陳立府，孟 菲,2，李志良,2，謝仕慧，史培穎,3 *

1福建農林大學動物科學學院(蜂學學院)；2福建農林大學食品科學學院；3天然生物毒素國家地方聯(lián)合工程實驗室，福州 350002

心力衰竭(heart failure，HF)是一種常見的心血管病綜合征，是各種心臟疾病發(fā)展的終末階段，其致殘率和死亡率均較高。心臟肥大(cardiac hypertrophy，CH)是HF過程中的早期適應性反應，但是長時間的CH會加速心肌纖維化和心臟收縮功能障礙，進而加快HF的進程[1]。CH不僅會引發(fā)充血性心力衰竭，也是高血壓、心臟瓣膜病、擴張型心肌病、心肌缺血、心肌梗死、心律失常和猝死的獨立危險因素[2]。對CH的控制可以顯著延緩心肌病的進程。延緩或避免CH的發(fā)生是一個主要的治療目標。

異丙腎上腺素(isoproterenol，ISO)屬于腎上腺素能受體激動劑。重復或連續(xù)注射ISO興奮β1-腎上腺素能受體，可使心肌產生毒性損傷，增加心肌的收縮力和耗氧量致使心律失常、后負荷增高和心肌缺血壞死等，導致心肌重塑，從而誘發(fā)代償性CH[3]。因此，ISO常被用來建立CH模型。研究表明ISO誘導的CH會伴有心肌細胞面積增加、蛋白質合成過多以及CH的標記基因如心鈉素(ANP)、腦鈉肽(BNP)和β-肌球蛋白重鏈(β-MHC)等的再激活[4,5]。

蜂花粉是眾多蜂產品中的典型代表之一，所含成分豐富。據(jù)Thakur等的統(tǒng)計顯示，蜂花粉主要成分包括碳水化合物(54.22%)、蛋白質(21.30%)、脂質(5.31%)、纖維(8.75%)、灰分(2.91%)等[6]，還含有酚酸類化合物、黃酮類化合物、多胺、核苷、氨基酸、脂肪酸、維生素等[6-8]。蜂花粉具有抗氧化[9]、抗心肌梗死[7]、保護肝腎[10]等多種藥理活性，具有潛在的應用價值。課題組前期研究了五味子蜂花粉乙醇提取物及其主要成分對H2O2損傷H9c2心肌細胞的保護作用及其機制[11]，證實蜂花粉的抗氧化能力對心肌細胞損傷具有保護作用。油菜蜂花粉是蜂產品市場的熱銷品之一，Zhang等[9]通過比較不同蜂花粉中總酚和總黃酮含量及抗氧化能力的差異，發(fā)現(xiàn)油菜蜂花粉的總酚和總黃酮含量較高，抗氧化能力也較強。本文以常見蜂花粉—油菜蜂花粉乙醇提取物(rape bee pollen ethanol extract，RBPEE)為研究對象，鑒定其主要化學成分，并研究其對ISO誘導心肌細胞肥大的干預作用及可能的分子機制，為蜂花粉資源的深度開發(fā)利用奠定基礎。

1 實驗材料與方法

1.1 主要試劑與材料

1.1.1 蜂花粉

油菜(BrassicanapusL.)蜂花粉于2018年12月購自鮮蜂堂青海養(yǎng)蜂基地，按照國標GB/T 30359-2013進行蜂花粉純度鑒定，純度大于95%，符合實驗要求，于4 ℃保存。

1.1.2 心肌細胞系

H9c2(2-1)(Procell CL-0089)心肌細胞株購買自普諾賽生命科技有限公司(武漢，中國)。

1.1.3 主要實驗試劑

純凈水(怡寶)；色譜級甲醇、乙腈(德國Merck)；甲酸、磷酸鹽緩沖溶液PBS(國藥集團化學試劑有限公司)；胎牛血清FBS、DMEM高糖培養(yǎng)基(賽澳美細胞技術有限公司)；青鏈霉素混合液、胰蛋白酶(美國HyClone公司)；鹽酸異丙腎上腺素(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；尿苷、鳥苷(純度≥98%)、卡托普利、細胞級DMSO(北京索萊寶科技有限公司)；BCA蛋白定量測定試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒、谷胱甘肽(GSH)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；YF?488標記鬼筆環(huán)肽(YF?488-Phalloidin)(綠色)(蘇州宇恒生物科技有限公司)；TransZol UP試劑盒(北京全式金生物技術有限公司)；逆轉錄和熒光定量PCR試劑盒(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)；PCR引物(福州尚亞生物技術有限公司)。

