王金棒，邱紀青，汪志波，鄭 路，洪群業(yè)，劉亞麗，鄭新章

中國煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)楓楊街2號 450001

煙葉發(fā)酵是煙草加工過程的一項重要工序，發(fā)酵效果的好壞直接影響到煙葉的內(nèi)在品質(zhì)及其可用性。煙葉發(fā)酵的實質(zhì)是在設(shè)定的溫度和相對濕度條件下，促使煙葉的理化特性發(fā)生改變。在這一過程中，微生物、酶等生物制劑起到了關(guān)鍵性作用，通過物理、生理生化和化學(xué)反應(yīng)促使一系列大分子物質(zhì)的降解和香氣物質(zhì)的形成，進而在一定程度上消除底物存在的缺陷，如香氣粗糙、刺激性大、土雜氣重等。一般煙草工業(yè)企業(yè)內(nèi)煙葉陳化多采用自然發(fā)酵法，但耗時通常較長，周期約1~2年，占用大量的倉庫和資金。鑒于煙葉陳化過程中生物制劑的獨特功能（專一性和高活性），通過人工施加生物制劑，并控制發(fā)酵周期來加速煙葉的醇化得到煙草行業(yè)廣泛的關(guān)注和應(yīng)用。專利制度是指國際上通行的通過法律手段確認發(fā)明人對其發(fā)明享有專有權(quán)，以保護和促進技術(shù)傳播為目的的一種制度，以便實現(xiàn)更廣泛的技術(shù)信息交流和技術(shù)的及時有償轉(zhuǎn)化。相比于其他類文獻來源，專利文獻所提供的信息更能夠全面反映某一技術(shù)領(lǐng)域的發(fā)展現(xiàn)狀和前沿動態(tài)。專利情報分析能夠避免因信息缺乏而導(dǎo)致的“再發(fā)明”和“再研發(fā)”等重復(fù)性研究工作。據(jù)世界知識產(chǎn)權(quán)組織估算，合理有效地利用專利信息平均可以縮短60%的技術(shù)研發(fā)周期和節(jié)約40%的研發(fā)經(jīng)費［1］。

鑒于此，為深入分析和準確研判生物技術(shù)（微生物和酶）在煙葉發(fā)酵領(lǐng)域的發(fā)展態(tài)勢，以國家知識產(chǎn)權(quán)局公開/公告的應(yīng)用于煙草的生物技術(shù)發(fā)酵類專利為分析對象，采用定量分析和對比分析法著重從專利申請人、技術(shù)主題以及具體技術(shù)分支等角度進行了文獻計量學(xué)分析，旨在為廣大科研人員的科研選題、提高科研效率等提供重要參考。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象

本研究的對象為1985—2019年間國家知識產(chǎn)權(quán)局公開/公告的318件基于生物技術(shù)（微生物或酶）的煙草人工發(fā)酵或醇化類專利。除1件為實用新型專利外，其余均為發(fā)明專利。

1.2 數(shù)據(jù)獲取方法

本研究中的專利原始數(shù)據(jù)來自國家知識產(chǎn)權(quán)局專利檢索及分析平臺（http：//www.pss-system.gov.cn）。數(shù)據(jù)檢索策略主要是利用關(guān)鍵詞“‘發(fā)酵或微生物或酶或菌’和‘煙草或煙葉或卷煙’”在專利標題、摘要、權(quán)利要求書及說明書全文中進行檢索，并對檢索得到的專利數(shù)據(jù)進行人工清洗和標引。

1.3 分析方法

采用Microsoft Excel 2010、Origin 9、ITGinsight對專利數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析和作圖，以實現(xiàn)對專利申請態(tài)勢、專利申請人和技術(shù)主題分布的分析。

節(jié)點中心性是社會網(wǎng)絡(luò)分析方法中常用的指標，包括點度中心度（Degree centrality，CD）、接近中心度和中介中心度3種。其中，點度中心度是利用網(wǎng)絡(luò)中與某一節(jié)點直接相連的其他節(jié)點的個數(shù)計算節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中地位的指標，可反映某一節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中的中心位置或重要性［2-3］。本研究中借助ITGinsight軟件計算點度中心度用于專利技術(shù)布局熱點的篩選，其計算公式為：

式中：d（ni）為節(jié)點的度，即節(jié)點ni所擁有的聯(lián)系數(shù)量；m是網(wǎng)絡(luò)內(nèi)節(jié)點的總數(shù)，m-1為網(wǎng)絡(luò)內(nèi)節(jié)點可能存在的最大聯(lián)系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 專利申請態(tài)勢

2.1.1 專利申請年度分布

從專利申請的年度變化趨勢（圖1）分析可知，生物技術(shù)在煙葉發(fā)酵領(lǐng)域的專利申請可分為3個階段：①1985—2000年期間，專利的數(shù)量較少，年度申請量為0~1件，處于起步階段，國內(nèi)煙草行業(yè)最早進行該領(lǐng)域?qū)＠暾埖氖浅５戮頍煆S，早在1996年就申請了“利用微生物發(fā)酵提高煙草品質(zhì)的方法”［4］的專利，主要內(nèi)容為從煙草中提取、分離出芽孢桿菌科微生物，經(jīng)培養(yǎng)后施加到煙草上，能夠明顯縮短發(fā)酵周期，煙葉發(fā)酵5~12 d或煙絲/梗絲/再造煙葉絲發(fā)酵2~36 h，其顏色即可提高半個等級以上，香氣量和香氣質(zhì)純正，卷煙持火力增強，使用價值可提高一個檔次以上；②2002—2009年，相關(guān)專利申請逐漸增多，申請量年度分布較為平穩(wěn)，年平均為6件；③從2010年開始，專利申請進入快速發(fā)展期，2011年后年度平均申請量維持在25件左右，且整體呈增加態(tài)勢。

