術(shù)，整體闡述藥物作用及其作用機(jī)制的研究方法。中藥以口服為主，只有入血成分才可能是中藥治病和保健的有效成分。為探析燈盞細(xì)辛抗衰老作用機(jī)制，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究提供思路，本研究檢索燈盞細(xì)辛口服入血成分，應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法整體預(yù)測(cè)入血成分抗衰老靶點(diǎn)、分析靶點(diǎn)生物功能及作用通路，并以分子對(duì)接方法對(duì)入血成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的結(jié)合作用加以驗(yàn)證。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫(kù)與軟件

燈盞細(xì)辛入血成分及其結(jié)構(gòu)式檢索數(shù)據(jù)庫(kù)：CNKI、萬(wàn)方、PubMed、Web of Science， PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)；靶點(diǎn)預(yù)測(cè)/檢索數(shù)據(jù)庫(kù)：TCMSP(中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)，http://tcmspw.com/tcmsp.php)、SwissTargetPrediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)、STITCH(http://stitch-beta.embl.de/)；蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)：UniProt(https://www.uniprot.org/)、PDB(http://www.rcsb.org /)；衰老靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)：HAGR(人類衰老基因組資源庫(kù)，https://genomics.senescence.info/)；蛋白質(zhì)相互作用分析平臺(tái)：STRING(https://string-db.org/)；生物信息分析平臺(tái)：DAVID6.8(https://david.ncifcrf.gov)及STRING；網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建、分析軟件：Cytoscape 3.7.0、Venny 2.1.0 (https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)；分子對(duì)接軟件：Discovery Studio 2.5。

1.2 燈盞細(xì)辛入血成分抗衰老靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

以燈盞細(xì)辛、Dengzhanxixin、Erigeronbreviscapus、口服入血、oral administration、plasma、absorbed components、藥代動(dòng)力學(xué)、pharmacokinetics、代謝、metabolites、化學(xué)成分中英文名稱等為關(guān)鍵詞在CNKI、萬(wàn)方、PubMed、Web of Science等數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索燈盞細(xì)辛口服入血成分。在PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)查找入血成分的CAS號(hào)、SMILES格式文件。將各成分的SMILES分別導(dǎo)入STITCH和SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)各入血成分潛在作用靶點(diǎn)，以各成分的CAS號(hào)，在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中查找相應(yīng)成分的靶點(diǎn)。以上3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)得到的靶點(diǎn)合并去重后，即為燈盞細(xì)辛口服入血成分潛在作用靶點(diǎn)。從HAGR數(shù)據(jù)庫(kù)查找和下載人類衰老相關(guān)基因，再?gòu)闹泻Y選出在細(xì)胞模型中證實(shí)可影響細(xì)胞衰老和/或在動(dòng)物模型中證實(shí)可影響壽命的基因作為衰老靶點(diǎn)。將燈盞細(xì)辛口服入血成分潛在作用靶點(diǎn)與衰老靶點(diǎn)輸入Venny 2.1.0軟件，交集部分即為燈盞細(xì)辛抗衰老靶點(diǎn)。將靶點(diǎn)輸入U(xiǎn)niprot數(shù)據(jù)庫(kù)，選定物種為“homo sapiens”，得到靶點(diǎn)的相應(yīng)信息，如Uniprot ID、蛋白名。

1.3 生物功能與通路富集分析

將燈盞細(xì)辛抗衰老靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)，Select identifier選“official gene symbol”，List type選“gene list”，物種選“homo sapiens”，閾值P< 0.05，對(duì)燈盞細(xì)辛抗衰老靶點(diǎn)進(jìn)行g(shù)ene ontology(GO)分析生物過(guò)程(biology process)。采用STRING平臺(tái)對(duì)燈盞細(xì)辛抗衰老靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析，蛋白種屬選“homo sapiens”，閾值P< 0.05，其余參數(shù)均默認(rèn)。