1.1.4 主要儀器設備

Agilent 1290 Infinity LC儀器、Agilent 6530 QTOF質譜儀(安捷倫科技有限公司)；5% CO2培養(yǎng)箱(C150)(Binder)；生物安全柜(Hfsafe-1500 A2電動型)(廣州莫菲公司)；倒置熒光顯微鏡(TS2-C-S-EC-ELWD 0.3)(Nikon)；倒置顯微鏡(TS-100f)(Nikon)；酶標儀(Infinite F50、Infinite Pro200)(Tecan)；Real-Time System C1000 Touch Thermal Cycler PCR儀(BIORAD)；梯度PCR儀(Applied Biosystems)；超微量分光光度計(浙江金華益迪醫(yī)療設備廠)；培英HZQ-F100全溫雙層振蕩培養(yǎng)箱(濟南好來寶醫(yī)療器材有限公司)；FreeZone(Plus)4.5 L冷凍干燥機(賽默飛)；3K15臺式高速冷凍離心機(Sigma)。

1.2 實驗方法

1.2.1 RBPEE的制備及主要成分鑒定

1.2.1.1 RBPEE的制備

根據(jù)課題組前期研究[11]，用粉碎機將干燥后的蜂花粉粉碎，稱取蜂花粉粉末，以料液比1∶15加入70%乙醇混勻，進行搖床振搖提取(240 rpm，37 ℃)結合超聲提取(振搖24 h，超聲20 min)，重復操作2次。將提取液進行抽濾，濾液在4 ℃條件下，8 000 rpm離心10 min，取上清液于圓底燒瓶中進行旋轉蒸發(fā)(46～50 ℃，0.07 MPa)至浸膏狀，收集底物進行冷凍干燥，收集凍干粉備用。

1.2.1.2 RBPEE主要成分鑒定

精確稱量10 mg蜂花粉凍干粉，將其溶解于1 mL的70%甲醇溶液中，渦旋2 min后超聲5 min，再14 000 rpm離心10 min，取上清液至進樣瓶中，用于UPLC-MS分析。

1.2.1.2.1 UPLC條件

UPLC分析在Agilent 1290 Infinity LC儀器上進行，該儀器由四元泵、自動進樣器、柱溫室和二極管陣列檢測器組成。樣品在Zorbax SB-C18色譜柱(3.5 μm，100 mm × 2.1 mm內徑)上分離。流動相為超聲除氣后的0.1%甲酸水溶液(A)-甲醇(B)，梯度洗脫條件如下：0～3 min：10%(B)；3～10 min：10%～65%(B)；10～10.5 min：65%～80%(B)；10.5～15 min：80%(B)。UV檢測波長設定為254 nm。柱溫和流速分別設置為20 ℃和0.2 mL/min，進樣體積1 μL[11]。

1.2.1.2.2 Q-TOF MS條件

UPLC系統(tǒng)連接到配備Dual ESI電噴霧離子源的Agilent 6530 QTOF質譜儀：毛細管電壓在(-)ESI模式下為3.5 kV；霧化器壓力為40 psig；干燥氣體(氮氣)流量為10.0 L/min，溫度為325 ℃；OCT 1 RF Vpp為750 V。掃描范圍為m/z100～1 500。

1.2.2 細胞培養(yǎng)樣品制備

完全培養(yǎng)基：10%胎牛血清+1%青霉素、鏈霉素雙抗+89% DMEM高糖培養(yǎng)基；不完全培養(yǎng)基：1%青霉素、鏈霉素雙抗+99% DMEM高糖培養(yǎng)基；細胞凍存液：55% DMEM高糖培養(yǎng)基+40%胎牛血清+5% DMSO。

