葉長文，羅凱玉，陳 宸，賈 楠，李 棟，李青常，范 黎，賀 琛*

1.中國煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術產業(yè)開發(fā)區(qū)楓楊街2號450001 2.河南農業(yè)大學煙草學院，鄭州市金水區(qū)農業(yè)路63號 450002

芽胞桿菌屬細菌因其具有抗性強、耐高溫、生長快以及對營養(yǎng)要求不高等特點，在煙葉發(fā)酵和醇化過程中一直以優(yōu)勢菌群存在［1-2］。張鴿等［3-4］、杜佳等［5］采用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)鑒別法，分別對雪茄煙葉葉面、茄衣發(fā)酵過程中細菌多樣性及演替進行了試驗，均證實芽胞桿菌屬為雪茄煙葉發(fā)酵過程中絕對優(yōu)勢細菌群，并在國內外雪茄外包皮中分離鑒定出了枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis）、巨大芽胞桿菌（Bacillus megaterium）、蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus）、蕈狀芽胞桿菌（Bacillus mycoides）和解淀粉芽胞桿菌（Bacillus amyloliquefa?ciens）等細菌。其中蠟樣芽胞桿菌為食源性條件下的致病菌，廣泛存在于土壤、水、空氣和動植物體中，當蠟樣芽胞桿菌量大于1×105CFU/g時，該菌能產生大量腹瀉型腸毒素和致嘔吐型腸毒素，從而引起人或動物中毒［6-8］。而目前有關雪茄煙葉中蠟樣芽胞桿菌的研究尚鮮見報道。因此，有必要建立有效的檢測方法對雪茄煙葉蠟樣芽胞桿菌進行準確檢測。

國內外食品和飼料行業(yè)出臺了蠟樣芽胞桿菌的相關標準檢測方法，如ISO 7932∶2004［9］、GB 4789.14—2014［10］和美國FDA官方檢測方法［11］等，這些方法均采用甘露醇卵黃多黏菌素瓊脂（MYP）培養(yǎng)基對蠟樣芽胞桿菌進行初步分離鑒定，然而芽胞桿菌屬為雪茄煙葉菌群中的優(yōu)勢菌屬，蕈狀芽胞桿菌、枯草芽胞桿菌和巨大芽胞桿菌等同屬細菌的形態(tài)特征、生理生化特征與蠟樣芽胞桿菌相似，其具有極高的DNA同源性［12］。而MYP培養(yǎng)基選擇性不強，易受到能產生卵磷脂酶或發(fā)酵甘露醇的其他芽胞桿菌和葡萄球菌等背景菌的干擾，且卵磷脂沉淀環(huán)易發(fā)生擴散重疊和交連，給計數(shù)和鑒定造成一定困難［13-15］。一般情況下需再進行分離培養(yǎng)、鏡檢觀察、生化鑒定等，整個過程至少需要3～5 d，操作復雜且費力，不能滿足微生物快速準確檢測的需要［15］。隨著微生物檢測技術的發(fā)展，顯色培養(yǎng)基利用目標菌中特異性酶水解培養(yǎng)基中顯色底物使菌落體顯色，較傳統(tǒng)選擇培養(yǎng)基的特異性和選擇性更強，被廣泛應用于微生物的快速檢測［16］。張淑紅等［13］和滕昆侖等［15］分別研制了蠟樣芽胞桿菌顯色培養(yǎng)基，并對食品中蠟樣芽胞桿菌檢測效果進行了初步評價。然而，煙葉基質和菌群結構與食品差異較大，顯色培養(yǎng)基的適用性需進行驗證。為此，采用一種新型的蠟樣芽胞桿菌顯色培養(yǎng)基——COMPASS?顯色培養(yǎng)基［17］，驗證其在雪茄煙葉中蠟樣芽胞桿菌檢測的適宜性，并對比分析COMPASS培養(yǎng)基和傳統(tǒng)MYP培養(yǎng)基的選擇性、特異性和靈敏度，評價COMPASS顯色培養(yǎng)基法和ISO 7932兩種方法對雪茄煙葉樣品中蠟樣芽胞桿菌的檢測效果，旨在找到一種快速分離和培養(yǎng)出雪茄煙葉中蠟樣芽胞桿菌，并能進行準確計數(shù)的方法。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

24份雪茄煙葉原料樣品分別來自5個國家，其中1#～3#、7#、11#和12#產地國為古巴，4#、15#和16#的產地為多米尼加，5#、8#～10#、13#、14#和19#產地為印度尼西亞，17#和18#產地為巴西，其他樣品產地為中國。

