盧波，王瑞春，王秋生，孟波，陳駿萍

疼痛的感覺部分和情緒部分由不同的神經(jīng)傳導(dǎo)通路傳導(dǎo)，而且最終對其進行整合、調(diào)控和處理的大腦腦區(qū)也并不完全相同。研究表明，邊緣系統(tǒng)中的前扣帶皮層（ACC）與痛情緒的形成與維持密切相關(guān)[1-2]，目前對其具體機制尚不清楚。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）參與脊髓水平的痛覺中樞敏化和ACC腦區(qū)的痛情緒調(diào)控[3-5]。腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）是mTOR通路的上游信號分子，通過負性調(diào)控mTOR 通路參與蛋白質(zhì)的合成，進而作用于脊髓背角神經(jīng)元的中樞敏化[6]。但是，關(guān)于mTOR 通路調(diào)控痛情緒的形成過程是否依賴于AMPK 的活性變化，目前尚不清楚?；诖耍狙芯繑M觀察激活A(yù)CC 腦區(qū)AMPK 對大鼠痛情緒反應(yīng)以及mTOR活性的影響。報道如下。

1 資料與方法

1.1 實驗動物 雄性清潔級SD大鼠30只，體質(zhì)量230 ～300 g，購自浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心，飼養(yǎng)于寧波大學(xué)SPF 級實驗動物中心。本研究在實施前已獲得寧波大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 實驗分組 將大鼠隨機分為甲醛模型組（F組）、AMPK激動劑組（A組）和溶劑對照組（C 組），各10 只。所有大鼠均在七氟烷麻醉下建立甲醛炎性痛模型，在左側(cè)足底皮下注射5%甲醛溶液50 l，建立模型。

1.3 方法 ACC腦區(qū)置管和藥物輸注大鼠麻醉后頭部固定于腦立體定位儀上，門齒桿－ 3.3 mm。檢測是否固定成功的標(biāo)準(zhǔn)：鼻對正中，頭部不動，提尾不掉。按照大鼠腦圖譜選取ACC坐標(biāo)（AP：+2.6mm，L：±0.6 mm，H：－ 2.5 mm）。用牙科鉆于進針點處鉆一小孔，深度至硬腦膜。將外套管緩慢植入，并以牙托粉固定于顱骨表面。待牙托粉凝固后，外套管塞入長度較套管長0.2 mm 的不銹鋼內(nèi)芯并蓋上導(dǎo)管蓋。術(shù)后隔天插拔內(nèi)芯一次，防止套管堵塞。

A 組和C 組于建模前20 min 經(jīng)套管注射相應(yīng)藥物或溶劑。以七氟烷麻醉，將套管內(nèi)芯拔出，插入注射內(nèi)管，注射內(nèi)管尖端長于套管0.2 mm，末端通過PE-10 軟管連接微量進樣器。雙側(cè)ACC給藥，每側(cè)注射0.5 l 藥物或溶劑。其中，AICAR（Sigma公司，美國）用DMSO溶解，PBS稀釋（DMSO終濃度為0.5%）為20 mol/L，溶劑對照為0.5% DMSO。在3 min 內(nèi)注射完畢，隨后留針5 min，防止液體溢出，使藥液充分擴散。

1.4 甲醛條件位置回避訓(xùn)練（F-CPA）CPA 訓(xùn)練箱由3 個小室組成，其中A、B室等大并排放置，C室位于A、B室前方。A室壁為黑白相間的垂直條帶，以1%醋酸溶液作為氣味劑；B 室壁為黑白相間的水平條帶，以1%桂皮水作為氣味劑；C 室內(nèi)壁灰色，無標(biāo)記，無氣味。

第1 天，將大鼠放入C室，待其進入A 或B 室后，關(guān)閉C 室與A、B 室間的小門，記錄15 min 內(nèi)動物在A、B 室的停留時間。第2 ～3 天，大鼠不經(jīng)任何處理直接放入甲醛非條件匹配室，任其在內(nèi)自由活動45 min。間隔4 h 后，大鼠左側(cè)足底注射甲醛或0.9%氯化鈉注射液后放入甲醛條件匹配室（A 或B 室，信封法隨機選擇），同樣使其在內(nèi)45 min 后取出。第4 天，操作過程同第1 天，記錄大鼠15 min 內(nèi)在A 和B 室所停留的時間。計算回避分數(shù)（訓(xùn)練前后在甲醛條件室停留的時間差值）以評價大鼠是否形成條件性位置回避，回避分數(shù)越高提示痛情緒越顯著。

1.5 免疫印跡 CPA行為學(xué)結(jié)束后，大鼠被過量的七氟烷麻醉處死，取ACC（AP 3.7 ～0.7 mm）。加入裂解液并破碎組織，4 ℃離心30 min，取適量上清液用BCA 試劑盒測蛋白濃度。剩余上清液取適量，按上清液：5×Loading buffer為4：1 的量加入5×Loading buffer。放入99.9 ℃水浴煮沸5 ～10 min，之后將樣品分裝―80℃條件保存。