使用細胞級DMSO配制蜂花粉以及卡托普利(Captopril)儲備液：RBPEE制成100 mg/mL的儲備液；卡托普利儲備液濃度為1 mmol/L。10 mmol/L的ISO儲備液用完全培養(yǎng)液直接溶解制得。臨用時，分別用完全培養(yǎng)液稀釋上述儲備液至所需濃度。

1.2.3 細胞分組及給藥

H9c2細胞經(jīng)種板孵育24 h后，按表1分組情況進行加樣：除陰性對照組加完全培養(yǎng)液，陽性對照組加0.1 mmol/L卡托普利，其他組加入對應體積各濃度梯度RBPEE溶液進行培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)24 h后加入不完全培養(yǎng)液進行饑餓12 h，最后經(jīng)PBS清洗后，除陰性對照組加完全培養(yǎng)液，其余各組都加入50 μmol/L的ISO損傷細胞48 h。

表1 細胞分組給藥情況Table 1 Cell group administration

1.2.4 心肌細胞骨架染色及表面積測定

將各組給藥處理的H9c2心肌細胞根據(jù)YF?488標記鬼筆環(huán)肽染色說明書進行固定染色。細胞經(jīng)PBS清洗后用含有4%多聚甲醛溶液冰上固定15 min，PBS清洗后再利用0.5% Trion X-100溶液在室溫下透化10 min，繼續(xù)用PBS清洗，隨后用200 μL PBS溶液稀釋5 μL YF熒光標記的鬼筆環(huán)肽儲液配成染液，室溫避光孵育30 min進行染色。PBS清洗后在倒置熒光顯微鏡400倍的視野下進行觀察并拍照。每組隨機選取4～6個視圖，用Oplenic軟件對照片中心肌細胞的表面積進行測量，取其平均值。

1.2.5 細胞總蛋白含量、SOD和GSH的測定

細胞總蛋白含量、SOD和GSH測定方法根據(jù)測定試劑盒說明書微調后進行操作。即，細胞培養(yǎng)48 h后，胰酶消化細胞并終止，1 000 rpm離心5 min，棄上清，再加入1 mL生理鹽水吹打混勻，1 000 rpm離心5 min棄上清，留細胞沉淀，再加入0.3 mL生理鹽水，冰水浴下電動研磨，每次15～20 s，間隔30 s，總共研磨4次，不離心根據(jù)蛋白定量測定試劑盒、SOD測定試劑盒(WST-1法)和微量還原型GSH測定試劑盒(微板法)說明書加樣表直接取樣檢測。

1.2.6 細胞MDA測定

細胞MDA含量測定方法根據(jù)測定試劑盒(微板法)說明書微調后進行操作。消化、清洗、離心后留沉淀加入0.5 mL試劑五提取液懸浮細胞，混勻2 min后冰水浴下電動研磨破碎細胞，每次15～20 s，間隔30 s，總共研磨4次，取0.1 mL破碎后的細胞懸液于1.5 mL離心管中(預先在管蓋上刺一個小孔)，然后根據(jù)說明書加樣表進行操作計算。

1.2.7 實時熒光定量PCR

按給藥分組情況處理細胞后按照TransZol UP試劑盒對各組細胞的RNA進行提取，并進行RNA濃度的測定。使用HiScript?Ⅱ Q RT SuperMix 試劑盒，根據(jù)說明書將所得樣品的RNA進行反轉錄，合成cDNA。以cDNA為模板，按ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒說明書配制反應體系，每個樣品設3個復孔。從65 ℃到95 ℃，以0.5 ℃/5 s逐漸增溫，同時檢測熒光信號來獲得熔解曲線。反應結束后，根據(jù)儀器生成的循環(huán)閾值Ct，取重復組別的平均Ct值做數(shù)據(jù)分析，計算各基因的相對表達量。根據(jù)引物設計原則，利用NCBI網(wǎng)頁端設計PCR引物(見表2)。

