王 佳 葉冬梅 袁小林

大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連 116001

多核巨細(xì)胞（multinucleated giant cells，MGC）是與肉芽腫相關(guān)的同型巨噬細(xì)胞合胞體[1]，其種類繁多，如破骨細(xì)胞、朗漢斯巨細(xì)胞、異物巨細(xì)胞等。其中破骨細(xì)胞的研究最多，為MGC 融合機(jī)制提供了更深入研究[2-3]。MGC 的形成始于單核前體細(xì)胞，通過促融合細(xì)胞因子獲得融合能力，擴(kuò)展富含肌動蛋白的絲狀投射，細(xì)胞相互遷移，并通過絲狀突起或融合足發(fā)生黏附。在相應(yīng)位置，融合劑使質(zhì)膜靠近，去除中間膜實(shí)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)共享形成MGC，但其作用及生理功能尚不清楚[4]。本課題組在研究中觀察到巨噬細(xì)胞與其他細(xì)胞系體外共培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞受到損傷或發(fā)生壞死時(shí)或有巨大細(xì)胞及典型MGC 出現(xiàn)。本研究對細(xì)胞損傷微環(huán)境中MGC 的形成進(jìn)行動態(tài)觀察，為MGC 的形成機(jī)制及其功能的研究提供實(shí)驗(yàn)資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

小鼠RAW 264.7 巨噬細(xì)胞購自中科院；HL-1 小鼠心房肌細(xì)胞購自武漢菲恩生物科技有限公司。

1.2 試劑與儀器

RPMI-1640 培養(yǎng)基（天津?yàn)笕A科生物科技有限公司，HY1640）；DMEM/HIGH GLUCOSE 培養(yǎng)基（沃卡威生物技術(shù)有限公司，SH30022.01）；優(yōu)級胎牛血清（天津?yàn)笕A科生物科技有限公司，11011-8611）；青鏈霉素混合液（Hyclone，S110JV）；0.25%乙二胺四乙酸（ethylene diaminetetraacetic acid，EDTA）胰蛋白酶（Hyclone，KGY0012）；Type 120c 普通光學(xué)顯微鏡（尼康儀器有限公司）；Nikon-ECLIPSE-Ti 活細(xì)胞工作站（上海衡浩儀器有限公司）；DiO 熒光染料（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，D-9102）；Hoechst 33342 熒光染料（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，D-9105）；Hitachi 掃描電鏡（相確精密儀器有限公司）；4%多聚甲醛（北京索萊寶科技有限公司，C2055）。

1.3 巨噬細(xì)胞和心肌細(xì)胞共培養(yǎng)方法

巨噬細(xì)胞和心肌細(xì)胞分別單獨(dú)培養(yǎng)，待培養(yǎng)瓶中細(xì)胞密度達(dá)到80%以上，分別用0.25% EDTA 胰蛋白酶進(jìn)行消化，離心力179×g，離心5 min，棄上清，完全培養(yǎng)基清洗兩次，備用。收集巨噬細(xì)胞和心肌細(xì)胞，按照1∶3 比例混合，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml 接種于普通培養(yǎng)皿內(nèi)，37℃、5%CO2條件下共培養(yǎng)，分別于停止換液的第9～15 天拍照，觀察MGC 形成現(xiàn)象。對照采用單獨(dú)培養(yǎng)心肌細(xì)胞至第9 天進(jìn)行拍照。

1.4 MGC 形成的動態(tài)觀察

共培養(yǎng)方法同上，接種于普通和共聚焦培養(yǎng)皿內(nèi)，前者設(shè)置實(shí)驗(yàn)組（不換液不傳代）和對照組（定期換液），37℃、5%CO2條件下共培養(yǎng)，使用普通光學(xué)顯微鏡于第0～15 天拍照，計(jì)數(shù)第6、9、12 天實(shí)驗(yàn)組多核巨細(xì)胞的數(shù)量；同條件再設(shè)置實(shí)驗(yàn)組和對照組，放到活細(xì)胞工作站中，動態(tài)觀察MGC 形成及分裂的全過程。

1.5 MGC 形成過程中巨噬細(xì)胞與心肌細(xì)胞的相互作用

收集巨噬細(xì)胞和心肌細(xì)胞，用培養(yǎng)基重懸，分別加入DiO 熒光染料（1 mmol/ml）、Hoechst33342 熒光染料（1 μg/ml）混勻。37℃避光孵育20 min，離心力179×g，離心5 min，去上清，重復(fù)洗滌2 次，按照1∶3比例共培養(yǎng)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml 接種于共聚焦培養(yǎng)皿內(nèi)，不換液不傳代，置于活細(xì)胞工作站中，綠、藍(lán)二色熒光通道定時(shí)攝片，動態(tài)觀察MGC 形成。