1.4 靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析

將燈盞細(xì)辛抗衰老靶點(diǎn)上傳到STRING平臺(tái)，蛋白種屬選“homo sapiens”，交互作用評(píng)分閾值設(shè)置為大于0.9，其余參數(shù)均默認(rèn)，得到靶點(diǎn)蛋白相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)，結(jié)果保存為T(mén)SV格式并導(dǎo)入Cytoscape 3.7.0軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖，應(yīng)用Cytoscape的“Network Analyzer”計(jì)算網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，以靶點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的度(degree)值篩選燈盞細(xì)辛抗衰老關(guān)鍵靶點(diǎn)，度值越大，表明與該靶點(diǎn)有相互作用的靶點(diǎn)數(shù)越多，在燈盞細(xì)辛抗衰老中的作用越重要，即為燈盞細(xì)辛抗衰老關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.5 燈盞細(xì)辛入血成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析

采用Cytoscape 3.7.0構(gòu)建燈盞細(xì)辛入血成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。應(yīng)用Cytoscape的“Network Analyzer”計(jì)算網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，以入血成分在網(wǎng)絡(luò)中的度(degree)值篩選燈盞細(xì)辛抗衰老的關(guān)鍵成分，度值越大，表明該成分作用靶點(diǎn)數(shù)越多，在燈盞細(xì)辛抗衰老中的作用越重要，即為燈盞細(xì)辛抗衰老關(guān)鍵成分。

1.6 燈盞細(xì)辛入血成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)分子對(duì)接驗(yàn)證

選擇燈盞細(xì)辛口服入血成分作為配體、PPI網(wǎng)絡(luò)中度值較大的前幾個(gè)靶點(diǎn)作為受體，應(yīng)用Discovery Studio 2.5軟件的LibDock模塊進(jìn)行分子對(duì)接。在PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)下載入血成分3D結(jié)構(gòu)，在PDB數(shù)據(jù)庫(kù)下載靶點(diǎn)的蛋白結(jié)構(gòu)，然后導(dǎo)入Discovery Studio軟件，入血成分用CHARMm力場(chǎng)進(jìn)行能量?jī)?yōu)化，再用“Prepare Ligands”批量處理，保存作為對(duì)接配體；蛋白先刪除水分子，加氫，再用“Prepare Protein”處理，保存作為對(duì)接受體。原蛋白晶體結(jié)構(gòu)有配體者，以該配體位置為中心擴(kuò)大一定范圍(設(shè)半徑9～12 ?)作為活性結(jié)合位點(diǎn)，原蛋白晶體結(jié)構(gòu)無(wú)配體者，利用軟件自帶的“Find Sites from Receptor Cavities”尋找受體中可能的活性結(jié)合位點(diǎn)。選擇Libdock對(duì)接模式，Docking Preferences參數(shù)選擇“User Specified”，在Max Hits to Save參數(shù)中輸入值“10”，其余參數(shù)均默認(rèn)，進(jìn)行分子對(duì)接。對(duì)接完成后，以原配體或相應(yīng)蛋白晶體的上市藥物與蛋白晶體對(duì)接打分(LibDock score)為閾值，得分高于此閾值的入血成分，即認(rèn)為對(duì)該靶標(biāo)具有潛在活性。為驗(yàn)證分子對(duì)接流程可靠性，原蛋白晶體結(jié)構(gòu)有配體者，將配體抽離后，再按上述方法對(duì)接回原結(jié)合口袋，然后計(jì)算對(duì)接后配體的構(gòu)象與原始晶體結(jié)構(gòu)中配體構(gòu)象的均方根偏差(RMSD)，當(dāng)RMSD小于2.0時(shí)，證明對(duì)接方法可靠。

2 結(jié)果

2.1 燈盞細(xì)辛口服入血成分

通過(guò)文獻(xiàn)檢索和篩選，共檢索到燈盞細(xì)辛口服入血成分30個(gè)，包括黃酮類成分13個(gè)，咖啡酰類成分11個(gè)，其他類成分6個(gè)(見(jiàn)表1)。

表1 燈盞細(xì)辛口服入血成分Table 1 Components absorbed into blood after oral administration of E.breviscapus

續(xù)表1(Continued Tab.1)

2.2 燈盞細(xì)辛抗衰老潛在作用靶點(diǎn)