表2 PCR擴增的引物序列Table 2 Primer sequences for PCR amplification

1.2.8 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均以平均值±標準誤表示。使用GraphPad Prism 8.0軟件單因素方差分析對各組樣品進行顯著性差異分析。當P< 0.05時，表示具有顯著性差異；當P< 0.01時，表示差異具有極顯著性。

2 結果

2.1 UPLC-ESI-QTOF MS分析RBPEE的主要成分

RBPEE在254 nm處的UV色譜圖和負離子模式的總離子流色譜圖見圖1，初步鑒定了7種主要成分，包括1種糖類、2種核苷類、1種多胺和3種黃酮類化合物，鑒定結果見表3。

表3 RBPEE中的各峰分配情況Table 3 Peak assignments for the analysis of RBPEE

圖1 RBPEE在254 nm的UV色譜圖(A)和負離子模式的總離子流色譜圖(B)Fig.1 UV chromatogram at 254 nm (A) and total ion chromatogram in negative ion mode of RBPEE (B)

峰1的[M-H]-離子的質荷比為195.051 45，分子式為C6H12O7，不飽和度為1，該化合物初步推測為葡萄糖酸[11]。峰2的[M-H]-離子的質荷比為243.062 16，分子式為C9H12N2O，不飽和度為5，通過與標準品對照，該化合物鑒定為尿苷[11]；峰3的[M-H]-離子的質荷比為282.084 06，分子式為C10H13N5，不飽和度為7，通過與標準品對照，該化合物鑒定為鳥苷[11]。峰4的[M-H]-離子的質荷比為436.223 02，分子式為C25H31N3O4，不飽和度為12，該化合物初步鑒定為N′,N′′-雙(對香豆酰)亞精胺[8]。峰5的[M-H]-離子的質荷比為625.142 37，分子式是C27H30O17，不飽和度為13，該化合物初步鑒定為槲皮素-3-O-(2′′-O-吡喃葡萄糖基)-吡喃葡萄糖苷[8]。峰6和峰7具有相同分子離子，其[M-H]-離子質荷比分別為609.145 92和609.143 18，分子式為C27H30O16，不飽和度都為13，根據(jù)先前報道[8]，峰6初步鑒定為槲皮素-3-O-(2′′-O-吡喃葡萄糖基)-鼠李糖苷，峰7鑒定為山奈酚-3-O-(2′′-O-吡喃葡萄糖基)-吡喃葡萄糖苷。

2.2 RBPEE對細胞形態(tài)學變化、表面積和總蛋白含量的影響

ISO處理48 h后，通過顯微(400×)觀察，發(fā)現(xiàn)陰性對照組細胞形態(tài)及生存狀態(tài)良好，未見異常變化，細胞呈單層簇狀，多呈放射狀的同心圓排列，收縮有力；模型組心肌細胞呈現(xiàn)顯著的病理性形態(tài)學變化，細胞核暗淡，間質水腫，細胞肥大，胞間隙明顯縮小，排列紊亂。與模型組相比，卡托普利組和RBPEE處理組細胞形態(tài)及生存狀態(tài)明顯好轉，心肌細胞形態(tài)回縮，細胞間隙恢復(見圖2)。各組細胞經(jīng)鬼筆環(huán)肽染色后，模型組與陰性對照組相比，細胞明顯肥大，細胞骨架的微絲密度增大，細胞形態(tài)中梭形占比減少、圓形占比增加，胞間隙明顯縮小，分布不均勻且排列紊亂，更易聚集成團。與模型組比較，卡托普利組和RBPEE處理組的細胞體積明顯縮小，形態(tài)恢復梭形，細胞骨架微絲密度顯著降低，細胞間隙增加，排列恢復齊整。

圖2 RBPEE對H9c2心肌細胞形態(tài)的影響(左:未染色，右:鬼筆環(huán)肽染色)Fig.2 Effect of RBPEE on morphology of H9c2 cardiomyocytes (left:no staining,right:phalloidin staining)注：A：陰性對照組；B：模型組；C：陽性對照組；D：低濃度組，E：中濃度組，F(xiàn)：高濃度組；“→”指示細胞失去梭形呈圓形；“○”標注細胞胞間隙明顯縮小聚集成團。下同。Note:A:Negative control;B:Model;C:Positive control;D:Low concentration;E:Middle concentration;F:High concentration;“→” indicates a loss of spindle and a round shape;“○” note that the intercellular space is significantly reduced and aggregates.The same below.