圖1 1985—2019年間生物技術(shù)在煙葉發(fā)酵領(lǐng)域的專利年度申請情況Fig.1 Annual distribution of patent applications related to tobacco bio-fermentation from 1985 to 2019

2.1.2 專利申請人分析

按申請人類別對檢索到的專利按國內(nèi)（國內(nèi)煙草企業(yè)、國內(nèi)其他企業(yè)、國內(nèi)煙草科研機構(gòu)、國內(nèi)其他科研院所、國內(nèi)大學(xué)、國內(nèi)個人）和國外（國外煙草企業(yè)、國外其他企業(yè)、國外個人）類別進行標引并統(tǒng)計分析，結(jié)果見圖2?？芍瑖鴥?nèi)煙草企業(yè)在該領(lǐng)域的專利申請量具有絕對優(yōu)勢，占專利總量的58.9%，其次是國內(nèi)大學(xué)和國內(nèi)其他單位。

圖2 申請人類型分布情況Fig.2 Distribution of the applicants for tobacco fermentation patents

為識別該領(lǐng)域的重要申請人，統(tǒng)計了各申請人的專利申請量，并列出了專利數(shù)量在5件以上的20位申請人的分布情況（圖3）。其中，排名前4位的均是國內(nèi)煙草行業(yè)工業(yè)企業(yè)，以云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司（云南中煙）的專利數(shù)量最多，其次是河南中煙、湖北中煙和川渝中煙，合計占前20位申請人總量的51.0%。說明在本技術(shù)領(lǐng)域，專利申請主體的集中度相對較高。

圖3 專利申請數(shù)量5件以上具體專利權(quán)人的分布情況Fig.3 Distribution of the specific applicants with more than 5 patents

圖4為國內(nèi)煙草企業(yè)獨立申請和合作申請專利分布情況圖?？芍?，國內(nèi)煙草企業(yè)共合作申請37件，占該屬性專利申請總量的17.8%；其中，在各合作申請主體的單位中，國內(nèi)大學(xué)的參與度最高，有27件相關(guān)合作申請，占合作申請總量的73.0%。另外，與國內(nèi)煙草企業(yè)的合作方式具有明顯的地域性特點，即中煙公司各法人單位主要與其所在地或附近省份的大學(xué)進行合作，申請量排名靠前的大學(xué)主要有鄭州輕工業(yè)大學(xué)、江南大學(xué)和西北農(nóng)林科技大學(xué)。申請人為國內(nèi)大學(xué)的專利共有52件，其中，合作申請專利27項，均是與國內(nèi)煙草企業(yè)合作完成。申請人為國內(nèi)其他單位的專利共有43件，合作專利（4件）的合作方均為煙草行業(yè)外其他企業(yè)或個人。

圖4 國內(nèi)煙草企業(yè)獨立申請和合作申請專利的分布情況Fig.4 Distribution of independent applications and cooperative applications of patents by domestic tobacco companies

2.2 IPC技術(shù)主題分析

專利技術(shù)的主題分布在一定程度上能夠反映出一定時期內(nèi)該領(lǐng)域中各創(chuàng)新主體所關(guān)注的技術(shù)研發(fā)熱點。IPC（International Patent Classification，國際專利分類）分類是目前國內(nèi)外通用的專利文獻分類和檢索的工具。為了進一步分析各專利申請人在該領(lǐng)域的技術(shù)研發(fā)態(tài)勢，對檢索到的國內(nèi)外專利按照IPC分類代碼小類（即國際專利分類號中的前4位）對其涉及的主題進行統(tǒng)計分析，共有27個小類，其中出現(xiàn)頻次2次以上的IPC小類分布情況見圖5。按照2018年版國際專利分類表，各主要IPC小類代碼所代表的內(nèi)容見表1。從圖5可知，生物技術(shù)煙葉發(fā)酵領(lǐng)域的技術(shù)研發(fā)主要集中在A24B小類，歸屬于煙草大類，其次是C12N和C12R兩個小類，歸屬于微生物或酶、組合物及其培養(yǎng)等技術(shù)類別，三者合計占專利頻次總量的93.3%，技術(shù)的集中度較高，且三者具有較強的關(guān)聯(lián)性，在專利文本中的共現(xiàn)頻率較高。在其他小類的分布極少，尤其是在機械設(shè)備等領(lǐng)域，說明30余年來，在煙葉生物技術(shù)發(fā)酵方面，研發(fā)重點在于微生物或酶等生物制劑的開發(fā)，且大多數(shù)生物處理技術(shù)均適用于卷煙工業(yè)現(xiàn)有的工藝設(shè)備。

圖5 1985—2019年煙葉生物技術(shù)發(fā)酵領(lǐng)域?qū)＠鸌PC頻次在2次以上的小類分布情況（a）以及各IPC小類在同一專利中的共現(xiàn)關(guān)系（b）Fig.5 Distribution of IPC subclasses with more than 2 patents related to tobacco bio-fermentation（a）and the co-occurrence relationship of each IPC subclasses in the same patent（b）from 1985 to 2019

表1 煙葉生物發(fā)酵領(lǐng)域主要IPC小類所對應(yīng)內(nèi)容Tab.1 Contents of the main IPC subclasses in the field of tobacco bio-fermentation