從STITCH、SwissTargetPrediction、TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)，分別預(yù)測(cè)、查找到燈盞細(xì)辛口服入血成分潛在作用靶點(diǎn)103、590、214個(gè)，合并去重后得到燈盞細(xì)辛作用靶點(diǎn)777個(gè)。從HAGR數(shù)據(jù)庫(kù)查找到人類衰老相關(guān)基因307個(gè)，其中有131個(gè)基因在細(xì)胞模型中證實(shí)可影響細(xì)胞衰老和/或在動(dòng)物模型中證實(shí)可影響壽命。將燈盞細(xì)辛777個(gè)預(yù)測(cè)靶點(diǎn)和131個(gè)衰老基因求交集，得到燈盞細(xì)辛抗衰老潛在作用靶點(diǎn)37個(gè)(見(jiàn)表2)。

表2 燈盞細(xì)辛抗衰老潛在靶點(diǎn)Table 2 Potential anti-aging targets of E.breviscapus

續(xù)表2(Cotninued Tab.2)

37個(gè)靶點(diǎn)中，22個(gè)靶點(diǎn)在細(xì)胞模型中證實(shí)可影響細(xì)胞衰老。其中，8個(gè)靶點(diǎn)其激活/過(guò)表達(dá)可抑制細(xì)胞衰老；14個(gè)靶點(diǎn)其激活/過(guò)表達(dá)可誘導(dǎo)細(xì)胞衰老。14個(gè)靶點(diǎn)在小鼠(Musmusculus)模型中證實(shí)可影響壽命，其中6個(gè)為促長(zhǎng)壽靶點(diǎn)(pro-longevity targets)，其激活/過(guò)表達(dá)可延長(zhǎng)壽命，而抑制其活性/表達(dá)則縮短壽命；8個(gè)為抗長(zhǎng)壽靶點(diǎn)(anti-longevity targets)，抑制其活性/表達(dá)可延長(zhǎng)壽命，激活其活性/表達(dá)則縮短壽命。2個(gè)靶點(diǎn)AKT1、SIRT1在細(xì)胞和小鼠模型中均證實(shí)可影響衰老(見(jiàn)圖1)。

圖1 37個(gè)靶點(diǎn)對(duì)細(xì)胞衰老(A)和小鼠壽命(B)的影響Fig.1 The effects of 37 targets on cellular senescence (A) and longevity of Mus musculus (B)

2.3 燈盞細(xì)辛抗衰老靶點(diǎn)生物過(guò)程與通路富集分析

將37個(gè)靶點(diǎn)的基因名稱導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)和STRING平臺(tái)，分別進(jìn)行生物過(guò)程和通路富集分析。依據(jù)P-value < 0.05篩選出生物過(guò)程199個(gè)，通路131條，分別選取P-value最小的前20條作圖(見(jiàn)圖2)。如圖所示，生物過(guò)程主要涉及RNA聚合酶II啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控(positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter)、凋亡過(guò)程的負(fù)調(diào)控(negative regulation of apoptotic process)、細(xì)胞對(duì)缺氧的反應(yīng)(cellular response to hypoxia)、復(fù)制性衰老(replicative senescence)、細(xì)胞衰老(cell aging)等，表明這些生物過(guò)程可能是燈盞細(xì)辛抗衰老的重要生物過(guò)程(見(jiàn)圖2A)；通路結(jié)果顯示，除涉及衰老相關(guān)通路細(xì)胞衰老(cellular senescence)、壽命調(diào)節(jié)通路(longevity regulating pathway，longevity regulating pathway-multiple species)外，其他主要涉及的是腫瘤調(diào)節(jié)通路，如腫瘤通路(pathways in cancer)、肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma)、前列腺癌(prostate cancer)、腫瘤中的微RNA(microRNAs in cancer)、乳腺癌(breast cancer)(見(jiàn)圖2B)，說(shuō)明這些通路可能是燈盞細(xì)辛抗衰老的主要信號(hào)通路。

圖2 燈盞細(xì)辛抗衰老靶點(diǎn)的生物學(xué)過(guò)程(A)和通路(B)富集分析Fig.2 Biology process (A) and pathway (B) analysis of targets of E.breviscapus anti-aging

