賈英杰 張曉博 張新元 楊紅霞 郭爭(zhēng)榮

肝纖維化是慢性肝損傷的修復(fù)反應(yīng)以及細(xì)胞外基質(zhì)沉積和代謝失衡的結(jié)果，對(duì)于肝纖維化以及早期肝硬化階段，通過(guò)一定的干預(yù)治療，是可以逆轉(zhuǎn)的[1,2]。研究顯示肝星狀細(xì)胞的活化及表型轉(zhuǎn)化是肝纖維化發(fā)生及進(jìn)展的中心環(huán)節(jié)[3,4]，活化的肝星狀細(xì)胞高度表達(dá)α-SMA，分泌Ⅰ、Ⅱ型膠原，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)度沉積進(jìn)而促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生及進(jìn)展[5,6]。盡管肝纖維化的發(fā)生機(jī)制的闡明已經(jīng)取得了重大進(jìn)展，但仍然缺乏有效的抗纖維化策略[7,8]。肝纖維化機(jī)制的闡明及有效的抗肝纖維化藥物的研發(fā)與應(yīng)用是近年來(lái)本領(lǐng)域關(guān)注的熱點(diǎn)。然而中藥在抗肝纖維化治療中具有多層次、多途徑、多靶點(diǎn)的綜合作用，本課題組采用的強(qiáng)肝膠囊由丹參、茵陳、黃芪、山楂、山藥、甘草等16味中藥組成，具有活血軟堅(jiān)、化痰除濕等功效。本研究采用豬血清誘導(dǎo)的大鼠Wistar肝纖維化模型，同時(shí)采用水分薊賓膠囊作為陽(yáng)性對(duì)照組，應(yīng)用強(qiáng)肝膠囊進(jìn)行應(yīng)用研究，明確強(qiáng)肝膠囊能否有效延緩/阻止肝纖維化進(jìn)展，為肝纖維化的治療提供新的策略及科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 在河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心購(gòu)買(mǎi)基因純正的Wistar大鼠80只(合格證號(hào)：603100)，均為雄性，清潔級(jí)，平均體重為(180±20)g。強(qiáng)肝膠囊的制造廠家為石家莊東方藥業(yè)公司，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字Z10980012。水飛薊賓膠囊的制造廠家為天津天士力圣特制藥公司，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H20040299。豬血清的制造廠家為北京燕生政博生物科技公司，冰醋酸的制造廠家為天津市瑞金化工公司，異氟烷的制造廠家為山東科苑制藥公司諾耀眼集團(tuán)，ALT、AST、γ-GT、MDA、LN、HA、Col-Ⅰ、PCⅢ、Ⅳ-C、TGF-β1試劑盒購(gòu)于上海海軍醫(yī)學(xué)研究所。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物肝纖維化模型建立：正常組20只，用普通飲用水喂養(yǎng)。模型組60只，每次向大鼠腹腔注射滅活豬血清0.5 ml，每周2次，持續(xù)10周，期間不限制飲水及飲食。為了維持肝纖維化病因的連續(xù)有效刺激，避免大鼠肝纖維化模型的自然恢復(fù)，仍在治療過(guò)程中給予這些大鼠每只每周2次注射0.5 ml豬血清。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥：經(jīng)過(guò)10周造模成功后，把模型組60只大鼠隨機(jī)分成3個(gè)小組，分別為B、C、D組，每小組20只大鼠。其中，肝硬化模型(B組)大鼠只給予日常需要的普通飲用水，水飛薊賓組(C組)大鼠除了給予日常需要的普通飲用水外，還給予7 mg·kg-1·d-1的水飛薊賓膠囊灌胃，強(qiáng)肝膠囊組(D組)大鼠除了給予日常需要的普通飲用水外，還給予0.53 g·kg-1·d-1的強(qiáng)肝膠囊灌胃，治療時(shí)間均為8周。A組為對(duì)照組。

1.2.3 標(biāo)本采集與處理：采集標(biāo)本前，大鼠均禁食12 h，不禁水，給每只大鼠稱重并記錄。將大鼠用異氟烷吸入麻醉后立即剖開(kāi)腹腔，經(jīng)腹主動(dòng)脈采血，靜置4 h 后，以3 000 r/min離心后收集上層血清，按照各檢測(cè)試劑盒的需要量分裝，置于-80℃的冰箱保存。采血完畢后，立即暴露大鼠肝臟，觀察并記錄肝臟的外形、色澤、表面情況及質(zhì)地等情況。

1.2.4 臟器指數(shù)：剖開(kāi)大鼠腹腔后，迅速取出肝臟、脾臟和胸腺，于0.9%氯化納溶液中充分清洗，分別稱重記錄。肝組織部分采用4%中性甲醛溶液固定，備行肝組織病理學(xué)檢測(cè)。臟器指數(shù)=臟器的重量(g)/解剖前的體重(g)。