對于C12N小類，技術(shù)分布主要有C12N1/00（139次）、C12N9/00（88次）和C12N15/00（10次）3個大組。其中，C12N1/00大組的專利主要是C12N1/20（97次，細菌及其培養(yǎng)基），其次是C12N1/14（18次，真菌）和C12N1/02（11次，從其培養(yǎng)基中分離微生物）；C12N9/00大組的專利分布較為分散，出現(xiàn)頻次較多的主要是C12N9/42小組（16次，作用在β-1,4-糖苷鍵上，如纖維素酶）；C12N15/00大組的專利相對較少，且主要分布在C12N15/70（5次，專門適用于大腸桿菌的載體或表達系統(tǒng)）和C12N15/56（3次，作用于糖類化合物的酶，如淀粉酶、半乳糖苷酶、溶菌酶）2個小組。

對于C12R小類，技術(shù)全部分布在C12R1/00大組（微生物），主要分布在C12R1/07（35次，芽孢桿菌屬）、C12R1/125（21次，枯草芽孢桿菌）和C12R1/01（16次，細菌或放線菌目）3個小組。

2.3 專利技術(shù)整體分析

根據(jù)所采用生物試劑的種類（微生物、生物酶、植物酶、仿制酶）以及所使用對象的不同（煙葉、煙梗、再造煙葉和煙稈表皮）對檢索到的318件專利進行標引，統(tǒng)計分析結(jié)果見圖6?？梢?，在生物試劑種類方面，在單一專利技術(shù)中，往往以微生物類或生物酶類為主，其次是微生物+生物酶混合制劑，來源于植物的內(nèi)源酶或化學(xué)仿制酶技術(shù)的相關(guān)專利相對較少。在使用對象方面，絕大多數(shù)（73.0%）專利涉及煙葉的人工發(fā)酵，其次是煙梗（15.7%）和再造煙葉（10.7%）。

圖6 煙草生物發(fā)酵領(lǐng)域?qū)＠婕吧镏苿┓N類（a）及使用對象的分布情況（b）Fig.6 Distribution of types of biological reagents（a）and its objects in the field of tobacco bio-fermentation（b）

從生物發(fā)酵的功能效果分析，主要有13種。數(shù)據(jù)統(tǒng)計（圖7）顯示，生物發(fā)酵所達到的技術(shù)效果主要集中在減少雜氣、降低刺激性等以及提高卷煙的香氣量方面，其次是縮短煙葉的醇化周期。另外，通過生物技術(shù)降低煙堿、亞硝胺以及其他有害成分或有害成分前體物方面也有一定的專利申請。從各技術(shù)效果的共現(xiàn)關(guān)系分析，加速醇化和降刺增香2個功能的共現(xiàn)相關(guān)性最強，也是當(dāng)前生物技術(shù)發(fā)酵領(lǐng)域?qū)＠季值闹攸c。

圖7 煙草生物發(fā)酵領(lǐng)域?qū)＠婕凹夹g(shù)效果的分布情況（a）和技術(shù)效果共現(xiàn)情況（b）Fig.7 Distribution of technical effects involved in patents related to tobacco bio-fermentation（a）and its co-occurrence of technical effects（b）

依據(jù)國際專利分類法中C12R相關(guān)分類標準以及國際通行的“檢測細菌學(xué)Berger手冊”對檢索得到的人工發(fā)酵領(lǐng)域?qū)＠婕暗奈⑸锇凑铡皩佟边M行標引，并統(tǒng)計分析。結(jié)果（圖8）表明，專利所涉及微生物屬共40個，其中涉及專利數(shù)量3件及以上的有13個。在微生物中，芽孢桿菌屬的使用頻次最多，其次是酵母菌、乳酸菌、曲霉和假單胞菌，其余微生物屬的使用頻次相對較低，均在10次以下。

圖8 煙草生物發(fā)酵領(lǐng)域?qū)＠婕拔⑸锓N類的分布情況Fig.8 Distribution of microorganisms involved in patents in the field of tobacco bio-fermentation

對于芽孢桿菌屬，除17件專利未明確說明所述菌株外（例如僅提供好氣性芽孢桿菌、烤煙快速增香芽孢桿菌菌株等信息），對其余所述菌株的使用次數(shù)進行統(tǒng)計，結(jié)果見圖9?？梢?，使用頻次最多的芽孢桿菌主要有3種，分別是枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌。

圖9 芽孢桿菌屬所涉及微生物種類的分布情況Fig.9 Distribution of microorganisms involved in Bacillus

提取專利文本所涉及的生物酶（共47種）并統(tǒng)計分析，其中出現(xiàn)頻次為5次及以上的生物酶主要有14種（圖10）?？梢?，在各種生物酶中，出現(xiàn)頻次最多的主要是纖維素酶、果膠酶和蛋白酶，其次是淀粉酶。從各種生物酶在同一件專利中的共現(xiàn)情況（圖11）分析，排名靠前的這4種酶的相關(guān)性最大。此外，隨著社會網(wǎng)絡(luò)分析方法逐漸成為信息計量學(xué)研究的前沿和熱點，節(jié)點的重要性或在網(wǎng)絡(luò)中的位置可使用中心度進行度量［2-3］。同理，從生物酶各節(jié)點共現(xiàn)的點度中心度分析，除了重要程度最高的前4種主體酶（點度中心度為0.5~0.7）外，半纖維素酶、糖化酶、漆酶、木聚糖酶、葡萄糖氧化酶、煙堿脫氫酶、脂肪酶和木質(zhì)素酶的重要程度也相對較高，點度中心度介于0.2~0.4之間，也是未來專利布局的重點。