2.4 燈盞細(xì)辛抗衰老靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

依據(jù)STRING平臺(tái)中的抗衰老靶點(diǎn)蛋白相互作用數(shù)據(jù)，采用Cytoscape軟件構(gòu)建得到燈盞細(xì)辛抗衰老靶點(diǎn)交互作用網(wǎng)絡(luò)(見(jiàn)圖3)，該網(wǎng)絡(luò)包括32個(gè)節(jié)點(diǎn)和93條邊。32個(gè)節(jié)點(diǎn)為燈盞細(xì)辛抗衰老靶點(diǎn)，其余5個(gè)靶點(diǎn)ADCY5、KCNA3、EEF1E1、TOP1、MIF，在設(shè)定的大于0.9可信度條件下，不存在交互作用。網(wǎng)絡(luò)分析顯示，在燈盞細(xì)辛抗衰老靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)中，TP53、AKT1、RB1、HRAS、HDAC1、SIRT1的度值分別為22、16、12、10、10、9，是度值最大的前6個(gè)節(jié)點(diǎn)，表明這6個(gè)節(jié)點(diǎn)是燈盞細(xì)辛抗衰老的關(guān)鍵靶點(diǎn)，可能在燈盞細(xì)辛抗衰老過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

圖3 燈盞細(xì)辛抗衰老靶點(diǎn)的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig.3 The protein-protein interaction network of targets of E.breviscapus anti-aging注：節(jié)點(diǎn)面積大小代表靶點(diǎn)度值；節(jié)點(diǎn)間邊線粗細(xì)代表靶點(diǎn)之間的關(guān)系值評(píng)分(combine score)，評(píng)分越高邊線越粗。Note:Area of nodes represents degree value;Thickness of the edge between any two nodes represents combine score between any two targets,the higher the combine score,the thicker the edge.

2.5 燈盞細(xì)辛入血成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

將燈盞細(xì)辛30個(gè)入血成分及37個(gè)抗衰老靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape軟件，得到燈盞細(xì)辛入血成分-抗衰老靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)(見(jiàn)圖4)。該網(wǎng)絡(luò)共包括67個(gè)節(jié)點(diǎn)，200條邊，其中30個(gè)節(jié)點(diǎn)為燈盞細(xì)辛入血成分，37個(gè)節(jié)點(diǎn)為燈盞細(xì)辛抗衰老靶點(diǎn)。網(wǎng)絡(luò)分析顯示，作用衰老靶點(diǎn)數(shù)在10個(gè)以上的入血成分是槲皮素、芹菜素、木犀草素、黃芩素、山柰酚、柚皮素，6個(gè)成分作用的靶點(diǎn)數(shù)分別為26、19、15、15、11、11；作用衰老靶點(diǎn)數(shù)在5-9個(gè)的入血成分是野黃芩素、山柰酚-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷、燈盞花苷I、東莨菪亭、異莨菪亭、5-CQA、綠原酸、對(duì)羥基苯甲酸、原兒茶醛，10個(gè)成分作用的靶點(diǎn)數(shù)分別為9、8、8、7、7、6、5、5、5、5；其余14個(gè)成分作用衰老靶點(diǎn)數(shù)小于5。6個(gè)靶點(diǎn)(IGF1R、INSR、PARP1、CDK1、PTK2、TERT、PRKCD)與10及10個(gè)以上燈盞細(xì)辛入血成分有相互作用，其余31個(gè)靶點(diǎn)與入血成分相互作用數(shù)小于10。該網(wǎng)絡(luò)說(shuō)明燈盞細(xì)辛抗衰老是多成分、多靶點(diǎn)作用的結(jié)果，相互作用多的成分和靶點(diǎn)可能是燈盞細(xì)辛抗衰老的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。

圖4 燈盞細(xì)辛入血成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)Fig.4 Absorbed components-targets network of E.breviscapus anti-aging注：黃綠色節(jié)點(diǎn)代表入血成分；淡紅色節(jié)點(diǎn)代表靶點(diǎn)；節(jié)點(diǎn)面積大小代表度值。Note:Yellow-green nodes represent the absorbed components, Light-red nodes represent targets;Area of nodes represents degree value.