目標菌株：蠟樣芽胞桿菌［CMCC（B）63303］；非目標菌株：短小芽胞桿菌［Bacillus pumilus,CMCC（B）63202］、解淀粉芽胞桿菌（AS1.892）、枯草芽胞桿菌（ATCC 6633）、蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis,AS1.788）、蕈狀芽胞桿菌（ATCC 6462）、巨大芽胞桿菌（ACCC 11107）、大腸桿菌（Escherichia coli,ATCC 25922）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus,ATCC 6538）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa,ATCC 27853）、腸道沙門氏菌腸道亞種鼠傷寒血清型［Salmonella entericasubsp.entericaserovar Typhimurium,ATCC 14028］、多黏類芽胞桿菌（Paenibacillus polymyxa,ATCC 7047）、屎 腸 球 菌（Enterococcus faecium,ATCC 19434）、塞 氏 檸 檬 酸 桿 菌（Citrobacter sedlakii,ATCC 51115）、鮑 曼 不 動 桿 菌（Acinetobacter baumnnii,ATCC 19606）、陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae,ATCC 13047）、緩慢葡萄球菌（Staphylococcus lentus,ATCC 700403）、弗氏檸檬酸桿菌（Citrobacter freundii,ATCC 43864）、表皮葡萄球菌［Staphylococcus epidermidis,CMCC（B）26069］共18株標準菌株；蠟樣芽胞桿菌凍干定量質控菌株（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，Q-Strain103系列，菌含量110~1 100 CFU/瓶）。

1.2 培養(yǎng)基

甘露醇卵黃多黏菌素瓊脂即用型平板（MYP）、胰酪胨大豆羊血瓊脂即用型平板（TSSB）（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）；COMPASS顯色培養(yǎng)基基礎、COMPASS顯色培養(yǎng)基補充劑（法國Biokar公司）；營養(yǎng)瓊脂、硫酸錳營養(yǎng)瓊脂、蠟樣芽胞桿菌干制生化鑒定試劑盒（北京陸橋技術股份有限公司）；革蘭氏染色試劑盒（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 特異性和選擇性試驗

取1株蠟樣芽胞桿菌和18株非目標菌的標準菌株復蘇后，用1μL接種環(huán)取1環(huán)劃線接種至MYP和COMPASS平板上，按產品說明書［17］進行制備，觀察各試驗菌株在平板上的菌落顏色和形態(tài)特征，并比較兩種培養(yǎng)基的特異性。

依據(jù)標準GB 4789.28—2013［18］進行培養(yǎng)基的選擇性驗證，將19株復蘇后的標準菌株在MYP和COMPASS平板進行半定量劃線，每種培養(yǎng)基2個平行試驗，在恒溫恒濕培養(yǎng)箱中36℃培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)后觀測，若每條劃線均有較稠密菌落生長則生長指數(shù)（G）為1；僅一半的劃線有菌落稠密生長,G為0.5；劃線上沒有菌落生長、生長量低于劃線的一半或菌落生長微弱，G為0。計算每個平板的得分總和，求得平均值后即得到G值。

1.3.2 靈敏度試驗

在蠟樣芽胞桿菌凍干定量質控菌株中添加1.1 mL復蘇液，振蕩使充分溶解混勻，得到100～1 000 CFU/mL的菌懸液。取該菌懸液0.1 mL并加入到0.9 mL無菌磷酸鹽緩沖液中混勻，得到10～100 CFU/mL的菌懸液。再將這兩種菌懸液分別取0.1 mL涂布至營養(yǎng)瓊脂（NA）、MYP和COMPASS平板上，每種培養(yǎng)基3次平行試驗。在恒溫恒濕培養(yǎng)箱中36℃培養(yǎng)24 h，觀察并記錄菌落數(shù)量和形態(tài)。

1.3.3 人工污染樣品檢測

純陽性標準菌株人工污染樣品檢測：準確稱取25 g經121℃、20 min滅菌處理的雪茄煙葉樣品于均質袋中，加入225 mL無菌磷酸鹽緩沖液進行均質處理，得到無菌樣品均質液。取1 mL 100～1 000 CFU/mL的蠟樣芽胞桿菌懸液加入到9 mL的無菌均質液內，得到10～100 CFU/mL菌懸液，再將其稀釋至5～50 CFU/mL，然后分別取1 mL接種至MYP和COMPASS培養(yǎng)基中，每種培養(yǎng)基3次平行試驗。在恒溫恒濕培養(yǎng)箱中36℃培養(yǎng)24 h。