圖10 煙草生物發(fā)酵領(lǐng)域?qū)＠婕吧锩阜N類的分布情況Fig.10 Distribution of biological enzymes involved in patents of tobacco bio-fermentation

圖11 煙草生物發(fā)酵領(lǐng)域?qū)＠锩傅墓铂F(xiàn)情況Fig.11 Co-occurrence of biological enzymes involved in patents of tobacco bio-fermentation

2.4 加速煙葉發(fā)酵專利分析

相比于自然醇化，借助生物酶技術(shù)的人工發(fā)酵旨在保障醇化效果（如增香、降刺、減害等）的基礎(chǔ)上大幅度縮短煙葉醇化所需時間。目前，在卷煙工業(yè)中，煙葉或煙絲的醇化方式主要是離線處理。為進一步滿足在卷煙生產(chǎn)線上直接醇化的需求，尋求高活性生物酶及其配套設(shè)備等依然成為卷煙企業(yè)在該領(lǐng)域的重要關(guān)注點。根據(jù)專利技術(shù)所采用生物制劑種類的不同，可劃分為微生物制劑、生物酶或二者復(fù)合制劑3大類，按處理對象可大致分為煙葉、煙絲、煙梗、梗絲和再造煙葉等，其中以復(fù)烤后的烤煙煙葉為主。

為更好地反映生物制劑在加速煙葉發(fā)酵方面的顯著效果，對相關(guān)專利按照所需最短發(fā)酵時間進行標引，并以“d”（天）為單位進行換算和統(tǒng)計，發(fā)酵時間在15 d以內(nèi)的專利權(quán)人及其對應(yīng)醇化周期的分布情況見圖12?？梢?，施加微生物和酶均能大幅度縮短煙葉醇化周期，但各申請人的專利技術(shù)在加速的程度上差異顯著，相比于微生物類制劑，直接使用生物酶類制劑在縮短醇化時間方面更具優(yōu)勢，最短僅需10~15 min即可實現(xiàn)煙葉的在線快速發(fā)酵［5］。另外，需指出的是，相比于煙葉，煙絲的發(fā)酵更為迅速，可能是煙葉成絲后與生物制劑的接觸或混合更為充分所致，鑒于篇幅所限，本部分所述的技術(shù)分析主要以煙葉或片煙為主，少量涉及煙絲。

圖12 煙葉生物技術(shù)發(fā)酵專利申請人及其對應(yīng)最短醇化周期的分布情況Fig.12 Patent applicants for tobacco bio-fermentation and their technologies corresponding to the shortest aging periods

2.4.1 微生物菌劑

在煙葉基微生物菌劑方面，為使人工發(fā)酵后煙葉的品質(zhì)更接近于自然醇化，由煙葉表面分離并篩選煙草發(fā)酵微生物是獲得人工發(fā)酵菌株的一種十分重要的途徑?；趯＠暯牵现袩煶５戮頍煆S早在1996年就從煙草中分離、篩選出好氣性芽孢桿菌屬細菌，可分別將煙葉或煙絲的發(fā)酵時間縮短至5 d和2 h［4］。2019年，湖北中煙還從煙葉表面分離獲得了一種高效增香型芽孢桿菌Bacillussp.J3，其具有淀粉酶活性、蛋白酶活性和多聚谷氨酸合成能力等功能，可將煙葉發(fā)酵周期縮短至3 d，發(fā)酵后煙葉的香氣質(zhì)和香氣量也明顯提升［6］。此外，陜西中煙分離篩選出快速增香菌芽孢桿菌LBT1.0003［7］和枯草芽孢桿菌［8］；廣西中煙分離出芽孢桿菌Bacillussp.GYC30［9］；云南中煙分離出短小芽孢桿菌Bacillus pumilusVan35［10］；江西中煙分離出芽孢桿菌菌株BA-01［11］；華中農(nóng)業(yè)大學(xué)分離得到一株高地芽孢桿菌（Bacillus altitudinis）D2菌株等［12］，均能夠?qū)崿F(xiàn)煙葉的超快速發(fā)酵。

在其他單一菌劑方面，為進一步提高煙葉的整體感官品質(zhì)，廣西中煙和鄭州煙草研究院合作采 用 深綠 木霉（Trichoderma atroviride）C9-13菌株［13］、河南中煙采用高效降解煙葉淀粉的蘇云金芽孢桿菌XC-3菌株［14］、云南中煙采用洞穴芽球菌［15］以及四川中煙和湖北中煙分別采用一株異常威克漢姆酵母［16］和釀酒葡萄基天然酵母［17］等對煙葉進行快速醇化，有效降解了煙葉中的果膠、淀粉等高分子物質(zhì)，使煙葉內(nèi)在化學(xué)成分更加趨于協(xié)調(diào)。在其他功能領(lǐng)域，云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院采用熒光假單胞菌制劑處理烤煙煙葉，在24~48 h內(nèi)可降解24%的煙堿［18］；黑龍江煙草工業(yè)有限責(zé)任公司采用微生物節(jié)桿菌Z3或制取的酶制劑發(fā)酵3 d即可實現(xiàn)白肋煙煙葉向烤煙香型的轉(zhuǎn)化等［19］。