細胞骨架染色后的細胞表面積結果如表4所示，模型組相較于陰性對照組的細胞表面積平均增大了40.28%，不同濃度的RBPEE處理后分別降低了24.93%(低濃度組)、26.58%(中濃度組)、29.24%(高濃度組)，且都具有顯著性差異(P< 0.01，相較于模型組)。

表4 RBPEE對H9c2細胞表面積的影響

RBPEE處理后的各組細胞經(jīng)過48 h的ISO損傷后，各組細胞總蛋白含量結果如圖3所示。模型組的總蛋白含量相較于陰性對照組顯著增加(P< 0.01)；與模型組相比，低、中、高濃度RBPEE預處理后，總蛋白含量均顯著降低(P< 0.01)。

圖3 RBPEE處理對心肌細胞總蛋白含量的影響(n = 6)Fig.3 Effect of RBPEE treatment on total protein content in cardiomyocytes (n = 6)注：與陰性對照組相比，** P < 0.01；與模型組相比，## P < 0.01。Note:Compared with negative control,** P < 0.01; Compared with model,## P < 0.01.

綜上，RBPEE能夠顯著降低肥大心肌細胞的表面積和總蛋白含量，對ISO致心肌細胞肥大具有保護作用。

2.3 RBPEE對心肌細胞肥大標志物mRNA表達水平的影響

RBPEE處理后，心肌細胞肥大標志物ANP、BNP和β-MHC的mRNA表達水平如圖4所示。在ISO處理的模型組中，ANP、BNP和β-MHC的基因表達水平相較于陰性對照組顯著增加(P< 0.01)。與模型組相比，低、中、高濃度RBPEE組ANP和BNP基因表達水平顯著降低(P< 0.01)；中、高濃度RBPEE組β-MHC基因表達水平顯著降低(P<0.01)。綜上，RBPEE能夠顯著降低三種心肌細胞肥大標志物的mRNA表達水平，對ISO致心肌細胞肥大具有保護作用。

圖4 RBPEE處理對心肌細胞肥大標志物基因表達的影響(n = 3)Fig.4 Effect of RBPEE treatment on the gene expression of hypertrophy markers in cardiomyocytes (n = 3)注：與陰性對照組相比，** P < 0.01；與模型組相比，## P < 0.01。Note:Compared with negative control,** P < 0.01;Compared with model, ## P < 0.01.

2.4 RBPEE對H9c2心肌細胞中SOD、GSH和MDA的影響

RBPEE處理后各組細胞中SOD活力和GSH、MDA的含量如表5所示。相較于陰性對照組，模型組中SOD活力和GSH含量都顯著降低(P< 0.01)，MDA含量則顯著升高(P< 0.01)。三種濃度RBPEE處理后的SOD活性和GSH含量較模型組顯著升高(P< 0.05，P< 0.01)；MDA含量在RBPE處理后較模型組均顯著降低(P< 0.01)。實驗結果表明，給予RBPEE處理后可以降低ISO對H9c2心肌細胞造成的氧化損傷，提高細胞的抗氧化能力。

表5 RBPEE對H9c2細胞中SOD、GSH和MDA的影響Table 5 Effect of RBPEE on SOD,GSH and MDA in H9c2 cells = 6)

2.5 RBPEE對心肌細胞中炎癥相關指標mRNA表達的影響

RBPEE處理對心肌細胞白細胞介素2(IL-2)、白細胞介素6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的mRNA表達水平的影響如圖5所示，相較于陰性對照組，模型組上述基因的表達水平均顯著增加(P< 0.01)；與模型組相比，低、中、高濃度RBPEE組IL-6和TNF-α的基因表達水平顯著降低(P< 0.05，P< 0.01)；中、高濃度RBPEE組IL-2的基因表達水平顯著降低(P< 0.05，P< 0.01)。上述結果表明，給予RBPEE預處理后，可以顯著降低ISO對H9c2心肌細胞造成的炎癥反應，提高細胞的抗炎能力。