1.6 掃描電鏡觀察MGC 形成

將巨噬細(xì)胞和心肌細(xì)胞按照1∶3 比例接種到內(nèi)置玻片的培養(yǎng)皿中，37℃，5%CO2條件下等待細(xì)胞爬片，待出現(xiàn)MGC 后，取出培養(yǎng)皿，用1×PBS 漂洗3 次，然后用4%多聚甲醛固定30 min，再進(jìn)行乙醇梯度脫水，通風(fēng)干燥。使用掃描電鏡觀察，拍攝MGC 及其超微結(jié)構(gòu)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，重復(fù)測量數(shù)據(jù)采用重復(fù)測量方差分析。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞損傷微環(huán)境MGC 形成現(xiàn)象

細(xì)胞停止換液傳代，會出現(xiàn)一些體積巨大的細(xì)胞，而且細(xì)胞的數(shù)量隨著停止換液時(shí)間的延長而增多。停止換液初期與后期出現(xiàn)巨大細(xì)胞的形態(tài)有明顯差異，初期形態(tài)規(guī)則，多呈圓形或橢圓形，而后期形態(tài)不規(guī)則、偽足多。這些巨細(xì)胞在共培養(yǎng)體系中出現(xiàn)，而單純培養(yǎng)的正常心肌細(xì)胞不出現(xiàn)。見圖1。

圖1 心肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和心肌細(xì)胞共培養(yǎng)（100×）

2.2 細(xì)胞損傷微環(huán)境與MGC 形成的動態(tài)觀察

根據(jù)每天觀察MGC 是否形成，設(shè)置如下圖2 時(shí)間點(diǎn)，觀察MGC 形成動態(tài)過程。結(jié)果顯示，在光學(xué)顯微鏡下觀察到MGC 形成動態(tài)過程。第6 天，實(shí)驗(yàn)組的心肌細(xì)胞開始出現(xiàn)損傷和壞死，巨噬細(xì)胞吞噬或融合受損心肌細(xì)胞形成巨大細(xì)胞，巨大細(xì)胞多為多個(gè)細(xì)胞形成的合胞體，合胞體內(nèi)的多個(gè)細(xì)胞核大小均一、形態(tài)規(guī)則。第12 天出現(xiàn)的巨細(xì)胞，形態(tài)不規(guī)則呈多形性，有多偽足，吞噬能力較強(qiáng)。MGC 數(shù)量隨損傷因素作用的時(shí)間延長而增加（P ＜0.05）。對照組定期換液，使得心肌細(xì)胞沒有受損，沒有MGC 形成。見圖2～3。

圖2 光學(xué)顯微鏡觀察多核巨細(xì)胞形成的動態(tài)過程（200×）

圖3 實(shí)驗(yàn)組多核巨細(xì)胞數(shù)量與損傷因素作用時(shí)間的關(guān)系

活細(xì)胞工作站觀察到MGC 形成分裂的全過程。第6～9 天巨噬細(xì)胞與受損心肌細(xì)胞開始融合形成MGC，內(nèi)含多個(gè)核的合胞體，其形成的合胞體可進(jìn)一步分裂增殖，并且分裂的子細(xì)胞具有較強(qiáng)的運(yùn)動功能，見圖4。

圖4 活細(xì)胞工作站觀察多核巨細(xì)胞形成分裂全過程（200×）

2.3 染色（未染色）細(xì)胞融合形成MGC

為進(jìn)一步證實(shí)巨細(xì)胞類型，采用活細(xì)胞工作站和掃描電鏡，結(jié)果顯示染色細(xì)胞融合形成MGC，第6～9 天開始出現(xiàn)巨大細(xì)胞多為巨噬細(xì)胞與受損心肌細(xì)胞融合而成，而后期出現(xiàn)的巨細(xì)胞為巨噬細(xì)胞吞噬破碎的心肌細(xì)胞。見圖5（封三）。未染色細(xì)胞融合形成MGC，多個(gè)細(xì)胞膜融合，內(nèi)含多個(gè)核，見圖6。