在復(fù)合微生物菌劑制備方面，通常在發(fā)酵過程中將兩種或兩種以上的微生物混合，然后施加到煙草表面進行快速發(fā)酵。在超快速發(fā)酵方面，微生物的篩選是關(guān)鍵。鄭州輕工業(yè)大學(xué)基于特定的發(fā)酵工藝和設(shè)備，采用降煙堿菌株Z3節(jié)桿菌、增香菌株GXY35菌、云芝菌培養(yǎng)液體、提取的粗酶液制成的混合菌劑處理煙葉，可將發(fā)酵時間縮短至6 h［20］。華南理工大學(xué)基于自然發(fā)酵煙葉上的優(yōu)勢菌株及產(chǎn)香菌株，通過將枯草芽孢桿菌、乳酸菌、酵母菌3種菌株混合制成復(fù)合微生物菌劑，使煙葉的醇化時間在1~730 d內(nèi)可調(diào)［21］。

在晾曬煙或雪茄煙葉開發(fā)方面，江西中煙從江西特色烤煙煙葉“黑老虎”表面篩選出一種可提高晾曬煙醇化速度并提升其吸食品質(zhì)的短小芽孢桿菌BP-01，BP-01具有產(chǎn)多種酶的能力，可將晾曬煙葉的發(fā)酵時間縮短至5 d［11］。中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所和?？谘┣蜒芯克槍ρ┣褵熑~合作開發(fā)的四段式發(fā)酵方法中，兩段為微生物發(fā)酵技術(shù)，先在煙葉回潮階段施加微生物復(fù)配菌劑（特基拉芽孢桿菌CSA-MEI-2-33、短小芽孢桿菌HD-7、蠟樣芽孢桿菌M-5和巨大芽孢桿菌CAS5077-67-8-YNLC），發(fā)酵2~3 d用于降解煙葉中的大分子物質(zhì)，而后再采用增香保潤復(fù)配菌劑（出芽短梗霉UVMU6-1、微球菌-46和葡萄球菌CAS513-86-0-HNYZ）進一步發(fā)酵雪茄煙葉6~8 d，使煙葉風(fēng)格凸顯，雪茄香氣飽滿，刺激性明顯降低，吸食品質(zhì)更加協(xié)調(diào)［22］。河南中煙針對雪茄開發(fā)了一種微生物菌群制劑，含有酵母+（青霉、黑曲霉、毛霉、根霉中一種或幾種任意比例混合）組合，可將雪茄煙葉的發(fā)酵時間縮短至10 d［23］。

2.4.2 生物酶制劑

在在線工藝方面，云南中煙開發(fā)了一種煙葉改性生物隧道在線處理工藝，可提供生物酶所需的適宜作用環(huán)境，對煙葉進行在線酶解5~15 min，即可達到煙葉的醇化效果［5］。湖北中煙開發(fā)了一種基于酶催化的煙草加工工藝，在加料工序后，采用酶制劑（中性蛋白酶、α-淀粉酶、糖化酶、纖維素酶、果膠酶之中的單酶或2~5種酶的組合）對煙葉在貯葉柜醇化4 h即可提升煙葉質(zhì)量［24］。內(nèi)蒙古昆明卷煙有限責(zé)任公司將施加酶制劑（纖維素酶、脂肪酶、木素酶、果膠酶）放在煙草物料松散回潮階段，通過改善酶制劑與煙草物料的接觸程度提高發(fā)酵效率，可縮短發(fā)酵時間至20 h［25-26］。

在煙草內(nèi)源微生物酶制劑方面，上海煙草集團和江南大學(xué)合作，采用黑曲霉制備混合酶（蛋白酶、淀粉酶等），可將上部煙葉的醇化時間縮短至1 h［27］。鄭州煙草研究院采用哈茨木霉發(fā)酵制備纖維素酶粗液，對煙絲、片煙、煙梗酶解4~18 h即可明顯降低煙草纖維素含量［28］。湖北工業(yè)大學(xué)采用短小芽孢桿菌菌株TX1，發(fā)酵后制得粗酶液，對煙葉中纖維素的降解也可縮短至3 h［29］。在其他微生物酶制劑方面，內(nèi)蒙古昆明卷煙有限責(zé)任公司采用微生物（毛栓菌、地衣芽孢桿菌、黑曲霉、米曲霉、康寧木霉）在煙葉培養(yǎng)基上分別制備出相應(yīng)的高活性酶（中性蛋白酶、漆酶、α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、β-葡聚糖酶、纖維素酶），單獨或與微生物結(jié)合用于煙葉發(fā)酵，可將發(fā)酵時間縮短至5 d［30-35］。

在復(fù)合酶制劑使用方面，中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所將蔗糖酶、淀粉酶、麥芽糖酶、纖維二糖酶、果膠酶、復(fù)合纖維素酶和/或葡萄糖淀粉酶配制成復(fù)合制劑，發(fā)酵煙葉0.15~8.00 h，可使煙草中還原糖在可溶性總糖中的比例達90%以上［36］。河南中煙復(fù)配的酶制劑由α-淀粉酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶組成，對煙葉酶解6 h即可降解13.02%的蛋白質(zhì)和16.89%的淀粉［37］。夏炳樂［38］采用復(fù)合酶（淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶、果膠酶）和活性調(diào)節(jié)劑（由鉀鹽、鈉鹽、鈣鹽和鎂鹽有機復(fù)合而成）制備了一種煙葉品質(zhì)生物酶復(fù)合調(diào)節(jié)劑，對回潮后煙葉酶解18~24 h，可使煙葉內(nèi)在質(zhì)量提高1~2個等級。

