劉紅勝，蔡路兵，黃斌，孫麗君

甲狀腺癌是內(nèi)分泌系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，目前術(shù)中冰凍明確病變性質(zhì)仍是非常重要的手段。有報(bào)道術(shù)中快速印片是輔助冰凍診斷的重要指標(biāo)[1-3]，可以很好的彌補(bǔ)冰凍切片質(zhì)量差以至于無法準(zhǔn)確觀察核特征的局限性。實(shí)踐中因結(jié)節(jié)間質(zhì)硬化、伴鈣化或退變、壞死以及結(jié)節(jié)較小等因素，致印片有效成分太少，常不能提供可靠依據(jù)。本研究采用對(duì)甲狀腺可疑癌結(jié)節(jié)同步制作印片、刮片與冰凍切片，觀察三者制片中細(xì)胞的形態(tài)特征，進(jìn)行術(shù)中快速診斷，術(shù)后所有病例均經(jīng)石蠟切片并免疫組化證實(shí)，以明確刮片在甲狀腺可疑癌結(jié)節(jié)術(shù)中冰凍診斷中的價(jià)值?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2019 年4 月至2020 年3 月杭州市蕭山區(qū)第一人民醫(yī)院送檢術(shù)中冰凍的甲狀腺外檢標(biāo)本160例（包括對(duì)肉眼可疑癌結(jié)節(jié)及術(shù)前B 超ACR TI-RADS 分級(jí)提示4 級(jí)及以上結(jié)節(jié)），其中男48 例，女112 例；年齡21 ～72 歲，中位年齡46 歲。同步制作印片、刮片與冰凍切片，術(shù)后均經(jīng)石蠟切片及免疫組化檢測(cè)確診。

1.2 方法

1.2.1 冰凍組織的選取 標(biāo)本測(cè)量體積后垂直于甲狀腺被膜沿最大剖面每隔0.3 cm（腫塊體積小者每隔0.2 cm）書頁(yè)狀切開，肉眼可疑癌結(jié)節(jié)充分取材。對(duì)于結(jié)節(jié)具有明顯包膜者，垂直包膜呈放射狀切開，沿包膜仔細(xì)觀察選取與包膜密切相關(guān)的區(qū)域及包膜外結(jié)節(jié)。

1.2.2 術(shù)中快速印片制作 將清潔玻片與可疑癌結(jié)節(jié)剖面平行，垂直方向適度輕壓，將印片馬上置于95%乙醇溶液固定30 s，水洗后置蘇木素1 min，自來水洗20 s，0.5%鹽酸乙醇分化，1%氨水溶液藍(lán)化10 s，0.25%伊紅溶液3 s，梯度乙醇脫水，松節(jié)油透明，中性樹膠封片，完成印片制片約5 min。

1.2.3 術(shù)中快速刮片制作 用清潔玻片與可疑癌結(jié)節(jié)剖面成銳角適度輕刮組織，然后將刮取組織在另一張玻片上成角約30°均勻拖片，制成細(xì)胞涂片，立即置于95%乙醇溶液固定30 s，剩余步驟同印片。完成刮片制片約5 min。

1.2.4 術(shù)中冰凍切片 根據(jù)甲狀腺細(xì)胞學(xué)Bethesda報(bào)告系統(tǒng)（2017 版）[4]進(jìn)行細(xì)胞學(xué)診斷，常規(guī)石蠟切片制作與免疫組織化學(xué)（S-P 法）染色。所選病例術(shù)后均經(jīng)石蠟切片與免疫組化明確診斷，免疫組化所用抗體：甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子1（TTF1）、Tg、CK19、HBME-1、Galectin-3、CD56、CEA、Calcitonin、嗜鉻粒素A（CgA）及Syn，均由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料采用2檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料 印片、刮片及聯(lián)合術(shù)中冰凍切片診斷數(shù)據(jù)見表1。

表1 印片、刮片及聯(lián)合術(shù)中冰凍切片診斷數(shù)據(jù) 例

2.2 石蠟切片檢出情況 石蠟切片共檢出甲狀腺乳頭狀癌124 例[單純型40例，合并橋本氏甲狀腺炎（橋本）45 例，合并結(jié)節(jié)性甲狀腺腫（結(jié)甲）38 例，合并甲狀腺腺瘤1 例]，其中甲狀腺微小乳頭狀癌84 例（占67.7%）；甲狀腺髓樣癌2例（最大徑分別約1.0、0.25 cm）；甲狀腺腺瘤12 例；結(jié)甲16 例；亞急性甲狀腺炎6 例。病灶伴乳頭狀結(jié)構(gòu)84 例（52.5%）；伴間質(zhì)硬化119 例（74.4%）；可見沙礫體25 例(15.6%)；伴鈣化46 例（28.8%）。