2.6 燈盞細(xì)辛入血成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)分子對(duì)接驗(yàn)證

采用Discovery Studio 2.5軟件的LibDock模塊，對(duì)30個(gè)燈盞細(xì)辛入血成分與6個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證。6個(gè)靶點(diǎn)中，TP53(PDBID:5AB9)、AKT1(PDBID:3CQW)、HRAS(PDBID:2UZI)、SIRT1(PDBID:4ZZI)的蛋白晶體結(jié)構(gòu)含有配體，將配體抽離后，再按1.6項(xiàng)下步驟對(duì)接回原結(jié)合口袋，計(jì)算對(duì)接后配體的構(gòu)象與原始晶體結(jié)構(gòu)中配體構(gòu)象的RMSD值分別為1.2816(TP53)、0.6733(AKT1)、0.9361(HRAS)、0.9585(SIRT1)，均小于2.0，說(shuō)明本研究對(duì)接方法可靠。以成分及對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)對(duì)接打分構(gòu)建熱圖(見(jiàn)圖5)。如圖所示，所有入血成分均能與6個(gè)靶點(diǎn)對(duì)接。原配體與TP53、AKT1、HRAS、SIRT1對(duì)接打分分別為100.95、83.33、183.404、105.62；上市藥物Romidepsin與HDAC1(PDBID:6Z2J)對(duì)接打分為64.71；RB1(PDBID:4ELJ)無(wú)原配體，也沒(méi)有相應(yīng)上市藥物，故不做后續(xù)分析。以上述打分為閾值，所有入血成分與HRAS的對(duì)接打分均低于閾值，表明30個(gè)入血成分與該靶點(diǎn)的結(jié)合可能較弱；17個(gè)入血成分與TP53、AKT1、HDAC1、SIRT1結(jié)合打分均高于閾值，包括黃酮類成分燈盞甲素、野黃芩苷、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷、山柰酚-3-O-葡萄糖苷、黃芩素、柚皮素、木犀草素，咖啡酰類成分4,5-DCQA、3,4-DCQA、3,5-DCQA、1,3-DCQA、1,5-DCQA、4-CQA、5-CQA、綠原酸、燈盞花苷I；4個(gè)入血成分與TP53、AKT1、SIRT1結(jié)合打分均高于閾值，分別是槲皮素、野黃芩素、山柰酚、芹菜素。以上分子對(duì)接結(jié)果表明，黃酮類和咖啡酰類成分是燈盞細(xì)辛抗衰老的潛在活性成分，可能通過(guò)TP53、AKT1、HDAC1、SIRT1這些靶點(diǎn)而發(fā)揮抗衰老作用。

圖5 燈盞細(xì)辛入血成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)對(duì)接打分熱圖Fig.5 Heatmap for docking score of key targets with absorbed components of E.breviscapus

打分最高的4,5-DCQA與TP53(見(jiàn)圖6A)、野黃芩苷與AKT1(見(jiàn)圖6B)、3,4-DCQA與HDAC1(見(jiàn)圖6C)、3,5-DCQA與SIRT1(見(jiàn)圖6D)的結(jié)合模式進(jìn)行分析，結(jié)果顯示結(jié)合模式主要是氫鍵、烷基-π鍵(Pi-Alkyl)、碳?xì)滏I。以黃酮類成分野黃芩苷與AKT1的結(jié)合為例，其結(jié)構(gòu)中的羰基和羥基分別與氨基酸殘基GLY159、THR160、PHE161、GLY162、LEU156形成5個(gè)氫鍵，黃酮母核3個(gè)環(huán)與VAL164(3個(gè))、ALA177、MET281形成5個(gè)烷基-π鍵，MET227與B環(huán)形成1個(gè)硫-π鍵，糖基與LYS163、GLY162形成2個(gè)碳?xì)滏I。以咖啡酰類成分3,5-DCQA與SIRT1的結(jié)合為例，其結(jié)構(gòu)中的羰基和羥基與氨基酸殘基TYR280、HIS363、VAL412、ASN346、ARG446、ASP348形成6個(gè)氫鍵，咖啡?；江h(huán)分別與ALA262、ILE270形成2個(gè)烷基-π鍵、與VAL445形成π-σ鍵，另有陰離子π鍵(HIS363)、碳?xì)滏I(SER265、ILE347)形成。在結(jié)合空腔外圍，PHE273、PHE413、PHE414、LYS203、ASP204在保持口袋的疏水性方面起到了重要的作用。