復(fù)合酶制劑的固定化或緩釋研究，旨在改善人工發(fā)酵煙葉抽吸品質(zhì)弱于自然醇化煙葉的問題。云南瑞升科技有限公司研發(fā)了一種固定化生物酶制劑，即采用保護膜將細胞或酶限制在一定的空間范圍內(nèi)，通過避免與空氣的直接接觸和控制其釋放速度達到延長使用時間的效果，所用壁材為海藻酸鈉或β-環(huán)糊精，芯材為蛋白酶、淀粉酶、果膠酶、多糖降解酶、纖維素酶，對低次煙葉煙絲酶解15~18 h，煙葉中總糖和還原糖的量分別增加7.9%和11.2%，香氣質(zhì)明顯提高［39］。

在雪茄煙葉提質(zhì)方面，專利權(quán)人主要有四川中煙和湖北中煙。四川中煙利用復(fù)合酶制劑（纖維素酶、果膠酶、淀粉酶、糖化酶、過氧化氫酶、漆酶、風(fēng)味蛋白酶）對煙葉發(fā)酵8~24 h，可將大分子蛋白質(zhì)降解為多肽或氨基酸，消除疏水性苦味肽，結(jié)合后續(xù)非酶棕色化反應(yīng)等，能夠從整體上改善雪茄煙葉的感官質(zhì)量［40］。湖北中煙側(cè)重于采用纖維素酶、果膠酶、風(fēng)味蛋白酶、淀粉酶、氧化酶（多酚氧化酶、過氧化物酶）等單一或復(fù)配酶制劑經(jīng)“浸柄+煙葉表面噴灑”工藝處理雪茄煙葉，發(fā)酵10~14 d，煙葉苦味明顯改善，在香氣特征、煙氣特征、口感特征、燃燒性和灰色等方面的品質(zhì)得到提高［41-43］。

2.4.3 微生物+生物酶混合制劑

在顯著縮短人工發(fā)酵時間方面，混合使用微生物+生物酶制劑對煙葉進行發(fā)酵的專利相對不多。酶菌混合制劑主要有復(fù)配制劑以及微生物發(fā)酵粗酶液兩種，其成分多以酵母或芽孢桿菌中的一種微生物輔以其他生物酶組成。河南中煙通過采用堿性蛋白酶和特定蛋白降解菌株（短小芽孢桿菌SMXP-03菌株）制備了一種復(fù)合生物制劑，可將雪茄煙葉的堆積發(fā)酵周期縮短至8 d［44］。上海煙草集團和江南大學(xué)合作，利用復(fù)合酶液（纖維素酶、淀粉酶、糖化酶）、煙草增質(zhì)液（炒米汁或棗汁）和微生物種子菌懸液（熱噬淀粉芽孢桿菌）制備出一種復(fù)合生物制劑，可將低次煙葉酶解和固態(tài)發(fā)酵周期縮短至5 d［45］。湖北中煙將復(fù)合生物制劑（扣囊復(fù)膜孢酵母和天冬酰胺酶）在白肋煙松散回潮后用于煙葉發(fā)酵1~3 d，后續(xù)再經(jīng)天冬酰胺酶+美拉德反應(yīng)工序，可明顯降低煙氣的刺激性，提高煙香和滿足感［46］。

2.5 降低煙堿專利分析

相比于其他手段（浸提法和農(nóng)藝措施），微生物技術(shù)的專一性相對較強，可以通過不同的代謝途徑降解煙堿，也可以分解煙葉中的煙堿但不影響卷煙品質(zhì)，有關(guān)微生物降解煙堿的研究國外早已有報道，相關(guān)菌類主要從煙葉或植煙土壤中分離得到［47］。國內(nèi)相關(guān)專利申請最早是在2002年，王革［48］發(fā)現(xiàn)采用芽孢桿菌（短小芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、蕈狀芽孢桿菌）在發(fā)酵煙葉的同時還具有降解煙堿的效果。在降低煙堿的相關(guān)中國專利中，企業(yè)或大學(xué)應(yīng)用最多的生物制劑主要是節(jié)桿菌屬、假單胞菌屬以及煙堿降解酶等［20，49-57］，此外，在微桿菌、冠突散囊菌、鏈格孢菌、不動桿菌、乳酸菌、醋酸桿菌、摩氏摩根氏菌、中間蒼白桿菌及紅球菌等微生物菌屬的煙堿降解方面也有專利申請［58-63］。

在節(jié)桿菌技術(shù)領(lǐng)域，廣西中煙分離得到了煙草節(jié)桿菌——Arthrobacter nicotianaeGYC103，用其對煙葉發(fā)酵10~48 h，煙葉中的煙堿可降解2.9%~18.8%；同時其對蛋白質(zhì)和淀粉還具有較強的降解能力［64］；云南省煙草科學(xué)研究院分別采用節(jié)桿菌（Arthrobactersp.）AS-1、節(jié)桿菌AS-2處理煙葉，烘烤結(jié)束后對煙堿的降解率可達36.9%~54.6%［51-52］。

在假單胞菌技術(shù)領(lǐng)域，紅云紅河煙草（集團）和中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所合作從植煙土壤中分離得到惡臭假單胞菌菌株，其對培養(yǎng)基中煙堿的降解效果顯著［55］。云南省煙草科學(xué)研究院分別從煙葉和植煙土壤中分離得到熒光假單胞菌和惡臭假單胞菌，用于烤煙煙葉的發(fā)酵，可分別降低28%和24%的煙堿［18］。此外，云南省煙草科學(xué)研究院還從植煙土壤中分離得到假單胞菌nic22，以其培養(yǎng)液制備粗酶液，可使煙草中煙堿的降解率達13.3%~33.1%［65］。