2 結(jié)果

2.1 肝組織病理學(xué)變化 肝組織標(biāo)本使用HE染色方法檢測(cè)病理學(xué)變化，A組肝小葉結(jié)構(gòu)均正常，肝索排列整齊；B組肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，可見(jiàn)點(diǎn)、灶狀肝細(xì)胞壞死及竇周纖維化，匯管區(qū)纖維組織增生，纖維間隔形成；D組纖維間隔明顯變細(xì)變短，肝纖維化程度較肝纖維化模型組明顯減輕；C組纖維間隔稍變細(xì)變短，肝組織纖維化程度亦較模型組好轉(zhuǎn)。見(jiàn)圖1。

圖1 肝組織病理學(xué)變化(HE×200)；A 對(duì)照組；B 模型組；C 水飛薊賓組；D 強(qiáng)肝膠囊組

2.2 4組大鼠臟器指數(shù) 與A組的正常組大鼠比較，B、C組模型組的肝臟和脾臟指數(shù)明顯上升(P<0.05)，但胸腺指數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，D組強(qiáng)肝膠囊組的肝臟、脾臟和胸腺指數(shù)均明顯上升(P<0.05)；與B、C組模型組比較，D組強(qiáng)肝膠囊組的脾臟和胸腺指數(shù)上升(P<0.05)，但肝臟指數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 4組大鼠臟器指數(shù)比較

2.3 4組大鼠肝組織ALT、AST、γ-GT、MDA含量 與A組正常組比較，B組模型組ALT、AST、γ-GT的含量明顯升高(P<0.05),但MDA含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與B組模型組比較，D組強(qiáng)肝膠囊組和C組水飛薊賓膠囊組ALT、AST、γ-GT的含量明顯減少(P<0.05)，但MDA含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與C組水飛薊賓膠囊組比較，D組強(qiáng)肝膠囊組ALT、AST、γ-GT的含量明顯減少(P<0.05)，但MDA含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

2.4 4組大鼠肝組織LN、HA、Col-Ⅰ、PCⅢ、Ⅳ-C、TGF-β1含量 與A組正常組比較，B、C、D組模型組LN、HA、Col-Ⅰ、PCⅢ、Ⅳ-C、TGF-β1含量明顯上升(P<0.05)；與B組模型組比較，D組強(qiáng)肝膠囊組LN、HA、Col-Ⅰ、PCⅢ、Ⅳ-C、TGF-β1含量明顯減少(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表2 肝組織ALT、AST、γ-GT、MDA含量

表3 肝組織LN、HA、Col-Ⅰ、PCⅢ、Ⅳ-C、TGF-β1含量

2.5 4組大鼠血清LN、HA、Col-Ⅰ、PCⅢ、Ⅳ-C、TGF-β1含量 與A組正常組比較，B、C組模型組LN、HA、Col-Ⅰ、PCⅢ、Ⅳ-C、TGF-β1含量明顯上升(P<0.05)，D組強(qiáng)肝膠囊組HA含量明顯上升(P<0.05)，但LN、Col-Ⅰ、PCⅢ、Ⅳ-C、TGF-β1含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與B組模型組比較，D組強(qiáng)肝膠囊組LN、HA、Col-Ⅰ、PCⅢ、Ⅳ-C、TGF-β1含量明顯減少(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 血清LN、HA、Col-Ⅰ、PCⅢ、Ⅳ-C、TGF-β1含量

3 討論

肝纖維化/肝硬化屬于中醫(yī)“積聚”范疇，究其基本病機(jī)為肝脾同病、氣虛血瘀，以氣虛和血瘀的證候表現(xiàn)為辨證要點(diǎn)。本課題采用的強(qiáng)肝膠囊，具有活血軟堅(jiān)、化痰除濕等功效[9]。丹參具有活血祛瘀，清熱涼血、通經(jīng)止痛之功效，其抗肝纖維化的作用明確，通過(guò)下調(diào)細(xì)胞因子、減少膠原組織的合成、阻斷肝臟枯否細(xì)胞和肝星狀細(xì)胞的活化、以及促進(jìn)肝臟快速清除自由基等來(lái)發(fā)揮作用[10]。強(qiáng)肝膠囊中含有黨參、當(dāng)歸、丹參、黃芪成分,具有保護(hù)肝細(xì)胞、減輕炎癥壞死的作用,故可達(dá)到保肝、降酶的功效[11]。實(shí)驗(yàn)性肝損傷的研究發(fā)現(xiàn)，茵陳可以降低肝細(xì)胞的炎癥程度，促進(jìn)肝細(xì)胞炎癥的恢復(fù)[12]。相比于化學(xué)藥物，中藥的優(yōu)點(diǎn)是多方面、多靶點(diǎn)和多層面的，從整體上系統(tǒng)地調(diào)控各靶點(diǎn)抑制肝纖維化的進(jìn)展[13]。