圖6 燈盞細(xì)辛抗衰老靶蛋白-入血成分分子結(jié)合模式圖Fig.6 Molecular docking pattern of target protein-absorbed components of E.breviscapus anti-aging

3 討論

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)常以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、半衰期(half-life，HL)≥4、類藥性(drug like，DL)≥0.18為條件篩選研究成分。作者發(fā)現(xiàn)，燈盞細(xì)辛若以該條件篩選成分，其黃酮類主要活性成分野黃芩苷和咖啡酰類成分完全排除在外，這顯然與目前認(rèn)為這兩類成分是燈盞細(xì)辛的主要活性成分的認(rèn)識(shí)不符。中藥以口服為主，口服后吸收入血的成分即有可能是中藥的活性成分。因此，本研究按照血清藥物化學(xué)的思路，將燈盞細(xì)辛中含有的且有文獻(xiàn)報(bào)道口服可吸收入血的成分作為網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究的對(duì)象。

本研究檢索到燈盞細(xì)辛口服入血成分30個(gè)，包括黃酮類成分13個(gè)，咖啡酰類成分11個(gè)，其他類成分6個(gè)，預(yù)測(cè)作用于37個(gè)衰老靶點(diǎn)。這37個(gè)靶點(diǎn)主要涉及衰老、腫瘤調(diào)節(jié)等生物過(guò)程和通路，這與“腫瘤和衰老密切相關(guān)，衰老是腫瘤的最大風(fēng)險(xiǎn)因素”的認(rèn)識(shí)相一致。研究表明，隨著年齡的增長(zhǎng)，DNA損傷和突變?cè)龆?，?dǎo)致患癌風(fēng)險(xiǎn)升高[18]。另外，衰老引起的循環(huán)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)改變，也可能導(dǎo)致癌癥發(fā)生率上升[18]。PPI網(wǎng)絡(luò)分析顯示，TP53、AKT1、RB1、HRAS、HDAC1、SIRT1是燈盞細(xì)辛抗衰老的潛在關(guān)鍵靶點(diǎn)。腫瘤蛋白p53(TP53)是一種腫瘤抑制蛋白，其調(diào)控著腫瘤發(fā)生和衰老進(jìn)程。過(guò)表達(dá)TP53可誘導(dǎo)細(xì)胞衰老，在小鼠體內(nèi)異常激活p53降低了腫瘤發(fā)生率，但也導(dǎo)致小鼠過(guò)早的衰老。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)且受到正常調(diào)控的p53在提高機(jī)體對(duì)腫瘤耐受性的同時(shí)，還不會(huì)導(dǎo)致過(guò)早衰老和壽命縮短現(xiàn)象的發(fā)生[19]。AKT1是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，抑制AKT1活性可延長(zhǎng)壽命，如Akt1缺陷小鼠(Akt1+/-)雄性壽命延長(zhǎng)8%，雌性壽命延長(zhǎng)15%[20]。視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤基因1(RB1)是一個(gè)抑癌基因，在衰老調(diào)節(jié)方面，RB1主要通過(guò)抑癌基因p16途徑使細(xì)胞發(fā)生衰老[21]。Harvey鼠肉瘤病毒癌基因(HRAS)是RAS致癌基因家族的成員，過(guò)表達(dá)HRAS可誘導(dǎo)細(xì)胞衰老，已證明RAS途徑與胰島素/胰島素樣生長(zhǎng)因子一起影響著線蟲(chóng)的發(fā)育和衰老[22]。組蛋白去乙酰化酶1(HDAC1)在發(fā)育、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和細(xì)胞周期進(jìn)程等過(guò)程中起著重要的作用。過(guò)表達(dá)HDAC1可誘導(dǎo)細(xì)胞衰老，在果蠅中突變HDAC1的同源體Rpd3延長(zhǎng)雄性果蠅壽命33%，延長(zhǎng)雌性果蠅壽命52%[23]。SIRT1是一種NAD+依賴的去乙酰化酶，其激活可延緩衰老，促進(jìn)長(zhǎng)壽。在小鼠腦部特異性過(guò)表達(dá)SIRT1延長(zhǎng)雌性壽命16%、雄性壽命9%[24]。因此，燈盞細(xì)辛通過(guò)作用于這些靶點(diǎn)可起調(diào)節(jié)衰老的作用。