根據(jù)蛋白濃度確定上樣量。電壓設(shè)定60 V 待條帶壓成一條線后調(diào)整為80 V 跑膠，結(jié)束后用100 V，90 min 轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜前需先用甲醇活化PVDF 膜。轉(zhuǎn)膜后加入5 ml 封閉液室溫封閉1 h。封閉后加兔來源的抗磷酸化mtor（Ser2448，cat no.2971，1∶500，CST 公司）和小鼠來源抗-actin抗體（1∶2 000，Santa cruz公司）4 ℃搖床孵育過夜。用1×TBST 清洗之后加二抗室溫避光孵育1 h 后，紅外熒光掃描儀曝光。使用ImageJ 軟件（NIH，Bethesda，MD USA）對Western blot 結(jié)果的灰度圖像進行半定量分析。

1.6 統(tǒng)計方法 數(shù)據(jù)采用GraphpadPrism7.0 統(tǒng)計軟件分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用F檢驗，多重比較采用Bonferroni檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 痛情緒比較 與CPA 訓(xùn)練之前相比，F(xiàn) 組和C 組大鼠訓(xùn)練后在條件室內(nèi)停留時間明顯減少（t=4.34、6.63，均P＜0.01）。A 組大鼠訓(xùn)練前后在條件室內(nèi)停留時間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=1.34，P＞0.05）。3 組大鼠回避分數(shù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=3.68，P ＜0.05），其中A 組回避分數(shù)顯著低于C 組和F 組（t=2.39、2.30，均P ＜0.05）。見封四彩圖5 ～6。

2.2 ACC中mTOR磷酸化形式（p-mTOR）的表達 3 組大鼠ACC 中p-mTOR 表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=8.67，P ＜0.01），其中A組顯著低于F組和C組（t=2.39、2.30，均P ＜0.05）。見封四彩圖7。

3 討論

外周疼痛刺激信息經(jīng)脊髓背角投射至高位中樞后，大腦的不同腦區(qū)以相互分工、相互聯(lián)系的方式整合、處理和調(diào)控疼痛感覺和疼痛情緒信息，其中ACC主要負責(zé)處理疼痛相關(guān)的負性情緒信息，并促進疼痛相關(guān)情感、認知和反應(yīng)的抉擇[1-2,7]。然而，目前對其具體的細胞和分子機制了解較少。筆者前期研究表明，慢性疼痛（甲醛疼痛刺激）可誘導(dǎo)ACC內(nèi)p-mTOR、p-p70S6K表達的顯著上調(diào)，預(yù)先給予雷帕霉素可阻斷痛情緒行為的產(chǎn)生[5]。在此基礎(chǔ)上，本研究進一步發(fā)現(xiàn)，激活A(yù)MPK 同樣能夠削弱甲醛誘導(dǎo)的痛情緒，并且其機制可能與AMPK 負性調(diào)控mTOR 磷酸化表達降低有關(guān)。

研究顯示，AMPK 通過對mTOR 信號通路的負性調(diào)控，參與了痛覺中樞敏化的形成[8-10]。脊神經(jīng)結(jié)扎的動物模型上，脊髓背角p-AMPK 的表達顯著減少[10]；AMPK 激動劑可抑制mTOR 的活性和下游翻譯元件的表達，抑制蛋白翻譯，進而減輕外周神經(jīng)損傷或手術(shù)切口引起的觸誘發(fā)痛；并且，AMPK激動劑可顯著降低離體背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的興奮性[8-9]。這些研究證據(jù)提示了AMPK/mTOR 通路在慢性疼痛中發(fā)揮著重要作用。本研究結(jié)果初步提示了ACC 腦區(qū)中AMPK通過調(diào)控其下游mTOR通路參與痛情緒的形成和發(fā)展，但是仍有諸多問題尚需進一步研究，如：（1）慢性疼痛的經(jīng)典分子ERK 同樣受AMPK 的調(diào)控[9]，那么ERK通路與mTOR通路是否存在關(guān)聯(lián)？（2）AMPK 目前有多種激動劑，如AICAR、二甲雙胍等[11]，不同的激動劑是否產(chǎn)生同樣的鎮(zhèn)痛效果？（3）F-CPA 將疼痛與情緒分開，目的是為了在研究痛情緒時不受痛感覺的干擾，然而近年來痛與負性情緒（如抑郁）共患也是疼痛研究熱點，AMPK-mTOR 通路在不同痛情緒模型中的作用也值得研究者進行探討。

綜上所述，激活A(yù)CC腦區(qū)AMPK能夠削弱甲醛炎性痛誘導(dǎo)的痛情緒，其機制與AMPK 調(diào)控mTOR 活性的變化有關(guān)。