有研究報(bào)道，豬血清以異種抗原的身份侵入機(jī)體，刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，使肝臟出現(xiàn)了纖維化，或者以炎癥刺激因子的身份來(lái)刺激機(jī)體被動(dòng)釋放出大量細(xì)胞因子，激活肝星狀細(xì)胞，使細(xì)胞外基質(zhì)出現(xiàn)異常沉積，而引起肝纖維化[14]。本研究之所以采用豬血清來(lái)誘導(dǎo)肝纖維化模型，是因?yàn)樨i血清誘導(dǎo)的肝纖維化模型具備很多優(yōu)點(diǎn)，如：肝纖維化持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)、自愈率低、對(duì)肝細(xì)胞損傷較小、有較強(qiáng)的免疫應(yīng)答能力、對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響小等，最重要的是，其誘導(dǎo)的肝纖維化的發(fā)生機(jī)制與臨床上慢性肝炎所致肝纖維化的發(fā)生機(jī)制接近[15,16]。

在本研究中，D組強(qiáng)肝膠囊組的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均比B組模型組高，提示強(qiáng)肝膠囊可在一定程度上提高機(jī)體免疫力。眾所周知，脾臟和胸腺是機(jī)體非常重要的免疫器官，其臟器指數(shù)的高低與免疫功能的強(qiáng)弱及免疫活性細(xì)胞的數(shù)量有關(guān)[17]。

目前，肝纖維化的診斷多采用非創(chuàng)傷性診斷體系，包括細(xì)胞外基質(zhì)及其轉(zhuǎn)化的相關(guān)物質(zhì)，如LN、HA、Ⅳ-C以及TGF-β1等[18]。研究表明，肝纖維化時(shí)細(xì)胞外基質(zhì)異常增生，沉積的主要成分是COL-Ⅰ、PCⅢ，基底膜的主要成分LN、Ⅳ-C在基底膜增生、肝竇毛細(xì)血管纖維化過(guò)程中含量增加[19]。其血清含量與肝纖維化的嚴(yán)重程度密切相關(guān)，能較客觀的反映肝纖維的合成狀況及炎癥的活動(dòng)性[20]，是肝纖維化早期的檢測(cè)標(biāo)志，隨著病程進(jìn)展，其在血清中的含量逐步升高，因此也是觀察藥物療效和預(yù)后的重要依據(jù)之一。

為進(jìn)一步了解強(qiáng)肝膠囊對(duì)肝纖維化的治療效果，本實(shí)驗(yàn)使用強(qiáng)肝膠囊治療大鼠肝纖維化。血清生化指標(biāo)異常，表示肝內(nèi)炎癥損害，ALT多見(jiàn)于肝細(xì)胞漿內(nèi)，AST多見(jiàn)于肝細(xì)胞線粒體內(nèi)[21]。結(jié)果顯示強(qiáng)肝膠囊組的血清學(xué)及肝組織指標(biāo)ALT、AST、γ-GT、LN、HA、Col-Ⅰ、PCⅢ、Ⅳ-C、TGF-β1遠(yuǎn)低于模型組，提示大鼠肝纖維化程度減輕。黎桂玉等[22]指出：強(qiáng)肝膠囊對(duì)慢性肝炎血清HA、PⅢP、Ⅳ-C和LN的作用明顯優(yōu)于對(duì)照組，且無(wú)嚴(yán)重不良反應(yīng)發(fā)生，歐強(qiáng)等[23]在治療過(guò)程中亦未見(jiàn)明顯不良反應(yīng)。

此外，有研究證實(shí)，TGF-β1能反映肝臟炎性反應(yīng)的活動(dòng)性，并與肝臟纖維化水平密切相關(guān)。TGF-β1可以通過(guò)誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞的異常增殖導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的增加，從而上調(diào)LN、HA等的表達(dá)，破壞基質(zhì)金屬蛋白酶及其組織抑制劑的平衡狀態(tài)，從而促使肝纖維化發(fā)生發(fā)展[24]。在本研究中，強(qiáng)肝膠囊組治療后TGF-β1水平下降，表明強(qiáng)肝膠囊可以抑制TGF-β1的產(chǎn)生，可以通過(guò)降低TGF-β1的水平來(lái)減少肝臟細(xì)胞外基質(zhì)的異常沉積，從而達(dá)到改善、治療肝纖維化的目的。吳翠萍等[25]的研究提示：強(qiáng)肝膠囊可以多靶位、多層次、多環(huán)節(jié)的發(fā)揮抗肝纖維化作用,從而達(dá)到延緩、阻止甚或逆轉(zhuǎn)肝纖維化進(jìn)程,改善病情，這與田春閣等[26]的研究結(jié)果一致。

綜上，強(qiáng)肝膠囊在改善肝臟理化指標(biāo)的基礎(chǔ)上，可多靶點(diǎn)發(fā)揮抗肝纖維化作用，但由于中藥的成分比較復(fù)雜，是其單一成分有效還是多種成分的共同作用的結(jié)果，還有待進(jìn)一步研究。