混合菌液人工污染樣品檢測：將蠟樣芽胞桿菌和至少在1種培養(yǎng)基中可生長的6株代表性非目標菌株（短小芽胞桿菌、枯草芽胞桿菌、蕈狀芽胞桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和屎腸球菌）復蘇后，各用1μL接種環(huán)取1環(huán)加入至9 mL無菌樣品均質液中，充分研磨搖勻，按10倍濃度梯度稀釋至1×10-3、1×10-4、1×10-5，取各梯度稀釋液1 mL接種至MYP和COMPASS培養(yǎng)基上。每個稀釋度3次平行試驗，于恒溫恒濕培養(yǎng)箱中36℃培養(yǎng)24 h。觀察目標菌的檢出和非目標菌的干擾情況。

1.3.4 雪茄煙葉樣品檢測

無菌操作條件下準確稱取25 g雪茄煙葉樣品至均質袋中，加入225 mL無菌磷酸鹽緩沖液后進行均質，將樣品勻液依次稀釋并制成1×10-2、1×10-3梯度稀釋液，分別采用ISO 7932方法和COMPASS方法進行檢驗。每個稀釋度3次平行試驗，并置于30℃條件下培養(yǎng)24 h，見圖1。其中ISO 7932方法計數(shù)典型菌落數(shù)后，需挑取計數(shù)平板上5個典型菌落（小于5個則全選）進行純培養(yǎng)，再劃線接種至TSSB培養(yǎng)基上進行確證，觀察溶血反應，在MYP平板上典型菌落呈現(xiàn)微粉紅色，周圍有白色至淡粉紅色沉淀環(huán)。而COMPASS方法無需進行純化和確證實驗，直接計數(shù)直徑大于1 mm（涂布接種）或大于0.5 mm（傾注接種）的綠色菌落。

圖1 ISO 7932和COMPASS方法的檢驗程序Fig.1 Detection procedures of the ISO 7932 method and the COMPASS method

1.3.5 鑒定確證

1#～7#雪茄煙葉樣品檢測過程中從每個MYP和COMPASS平板上至少挑取5個菌落（少于5個全選）劃線接種至營養(yǎng)瓊脂平板進行純培養(yǎng)后，挑取純培養(yǎng)的單個菌落，依據(jù)文獻［19］的方法，采用革蘭氏染色鏡檢、動力、硝酸鹽還原、甘露醇產酸、溶菌酶耐性、V-P反應、葡萄糖利用（厭氧）、根狀生長、溶血（羊紅細胞）和蛋白質毒素結晶等試驗進行鑒定。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 22軟件對典型菌落計數(shù)結果進行均值t檢驗。

2 結果與討論

2.1 特異性分析

試驗菌株在兩種培養(yǎng)基上的形態(tài)描述和圖片分別見表1和圖2，菌株在兩種培養(yǎng)基上呈現(xiàn)出不同的菌落形態(tài)和顏色。在MYP培養(yǎng)基上，蠟樣芽胞桿菌、蘇云金芽胞桿菌和蕈狀芽胞桿菌呈現(xiàn)粉紅色或淡粉紅色，周圍皆有白色至淡粉紅色沉淀環(huán)，三者較難區(qū)分。短小芽胞桿菌、枯草芽胞桿菌、解淀粉芽胞桿菌、多黏類芽胞桿菌、巨大芽胞桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、表皮葡萄球菌和屎腸球菌共9株細菌皆能生長，且能產生黃色或乳白色沉淀環(huán)，這可能與其含有葡萄糖苷酶有關［14］，但與蠟樣芽胞桿菌典型菌落顏色和形態(tài)特征存在明顯區(qū)別。大腸桿菌、沙門氏菌、塞氏檸檬酸桿菌、弗氏檸檬酸桿菌、緩慢葡萄球菌、鮑曼不動桿菌和陰溝腸桿菌共7株細菌在MYP培養(yǎng)基上均不能生長。而在COMPASS培養(yǎng)基上，2株蠟樣芽胞桿菌呈直徑大于1 mm的綠色菌落，蘇云金芽胞桿菌與蠟樣芽胞桿菌形態(tài)和顏色特征相似，綠色顯色物質沉淀在菌落上未發(fā)生擴散，較容易觀察計數(shù)。而屎腸球菌的形態(tài)和顏色與蠟樣芽胞桿菌有明顯區(qū)別，其他16株非目標菌無菌落生長?？梢姡cMYP培養(yǎng)基相比，COMPASS培養(yǎng)基特異性更強。