圖5 RBPEE處理對心肌細胞炎癥相關指標基因表達的影響(n = 3)Fig.5 Effect of RBPEE treatment on the gene expression of inflammation-related factors in cardiomyocytes (n = 3) 注：與陰性對照組相比，** P < 0.01；與模型組相比，# P < 0.05，## P < 0.01。Note:Compared with negative control,** P < 0.01;Compared with model, # P < 0.05,## P < 0.01.

2.6 RBPEE對心肌細胞中凋亡相關指標mRNA表達的影響

在RBPEE處理后，B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相關X蛋白(Bax)、半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、半胱氨酸蛋白酶-8(Caspase-8)和半胱氨酸蛋白酶-9(Caspase-9)的mRNA表達水平變化情況如圖6所示，模型組中上述基因的表達水平相較于陰性對照組均有顯著變化(P< 0.01)：除抗凋亡基因Bcl-2的基因表達水平和Bcl-2/Bax的比值顯著降低外，其余四個基因的表達水平都顯著提高；在低、中、高濃度的RBPEE處理后，Bax的基因表達水平相較于模型組顯著降低(P< 0.01)，而Bcl-2的基因表達水平以及Bcl-2/Bax的比值相較于模型組顯著提高(P< 0.05，P< 0.01)；在低、高濃度的RBPEE處理后，Caspase-3的基因表達水平相較于模型組顯著降低(P< 0.05)；在高濃度的RBPEE處理后，Caspase-8和Caspase-9的基因表達水平相較于模型組顯著降低(P< 0.01)。上述結果表明RBPEE可以通過調節(jié)細胞凋亡相關基因的表達而降低ISO誘導的H9c2心肌細胞肥大損傷。

圖6 RBPEE處理對心肌細胞凋亡相關指標基因表達的影響(n = 3)Fig.6 Effect of RBPEE treatment on the gene expression of apoptosis-related factors in cardiomyocytes (n = 3)注：與陰性對照組相比，** P < 0.01；與模型組相比，# P < 0.05，## P < 0.01。Note:Compared with negative control,** P < 0.01;Compared with model, # P < 0.05,## P < 0.01.

3 討論與結論

CH的特征主要有心肌細胞體積增大、蛋白質合成增加、質量變大以及心室壁增厚。ANP、BNP和β-MHC作為CH的分子標記物，它們在CH進程中再表達，由心肌細胞自主產生和釋放，積極參與補償機制，調節(jié)心臟功能[5]。在本研究中，心肌細胞表面積明顯增大，總蛋白含量顯著增加以及三種心肌細胞肥厚性標志物的mRNA表達水平顯著提高，表明ISO誘導心肌細胞肥大模型成功。使用RBPEE處理后，細胞表面積和總蛋白含量相較于模型組有顯著縮減，三種心肌細胞肥大標志物mRNA的表達水平也有顯著降低，表明RBPEE對ISO誘導的心肌細胞肥大具有較好的預防效果。

正常情況下，由于機體可以通過SOD等抗氧化酶類以及GSH、類胡蘿卜素以及維生素C等非酶類抗氧化物等物質來及時清除組織氧化代謝產生的過量自由基，從而保證機體內自由基實現(xiàn)動態(tài)平衡，維持機體正常運作[10]。氧化應激的損傷途徑主要是通過活性氧(ROS)與細胞內的脂質、蛋白質和核酸等生物大分子發(fā)生過氧化反應，引起細胞結構損傷與代謝障礙，進而引發(fā)各種疾病。當細胞膜受ROS攻擊時，膜上磷脂分子中的不飽和脂肪酸氧化生成MDA等脂質過氧化物。因此機體細胞受氧化損傷的程度通過細胞內SOD活力、GSH含量以及MDA含量的變化來反映[11,12]。NF-κB途徑被認為是促炎信號傳導途徑，經(jīng)氧化應激反應激活的NF-κB可以從細胞質轉運到細胞核，從而促進細胞促炎介質的轉錄，如IL-6和TNF-α等[13]。因此檢測促炎癥細胞因子的表達量可以判斷心肌細胞受炎癥反應的影響程度。我們利用ISO誘導的心肌細胞肥大會使細胞中的SOD活力和GSH含量顯著降低，MDA含量顯著升高，心肌細胞中IL-6、TNF-α和IL-2的mRNA表達水平顯著提高，表明心肌細胞肥大伴隨著氧化應激和炎癥反應的發(fā)生。當RBPEE處理后，SOD活力和GSH含量顯著增加、MDA含量顯著降低、三種炎癥反應因子的基因表達水平顯著降低，表明RBPEE可以通過抑制氧化應激和炎癥反應來預防ISO對心肌細胞的損傷作用。