圖5 活細(xì)胞工作站觀察染色細(xì)胞融合形成多核巨細(xì)胞（200×）

圖6 掃描電鏡觀察未染色細(xì)胞融合形成多核巨細(xì)胞（2500×）

3 討論

停止換液后，細(xì)胞培養(yǎng)微環(huán)境中糖、營養(yǎng)成分耗竭，代謝產(chǎn)物增多，使心肌細(xì)胞發(fā)生損傷甚至壞死；而巨噬細(xì)胞能量代謝有特殊性，對酸性環(huán)境及糖、營養(yǎng)缺乏有較強(qiáng)的耐受能力，以糖的無氧酵解為主要能量，所以停止換液后共培養(yǎng)中的巨噬細(xì)胞不會受到損傷[5-8]。壞死細(xì)胞可被巨噬細(xì)胞吞噬，部分受損傷的細(xì)胞可與巨噬細(xì)胞融合形成MGC。本研究結(jié)果顯示，巨噬細(xì)胞與心肌細(xì)胞共培養(yǎng)停止換液6 d 后開始出現(xiàn)MGC[9]，且MGC 的數(shù)量隨停止換液時(shí)間的延長而增多，當(dāng)大量死亡破碎心肌細(xì)胞出現(xiàn)后，巨噬細(xì)胞吞噬壞死心肌細(xì)胞形成吞噬型巨大細(xì)胞。而常規(guī)換液傳代的共培養(yǎng)體系內(nèi)無MGC 及吞噬型巨大細(xì)胞出現(xiàn)，提示細(xì)胞損傷后可導(dǎo)致MGC 形成。MGC 為巨噬細(xì)胞與巨噬細(xì)胞或與其他類型細(xì)胞融合而成，MGC 在體內(nèi)多見，如破骨細(xì)胞、腫瘤組織、結(jié)核、皮膚，MGC 形成的機(jī)制及其生理功能尚不十分清楚[10]。從本研究結(jié)果看，當(dāng)心肌細(xì)胞受到損傷的初期易于與巨噬細(xì)胞融合形成合胞體，合胞體分裂的子細(xì)胞會有巨噬細(xì)胞線粒體及其他成分，使損傷的組織細(xì)胞得到一定程度的修復(fù)[11]。

心肌梗死發(fā)病率與死亡率較高，盡管支架技術(shù)能夠恢復(fù)血供，但壞死組織纖維化，影響心肌功能，并為進(jìn)一步發(fā)展留下隱患[12-13]。急性期后壞死組織若能被修復(fù)或再生將能夠恢復(fù)組織器官功能，對于降低死亡率及延長生存期具有重要意義[14]。巨噬細(xì)胞分布于全身組織，其主要來源：一是血液中單核細(xì)胞進(jìn)入組織并分化為巨噬細(xì)胞[15]；二是來源于卵黃囊，細(xì)胞示蹤實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)卵黃囊中的巨噬細(xì)胞在胚胎發(fā)育的早期就遷移并停留在組織中，成為組織駐留巨噬細(xì)胞[16]。其在器官形成、發(fā)育及損傷組織的修復(fù)再生中起關(guān)鍵作用[17]，而巨噬細(xì)胞與受損心肌細(xì)胞融合形成合胞體并分裂出具有雙重特性的雜交細(xì)胞很可能是巨噬細(xì)胞促進(jìn)損傷組織修復(fù)再生的機(jī)制之一。細(xì)胞損傷多由病理原因?qū)е?，巨噬?xì)胞可誘發(fā)一系列反應(yīng)，促進(jìn)損傷組織修復(fù)再生以恢復(fù)功能[18-21]。而且細(xì)胞損傷微環(huán)境中巨噬細(xì)胞的數(shù)量、活化與極化狀態(tài)直接影響修復(fù)方式和程度[18]。在腫瘤壞死區(qū)域大量巨噬細(xì)胞浸潤，出現(xiàn)大量吞噬壞死細(xì)胞的巨噬細(xì)胞（可遞呈腫瘤抗原誘發(fā)抗腫瘤特異免疫反應(yīng)）和少量MGC[22]，而腫瘤細(xì)胞與巨噬細(xì)胞融合的合胞體分裂后形成的雜交細(xì)胞比非融合癌細(xì)胞生成的腫瘤生長速度更快[23-24]。MGC 的存活期長，同時(shí)MGC 及其分裂后的雜交細(xì)胞對不良微環(huán)境耐受性極強(qiáng)，具有抗化療藥物、射線的能力[25-26]。

本研究結(jié)果提示，細(xì)胞損傷微環(huán)境中巨噬細(xì)胞可與受損心肌細(xì)胞融合形成MGC，而且合胞體可進(jìn)一步分裂增殖，其融合作用可能有助于心肌梗死損傷組織修復(fù)再生，為研究治療心肌梗死的方法提供科學(xué)依據(jù)。為進(jìn)一步研究損傷微環(huán)境中異體MGC 形成的機(jī)制及其雜交子細(xì)胞生物學(xué)特性具有重要意義。