在酶制劑方面，通常是將具有煙堿降解功能的酶如煙堿脫氫酶、煙堿氧化酶等摻配到其他酶制劑中，同時達到縮短煙葉醇化時間以及降低煙堿的效果。云南萬芳生物技術(shù)有限公司在煙葉復(fù)烤前采用煙堿脫氫酶制劑替代第二次煙葉潤濕劑（水），可將煙葉中煙堿降低3.93%~8.08%［53］；此外，該公司還分別將煙堿氧化酶、煙堿降解酶與葡萄糖氧化酶、葉綠素氧化酶、類胡蘿卜素氧化酶、蛋白酶等酶群復(fù)配，在潤葉加料階段施加復(fù)配制劑，處理后煙葉中煙堿可降低9.3%，煙氣煙堿量可降低28.0%［66-67］。紅云紅河煙草（集團）將煙堿脫氫酶與蛋白酶、果膠酶、纖維素酶等進行復(fù)配，用于對片煙進行發(fā)酵，可降解煙堿6.1%~10.8%［68］。

2.6 降低主要有害成分專利分析

2.6.1 亞硝胺降解技術(shù)

煙草特有N-亞硝胺（TSNAs，Tobacco specialN-nitrosamines）主要產(chǎn)生于煙葉的調(diào)制過程，在這一過程中微生物起著重要作用［69］。因此，采用生物技術(shù)法調(diào)控該過程，可有效提高煙葉的安全性和綜合品質(zhì)。目前，用于煙草中TSNAs降解的生物制劑主要是菌類，如芽孢桿菌屬和假單胞菌屬等。國內(nèi)專利以云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)院為申請人的最多，其次是云南中煙和上海煙草集團。

在優(yōu)勢降解菌方面，云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)院側(cè)重于采用芽孢桿菌（短小芽孢桿菌、高地芽孢桿菌）或水生產(chǎn)堿菌處理煙葉，旨在降低調(diào)制或制絲過程煙葉或煙絲中4種主要的TSNAs（NNN、NNK、NAB和NAT），研究顯示，分別采用高地芽孢桿菌J45、J54以及短小芽孢桿菌05-5402調(diào)制煙葉，4種主要TSNAs的總降解率分別為27.64%~52.37%、5.2%~46.6%和12.2%~17.3%［18，70-71］；采用水生產(chǎn)堿菌05-101處理烤煙和晾曬煙時，4種主要TSNAs的總降解率分別為6.1%~27.1%和14.5%~30.6%［72］；另外，采用05-101、J45、J54中的至少一種配制OD600值為1的菌劑也可同時用于烤煙和雪茄煙葉中亞硝胺的降解［73］。云南中煙側(cè)重于煙草內(nèi)生細菌的篩選和應(yīng)用，研究顯示，采用銅綠假單胞菌KenLXP30菌株或放射根瘤KenLXR34以葉面噴霧方式處理白肋煙煙葉，TSNAs的降解率分別為86.03%和54.46%［74］。上海煙草集團從曬紅煙篩選出芽孢桿菌屬菌株ECU1101，能夠快速降解醇化煙葉中的TSNAs，對NNN、NNK、NAB和NAT的降解率普遍在8.5%~30.0%［75］。

除亞硝胺降解優(yōu)勢菌株外，云南中煙和上海煙草集團還發(fā)現(xiàn)在特定酶制劑作用下，TSNAs也能夠得到降解，這為降解亞硝胺生物制劑的制備提供了一種新思路。上海煙草集團基于細胞色素P450酶，與NADPNa2、檸檬酸三鈉和氯化鎂組配后，在加表料工序施加到煙葉上，煙葉中NNK的降解率可達19.0%~24.8%，該制劑還可用于再造煙葉煙草濃縮液中亞硝胺的降解［76］?？紤]到曬黃煙與烤煙的調(diào)制方式不同，云南中煙制備了一種用于煙葉TSNAs降解的復(fù)合酶制劑，由中性蛋白酶、果膠酶、木聚糖酶、糖化酶、β-葡聚糖酶、α-淀粉酶、中溫淀粉酶、纖維素酶、中性脂肪酶和煙草復(fù)合酶中的5種或5種以上組成，通過降低煙葉中的總氮、硝酸鹽、降煙堿、麥斯明、假木賊堿、新煙堿等前體物質(zhì)，間接降低煙葉中TSNAs的量，降低率為26.4%~36.8%［77］。

2.6.2 其他有害成分降解技術(shù)

卷煙煙氣中主要有害物質(zhì)除煙葉成分的直接轉(zhuǎn)移外，果膠、甾醇等大分子物質(zhì)的裂解也是其主要來源。30余年來，我國煙草行業(yè)致力于卷煙的降焦減害，在農(nóng)業(yè)、配方、輔材、工藝、選擇性減害添加劑等關(guān)鍵技術(shù)方面取得了一系列突破和集成創(chuàng)新成果。其中，利用現(xiàn)代生物技術(shù)有針對性地降解煙葉有害成分及其前體物是卷煙降焦減害的重要原料加工途徑，同時還能改善煙葉的綜合品質(zhì)。針對不同有害成分或前體物，所采用微生物或酶制劑的種類有所差異。從專利申請情況看，降解目標物主要有果膠、木質(zhì)素、纖維素、蛋白質(zhì)、甾醇、萜烯類化合物等，以此起到降低卷煙煙氣焦油、CO、HCN、氨、酚類化合物、苯并［a］芘、巴豆醛以及丙烯酰胺等有害成分的作用。其中通過降解甾醇進而降低卷煙煙氣中的稠環(huán)芳烴（含苯并［a］芘）是專利申請的重點。