入血成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)分析顯示，黃酮類成分是燈盞細(xì)辛抗衰老的重要活性成分；分子對(duì)接顯示，黃酮類成分與4個(gè)潛在關(guān)鍵靶點(diǎn)TP53、AKT1、HDAC1、SIRT1結(jié)合打分高于閾值，進(jìn)一步提示黃酮類成分是燈盞細(xì)辛抗衰老的潛在活性成分。不同的是，網(wǎng)絡(luò)分析顯示咖啡酰類成分在燈盞細(xì)辛抗衰老的作用中不是關(guān)鍵成分，但分子對(duì)接顯示，除咖啡酸、阿魏酸外，11個(gè)咖啡酰類成分與TP53、AKT1、HDAC1、SIRT1結(jié)合打分均高于閾值，整體甚至高于黃酮類成分。分析原因可能是目前對(duì)咖啡酰類成分研究的不多，靶點(diǎn)預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄的與該類成分結(jié)構(gòu)相似的化合物較少或已驗(yàn)證的有關(guān)該類成分靶點(diǎn)的信息較少，所以預(yù)測(cè)到的靶點(diǎn)數(shù)較少所致。在777個(gè)燈盞細(xì)辛預(yù)測(cè)靶點(diǎn)中，13個(gè)黃酮類成分平均每個(gè)成分預(yù)測(cè)到的靶點(diǎn)數(shù)是102，而11個(gè)咖啡酰類成分平均每個(gè)成分預(yù)測(cè)到的靶點(diǎn)數(shù)僅為26。通過(guò)文獻(xiàn)研究，黃酮類和咖啡酰類成分均可能是燈盞細(xì)辛抗衰老的主要活性成分，可能通過(guò)TP53、AKT1、HDAC1、SIRT1這些靶點(diǎn)而發(fā)揮抗衰老作用。實(shí)際上，這兩類成分，有的經(jīng)壽命實(shí)驗(yàn)證實(shí)確有抗衰老的作用，而且有的成分的抗衰老機(jī)制與本研究預(yù)測(cè)結(jié)果相一致。線蟲(chóng)壽命實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，槲皮素、黃芩素、山柰酚、綠原酸、5-CQA、4-CQA、1,3-DCQA、1,5-DCQA分別延長(zhǎng)線蟲(chóng)平均壽命18.0%、45.0%、10%、20.1%、12.1%、15.2%、12.5%、8.0%[25]。其中，文獻(xiàn)證實(shí)綠原酸通過(guò)抑制AKT1活性而延長(zhǎng)線蟲(chóng)壽命[25]，這與本研究中AKT1是燈盞細(xì)辛抗衰老的關(guān)鍵靶點(diǎn)、綠原酸與AKT1有很好的結(jié)合作用的結(jié)果相一致。以上這些報(bào)道與本研究結(jié)果相互佐證，表明本研究結(jié)果具有一定的可靠性。因而，研究結(jié)果中至今沒(méi)有明確的實(shí)驗(yàn)證實(shí)有抗衰老作用的成分，可根據(jù)預(yù)測(cè)結(jié)果設(shè)計(jì)相應(yīng)實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證。

綜上，本研究以燈盞細(xì)辛口服吸收入血成分為研究對(duì)象，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析了燈盞細(xì)辛抗衰老的潛在作用靶點(diǎn)及通路，并結(jié)合分子對(duì)接驗(yàn)證了這些入血成分與主要潛在作用靶點(diǎn)的結(jié)合能力，研究結(jié)果表明黃酮類和咖啡酰類成分是燈盞細(xì)辛抗衰老的潛在活性成分，可能通過(guò)作用于TP53、AKT1、HDAC1、SIRT1這些靶點(diǎn)，進(jìn)而調(diào)控衰老和腫瘤等相關(guān)生物過(guò)程和通路而發(fā)揮抗衰老作用，研究結(jié)果為后續(xù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證提供了思路。