細胞凋亡的主要途徑有外源性途徑(死亡受體途徑)、內源性線粒體途徑和內質網(wǎng)應激途徑[14]。在死亡受體途徑中，Caspase-8在被死亡誘導信號復合物(DISC)激活后，啟動信號級聯(lián)反應，導致末端效應器Caspase-3或Caspase-7等的自動活化，最終誘發(fā)細胞凋亡信號[14]。在線粒體途徑中，當線粒體受到外界刺激后，Bcl-2家族中的凋亡促進因子Bax調控線粒體外膜通透性，促使線粒體外膜透化，導致線粒體膜腔隙內的細胞色素C與三磷酸脫氧腺苷(dATP)、凋亡蛋白酶激活因子(APAF1)形成凋亡多聚體復合物，釋放至胞漿，招募半胱氨酸蛋白酶9前體(pro-Caspase-9)，引起Caspase-9活化，啟動信號級聯(lián)反應，激活下游的Caspase-3，誘導細胞凋亡[14]。Bcl-2是Bcl-2家族中的抗凋亡成員，Bcl-2與Bax的比值是評價心肌細胞凋亡的一個有效指標[11]。在本實驗中，通過測定各處理組中Bcl-2、Bax、Caspase-8、Caspase-9和Caspase-3的基因表達水平來判斷心肌細胞凋亡情況。實驗結果顯示ISO誘導心肌細胞肥大損傷伴隨著細胞凋亡進程。RBPEE預處理對Caspase-8、Caspase-9、Caspase-3和Bax的基因表達水平具有顯著的抑制作用，Bcl-2的基因表達水平和Bcl-2/Bax的比值較模型組顯著升高，表明RBPEE對ISO誘導的心肌細胞凋亡具有預防作用。

本實驗采用UPLC-QTOF MS對RBPEE的化學成分進行定性分析，初步鑒定了RBPEE中7種主要成分，包括1個糖類(葡萄糖酸)、2個核苷類(尿苷和鳥苷)、1個多胺類(N′,N′′-雙(對香豆酰)亞精胺)和3個黃酮二糖苷類化合物(槲皮素-3-O-(2′′-O-吡喃葡萄糖基)-吡喃葡萄糖苷、槲皮素-3-O-(2′′-O-吡喃葡萄糖基)-鼠李糖苷和山奈酚-3-O-(2′′-O-吡喃葡萄糖基)-吡喃葡萄糖苷)。研究表明尿苷和鳥苷都具有抗氧化、抗炎和抗凋亡作用[15-17]；N1,N5-雙(對香豆酰)亞精胺具有良好的抗氧化性，可以提高細胞中總抗氧化能力，提高細胞中抗氧化酶SOD、CAT和GPx的酶活性，降低脂質氧化水平[18]；黃酮二糖苷類化合物的苷元如槲皮素、山奈酚具有抗氧化、抗炎、抗凋亡等藥理作用[19,20]。因此，核苷類、多胺類和黃酮類化合物可能是RBPEE發(fā)揮抗氧化、抗炎和抗凋亡作用的有效成分。

綜上，RBPEE對ISO誘導的心肌細胞肥大具有一定的預防作用，其作用機制可能與降低氧化應激水平、抑制炎癥反應和抗凋亡作用密切相關。