表1 兩種培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)比較Tab.1 Colony morphologies of tested strains in two media

圖2 兩種培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)比較Fig.2 Colony morphologies of tested strains in two media

2.2 選擇性分析

兩種培養(yǎng)基的選擇性結果見表2，COMPASS培養(yǎng)基選擇性優(yōu)于MYP培養(yǎng)基。目標菌株在兩種培養(yǎng)基上的生長指數(shù)（G值）均大于6，且呈現(xiàn)典型的生長形態(tài)，根據(jù)GB 4789.28—2013［18］這兩種培養(yǎng)基是可以接受的，而18種非目標菌株在COMPASS和MYP培養(yǎng)基的G值均不大于6，說明其在兩種培養(yǎng)基上生長受到不同程度的抑制。在COMPASS培養(yǎng)基上，除蘇云金芽胞桿菌和屎腸球菌以外，其他16種非目標菌株皆被完全抑制（G=0），抑制率達88.9%（16/18）。對于MYP培養(yǎng)基，G值為0的非目標菌株僅占38.9%（7/18），而6株非目標芽胞桿菌的G值均大于0，其中解淀粉芽胞桿菌的G值為6.0，說明未被完全抑制?？梢姡珻OMPASS培養(yǎng)基的選擇性明顯優(yōu)于MYP培養(yǎng)基。

表2 試驗菌株在兩種培養(yǎng)基上的選擇性比較Tab.2 Selectivity of tested strains in two media

2.3 靈敏度分析

MYP、COMPASS和NA培養(yǎng)基3種平板上接種10～100 CFU和1～10 CFU兩個水平的菌落數(shù)見表3。t檢驗結果表明,在同一接種量水平下，MYP、COMPASS和NA平板上生長的菌落數(shù)量差異不顯著（P>0.05），說明MYP和COMPASS兩種選擇性培養(yǎng)基不會影響目標菌的菌落數(shù)量。同時，從1～10 CFU接種水平來看，3種培養(yǎng)基之間的靈敏度相當，檢測靈敏度都可達到1～10 CFU。

表3 試驗菌株在3種培養(yǎng)基上的靈敏度比較①Tab.3 Sensitivities of tested strains in three media（CFU）

2.4 人工污染樣品檢測分析

2.4.1 純陽性標準菌株人工污染樣品

經純陽性標準菌株人工污染處理后的雪茄煙葉樣品，在兩種培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)見圖3。在COMPASS培養(yǎng)基上，菌株呈典型生長，菌落呈圓形或近似圓形，不透明綠色，似熔蠟狀，直徑大于1 mm；在MYP培養(yǎng)基上，均呈微粉色帶暈圈，說明雪茄煙葉基質顏色未影響蠟樣芽胞桿菌的典型菌落形態(tài)特征。兩種培養(yǎng)基上菌落計數(shù)和統(tǒng)計分析結果見表4，在同一接種水平和雪茄煙葉基質環(huán)境下，MYP和COMPASS培養(yǎng)基目標菌落數(shù)量差異不顯著（P>0.05）,說明雪茄煙葉成分未能抑制MYP和COMPASS培養(yǎng)基目標菌落的生長。

表4 陽性標準菌株人工污染樣品在兩種培養(yǎng)基上的菌落數(shù)量比較Tab.4 Number of colonies for artificially contaminated positive standard strain in two media （CFU）

圖3 人工污染樣品在兩種培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)比較Fig.3 Colony morphologies of artificially contaminated samples in two media

2.4.2 混合菌株人工污染樣品

蠟樣芽胞桿菌和6株非目標菌株混合污染樣品檢測結果見表5。t檢驗結果表明，在同一接種水平下兩種培養(yǎng)基間菌落數(shù)存在顯著差異（P＜0.05）。造成差異的原因可能是非目標菌株對培養(yǎng)基檢測結果產生影響，特別是短小芽胞桿菌、枯草芽胞桿菌、蕈狀芽胞桿菌等非目標芽胞桿菌屬菌株均能使MYP培養(yǎng)基中卵黃分解而產生暈環(huán)，致使發(fā)生接合生長［14］，干擾目標菌數(shù)量的計數(shù)。