在各種降低有害成分的專利申請中，川渝中煙、河南中煙、云南中煙以及雷諾煙草公司的專利相對較多。川渝中煙的專利技術(shù)側(cè)重采用枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌凍干菌粉中一種或幾種，或輔以后續(xù)膨脹技術(shù)降低煙氣中的苯并［a］芘、巴豆醛、氨、焦油和CO等有害成分［78-80］。河南中煙和云南中煙主要致力于降低煙氣中的苯丙［a］芘，河南中煙在再造煙葉制備過程中采用蘇云金芽孢桿菌處理煙草提取物，主流煙氣中的稠環(huán)芳烴可降低38.7%［81］；另外，還發(fā)現(xiàn)甲基桿菌在液相體系下對甾醇也具有相當(dāng)?shù)慕到饽芰Γ?1］。云南中煙側(cè)重于采用甾醇降解菌TCD0001菌株降解煙草材料中的甾醇，針對不同的甾醇底物，降解率為2%~30%，以豆甾醇的降解效果最好［82］。雷諾煙草公司的中國專利技術(shù)與國內(nèi)申請人不同，天冬酰胺的轉(zhuǎn)化是其關(guān)注點，分別采用復(fù)合酶制劑或益生菌處理煙草，旨在降低煙氣中丙烯酰胺，如采用天冬酰胺酶、氨基酸、二價和三價陽離子組合物、非還原性糖類物質(zhì)、還原劑等復(fù)配制劑處理煙草，煙氣中丙烯酰胺釋放量可降低10%以上［83］；采用雙歧桿菌屬、乳桿菌屬、腸球菌屬、proionobacterium、芽孢桿菌屬、酵母屬、鏈球菌屬及其混合物處理煙草材料，主流煙氣中丙烯酰胺可降低20%~40%［84］；或采用上述酶和益生菌的混合制劑共同處理煙草材料，進而降低煙草制品主流煙氣中丙烯酰胺的釋放量［85］。

3 結(jié)論與展望

（1）在基于生物技術(shù)的煙葉人工發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，常德卷煙廠早在1996年就申請了相關(guān)專利。自2010年，專利的申請量開始增加，年均申請量維持在25件，且有緩慢升高態(tài)勢。

（2）在專利申請數(shù)量方面，國內(nèi)煙草行業(yè)優(yōu)勢明顯，以云南中煙的專利數(shù)量最多，其次是河南中煙和湖北中煙；在合作申請方式方面，以國內(nèi)煙草行業(yè)單位與國內(nèi)大學(xué)的合作申請為主，且具有明顯的地域性特點，參與合作申請的煙草行業(yè)外單位主要有鄭州輕工業(yè)大學(xué)、江南大學(xué)和西北農(nóng)林科技大學(xué)。

（3）該領(lǐng)域IPC技術(shù)主題分布較為集中，主要涉及A24B、C12N和C12R 3個小類，且共現(xiàn)頻繁，在其他小類，諸如機械設(shè)備等方面明顯不足。C12N和C12R小類專利分別涉及細菌及其培養(yǎng)基和芽孢桿菌屬微生物等技術(shù)。

（4）在具體技術(shù)領(lǐng)域方面，絕大多數(shù)專利涉及微生物或生物酶對煙葉的人工發(fā)酵，功能效果主要為降刺增香和加速煙葉醇化2個方面，其次是用于降低煙草中煙堿、亞硝胺或其他有害成分，其中降刺增香和加速醇化共現(xiàn)頻率最高，是專利布局的重點。在微生物菌劑方面，以芽孢桿菌屬的應(yīng)用最多，主要有枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌3種。在生物酶制劑方面，應(yīng)用較多的主要是纖維素酶、果膠酶、蛋白酶和淀粉酶4種，且共現(xiàn)頻率最高，是專利布局的熱點區(qū)域；在半纖維素酶、糖化酶、漆酶、木聚糖酶、葡萄糖氧化酶、煙堿脫氫酶、脂肪酶和木質(zhì)素酶方面，也有適量的專利布局。

（5）相比于微生物和微生物+生物酶混合制劑處理技術(shù)，單獨采用酶類制劑（含復(fù)合酶）處理煙葉，在縮短發(fā)酵時間方面效果更為顯著。

為使微生物和酶以及相關(guān)制劑在卷煙生產(chǎn)企業(yè)制絲生產(chǎn)中得到應(yīng)用，除了要具備合適的溫濕度等環(huán)境條件外，處理時間也是非常重要的因素。許多在實驗室中效果非常好的微生物和酶及其制劑，一旦應(yīng)用到工業(yè)生產(chǎn)中，效果就會大打折扣，主要原因就在于正常的工業(yè)生產(chǎn)工藝并不能滿足環(huán)境條件和處理時間等的要求。盡管采用生物技術(shù)發(fā)酵煙葉在增香降刺以及縮短發(fā)酵周期方面效果顯著，但工業(yè)應(yīng)用仍較少，對行業(yè)高質(zhì)量發(fā)展的推動作用沒有得到充分發(fā)揮，亟需加強該領(lǐng)域技術(shù)的集成、工程化及推廣應(yīng)用研究。另外，盡管微生物的來源主要是煙葉或植煙土壤，但在具體推廣應(yīng)用前，生物制劑（微生物或酶）的安全性評估仍值得關(guān)注，包括生產(chǎn)環(huán)境、卷煙消費和生態(tài)環(huán)境等3個方面。