2.3 印片檢出情況 印片中甲狀腺乳頭狀癌61 例可見大范圍散在分布的巢狀、小片狀濾泡上皮細(xì)胞（封三彩圖3 ～4）?？梢姾藴?、核內(nèi)假包涵體。少數(shù)病例可見模糊的分支狀乳頭樣結(jié)構(gòu)。髓樣癌病例中1例可見少量松散分布的上皮樣細(xì)胞，部分細(xì)胞短梭形，可見漿細(xì)胞樣細(xì)胞，胞漿豐富、嗜酸性，部分細(xì)胞胞漿透明，背景中可見少量淀粉樣物質(zhì)。另1 例結(jié)節(jié)最大徑約0.25cm，可見少數(shù)圓形細(xì)胞，細(xì)胞大小不等，核橢圓形，染色質(zhì)細(xì)膩，胞漿粉染。其余病例未見明確特異性核特征。

2.4 刮片檢出情況 刮片中甲狀腺乳頭狀癌104 例可見局限性密集分布的巢團(tuán)狀濾泡上皮細(xì)胞（封三彩圖5），乳頭狀結(jié)構(gòu)易見（封三彩圖6），部分病例可見濾泡上皮細(xì)胞呈旋渦狀結(jié)構(gòu)，核溝、核內(nèi)假包涵體易見，片狀濾泡上皮細(xì)胞核仁明顯，部分病例可見沙礫體，腫瘤細(xì)胞與背景甲狀腺正常濾泡上皮細(xì)胞對(duì)比明顯。背景中部分病例可見炎細(xì)胞浸潤(rùn)，多核巨細(xì)胞易見。甲狀腺髓樣癌細(xì)胞分兩類：大量松散分布的上皮樣細(xì)胞，呈明顯的漿細(xì)胞樣（封三彩圖7）或多邊形，細(xì)胞核偏位，細(xì)胞形態(tài)大小差異大，少數(shù)為瘤巨細(xì)胞，雙核或多核瘤細(xì)胞；另一類部分細(xì)胞短梭形，小橢圓形，部分細(xì)胞可見小核仁。兩類細(xì)胞染色質(zhì)較細(xì)膩，胡椒鹽樣。其中1 例可見胞漿內(nèi)顆粒，背景中淀粉樣物質(zhì)。甲狀腺腺瘤2 例、結(jié)甲4 例可見乳頭狀結(jié)構(gòu)，部分細(xì)胞核增大。亞急性甲狀腺炎2 例濾泡上皮細(xì)胞核增大，橢圓形，1例似有核溝。

2.5 術(shù)中冰凍切片的形態(tài)學(xué)特征 甲狀腺乳頭狀癌在甲狀腺背景中突然出現(xiàn)明顯異型的腫瘤細(xì)胞團(tuán)巢，與周圍組織無漸進(jìn)性過渡。大部分見間質(zhì)硬化及間質(zhì)浸潤(rùn)和/或周圍組織浸潤(rùn)。大部分可見乳頭狀、濾泡狀結(jié)構(gòu)，乳頭具有纖維血管軸心，分支復(fù)雜。腫瘤細(xì)胞呈柱狀或立方形、胞漿豐富。大部分病例腫瘤細(xì)胞可見核增大、核溝及核內(nèi)假包涵體。核/漿比明顯增大、核形不規(guī)則及大小不一。核極性紊亂：可見細(xì)胞核不在基底部，移向乳頭表面，位于細(xì)胞頂部。核內(nèi)假包涵體是與胞漿顏色一致的、有銳利增厚邊界的圓形結(jié)構(gòu)，有些病例需仔細(xì)尋找。部分病例可找到沙礫體及鈣化。1 例甲狀腺微小乳頭狀癌合并甲狀腺腺瘤，腫瘤位于腺瘤臍凹狀增厚纖維包膜內(nèi)。

髓樣癌病例中1例可見巢狀、條索狀、腺樣（管狀或?yàn)V泡狀）及假乳頭狀結(jié)構(gòu)，細(xì)胞圓形、橢圓形，可見漿細(xì)胞樣細(xì)胞，胞漿豐富，嗜酸性，部分細(xì)胞胞漿透明，間質(zhì)可見纖維組織及淀粉樣物質(zhì)。另1 例最大徑約0.25cm，腫瘤細(xì)胞呈實(shí)性巢狀，部分呈濾泡樣，核橢圓形，染色質(zhì)細(xì)膩，未見核溝，可見數(shù)個(gè)核內(nèi)假包涵體樣結(jié)構(gòu)（封三彩圖8），胞漿粉染，細(xì)胞巢見少量束狀纖維樣結(jié)構(gòu)。

2.6 術(shù)后診斷 所有病例均經(jīng)石蠟制片并免疫組化染色特異性表達(dá)明確診斷，甲狀腺乳頭狀癌TTF1（+）、Tg（+）、CK19（+）、HBME-1（+）、Galectin-3（+）、CD56[103 例（－），21 例部分弱（+）]，甲狀腺髓樣癌特異性表達(dá)Calcitonin、部分CEA（+）、CgA（+）、Syn（+）。