2.5 雪茄煙葉實際樣品檢測分析

2.5.1 兩種方法比較

采用ISO 7932和COMPASS兩種方法同時檢測7份雪茄煙葉中蠟樣芽胞桿菌，所得計數(shù)結果及其對數(shù)值見表6。兩個方法檢測結果處于同一數(shù)量級內，數(shù)量基本一致，t檢驗結果表明COMPASS與ISO 7932方法的實際樣品檢測結果差異不顯著（P>0.05），且COMPASS方法通過直接觀察菌落顏色形態(tài)就可對蠟樣芽胞桿菌進行快速計數(shù)，特別是對陰性樣品和污染較輕的樣品在24 h內可報告結果，縮短了檢驗時間，提高了檢測效率。

表6 兩種檢測方法檢測結果比較Tab.6 Detection results by two methods

同一樣品相同稀釋度涂布接種兩種平板培養(yǎng)后典型菌落見圖4，MYP平板由于雜菌過度生長，使目標菌被遮擋，出現(xiàn)了蔓延情況，且雜菌的顏色和形態(tài)會對典型菌落計數(shù)造成較大影響，導致判讀困難，無法計數(shù)。而COMPASS平板上綠色菌落清晰可見，較易判讀和計數(shù)。COMPASS培養(yǎng)基內含的顯色底物被蠟樣芽胞桿菌中特征性酶水解，所含的選擇性抑菌劑可抑制其他芽胞桿菌（如巨大芽胞桿菌、蕈狀芽胞桿菌等）和非芽胞桿菌的生長，從而實現(xiàn)選擇性分離的目的，無需進行純培養(yǎng)、革蘭氏染色和生化鑒定等步驟。因此，COMPASS方法替代ISO 7932方法對雪茄煙葉蠟樣芽胞桿菌的檢測是可行的。

圖4 實測樣品在兩種培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)比較Fig.4 Colony morphologies of actual samples in two media

2.5.2 鑒定確證

在上述7份雪茄煙葉樣品檢測過程中，從MYP平板上共挑取92個典型菌落進行生理生化鑒定，確證為陽性的有87個，陽性檢出率為94.6%（87/92）；從COMPASS平板上共挑取85個典型菌落進行生化鑒定，被確證陽性共82個，陽性檢出率為96.4%（82/85）。說明MYP和COMPASS培養(yǎng)基陽性率已達到較高水平，而COMPASS培養(yǎng)基準確性更高，假陽性率更低。從10項鑒定試驗結果看，蘇云金芽胞桿菌是最難區(qū)分的一種假陽性菌，其在MYP和COMPASS培養(yǎng)基皆不能與蠟樣芽胞桿菌區(qū)分，而蛋白質毒素結晶試驗是證實假陽性的最有效手段。

2.5.3 實際樣品檢測分析

COMPASS法檢測實際雪茄煙葉樣品的結果見表7。在采集的24份樣品中，共檢出蠟樣芽胞桿菌陽性樣品20份，檢出率達83.3%，這可能與蠟樣芽胞桿菌耐熱的生物學特性有關，其游離芽胞能在100℃時耐受30 min，在調制后煙葉中仍能存活。從檢出數(shù)值來看，檢出值范圍為1.0×10～1.3×104CFU/g，其中有2個和4個樣品菌含量分別達到104和103數(shù)量級。從各產地分析，發(fā)現(xiàn)古巴的煙葉樣品中蠟樣芽胞桿菌平均含量最高，其后依次為多米尼加、中國、印度尼西亞和巴西。

表7 雪茄煙葉樣品COMPASS方法的檢測結果Tab.7 Detection results of cigar tobacco leaf samples by the COMPASS method

蠟樣芽胞桿菌致病風險與其含量密切相關，當食品中蠟樣芽胞桿菌大于1×105CFU/g時，該菌能產生大量腹瀉型腸毒素和致嘔吐型腸毒素，從而引起食物中毒［7,12］。雖然24個雪茄煙葉樣品檢出值皆低于澳大利亞和新西蘭、英國等國對蠟樣芽胞桿菌在即食食品中1×105CFU/g的限量規(guī)定［20］，但雪茄與食品的消費方式不同，其檢出率和檢出值在一定程度上提示雪茄煙葉中仍存在蠟樣芽胞桿菌的潛在風險。

3 結論

通過COMPASS和ISO 7932兩種方法檢測結果比較發(fā)現(xiàn)：①COMPASS培養(yǎng)基在選擇性、特異性和靈敏度方面優(yōu)于ISO 7932使用的MYP培養(yǎng)基；②COMPASS方法較省時且簡便；③COMPASS方法與ISO 7932在檢測結果上無顯著差異。因此，COMPASS方法可作為ISO標準方法的有效替代方法，用于雪茄煙葉樣品蠟樣芽胞桿菌的快速檢測。