2.7 印片、刮片及聯(lián)合診斷比較 印片155 例，確診106 例，延遲診斷49 例；刮片155 例，確診136 例，延遲19 例；兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（=16.95，P ＜0.05）。印片聯(lián)合冰凍切片確診131 例，延遲診斷24 例；刮片聯(lián)合冰凍切片確診148 例，延遲診斷7 例；兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（=10.36，P ＜0.05）。

3 討論

甲狀腺癌已成為我國(guó)最常見的惡性腫瘤之一，居女性惡性腫瘤發(fā)病第8位[5]。病理形態(tài)以乳頭狀癌為主要類型，占甲狀腺癌的79%～94%[6-9]，髓樣癌占甲狀腺癌的5%～10%[10]。由于超聲的分辨率提高，增加了甲狀腺微小癌的檢出率。然而，甲狀腺癌可合并結(jié)甲、腺瘤、橋本、亞急性甲狀腺炎及Graves病等良性疾病，為B超檢查判斷病變性質(zhì)帶來困惑，導(dǎo)致很多病例因結(jié)甲、腺瘤等病因手術(shù)。在冰凍過程中又因結(jié)節(jié)小而漏檢，診斷時(shí)因合并組織鈣化、間質(zhì)硬化，或良、惡性腫瘤因相近的組織結(jié)構(gòu)及合并冰凍制片假象等，造成術(shù)中診斷困難。故術(shù)中冰凍過程中細(xì)胞學(xué)形態(tài)的清晰呈現(xiàn)至關(guān)重要。

本研究檢出甲狀腺乳頭狀癌124例，其中甲狀腺微小乳頭狀癌84例，占67.7%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于馮紅芳等[5]報(bào)道的19.21%。最大徑小于0.3cm 的甲狀腺微小癌往往是在巨檢中偶然發(fā)現(xiàn)的，易于遺漏。本組研究漏診5例，均＜0.3cm，2例合并結(jié)甲，2例合并橋本，1 例在石蠟切片中檢見，最大徑0.1cm。

甲狀腺髓樣癌因發(fā)病率較低，而認(rèn)識(shí)不足，誤診率高。本研究甲狀腺髓樣癌1例最大徑約0.25cm，冰凍切片不除外甲狀腺乳頭狀癌；刮片中細(xì)胞呈上皮樣、漿細(xì)胞樣，胞漿豐富，染色質(zhì)細(xì)膩，呈胡椒鹽樣；兩者聯(lián)合診斷甲狀腺髓樣癌，后經(jīng)石蠟切片及免疫組化染色Calcitonin陽(yáng)性予以證實(shí)。

本研究印片輔助診斷結(jié)果陽(yáng)性率為84.5%。即使對(duì)于巨檢具有明顯乳頭狀外觀的，常規(guī)明確診斷甲狀腺乳頭狀癌，仔細(xì)閱片可發(fā)現(xiàn)印片與刮片兩種制片方式效果差異明顯。很多印片中腫瘤細(xì)胞數(shù)量較少，不能為診斷提供可靠依據(jù)。而采用刮片可以獲得更多可疑癌結(jié)節(jié)的細(xì)胞，更加清晰的顯示核的特征（尤其是含有乳頭狀結(jié)構(gòu)的病例往往可以看到組織結(jié)構(gòu)），刮片輔助診斷結(jié)果陽(yáng)性率為95.5%，其為診斷提供充分依據(jù)。

此外，對(duì)同一可疑甲狀腺癌結(jié)節(jié)可以進(jìn)行多次刮取獲得更多細(xì)胞，使具有豐富硬化區(qū)及體積較小的病例亦可獲得良好制片。對(duì)于結(jié)節(jié)體積很大及中央?yún)^(qū)組織硬化、退變、壞死的可疑甲狀腺癌結(jié)節(jié)，往往在結(jié)節(jié)邊緣區(qū)尚存病變組織或局部病變細(xì)胞更活躍，可以在結(jié)節(jié)邊緣部由內(nèi)向外呈放射狀刮取。對(duì)于具有包膜或界限清晰的病變可以對(duì)相鄰可疑癌結(jié)節(jié)及包膜外結(jié)節(jié)分別刮取，實(shí)現(xiàn)可選擇性的針對(duì)性制片。細(xì)胞制片時(shí)選擇普通玻片，涂片后應(yīng)立即固定，以防細(xì)胞腫脹；染色不可太深，以免影響細(xì)胞核結(jié)構(gòu)的觀察。本研究刮片聯(lián)合冰凍切片診斷較之單獨(dú)冰凍、印片聯(lián)合冰凍切片的診斷確診率有明顯提高（均P ＜0.05）。

綜上所述，刮片是一種簡(jiǎn)單易行、便捷高效的甲狀腺術(shù)中診斷方法，可收集更多細(xì)胞，甚至少量組織，便于觀察核特征，為術(shù)中冰凍診斷提供更充分可靠的依據(jù)。