陳聰，趙雪強(qiáng)，林云，蔣碧佳，李寧，銀建華，盧春蘭，周成風(fēng)，曾錦榮

桂林醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，廣西桂林541199

肺癌是引起人類死亡最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。隨著手術(shù)、放化療、靶向治療及免疫治療等綜合治療的開(kāi)展，肺癌患者的中位生存期較前明顯延長(zhǎng)，但骨轉(zhuǎn)移發(fā)生率亦隨之增高。這導(dǎo)致肺癌患者治療負(fù)擔(dān)日益加重，必須采用積極有效的防治措施。趨化因子受體4（CXCR4）于2001年被發(fā)現(xiàn)，在惡性腫瘤組織中表達(dá)升高，并與疾病的不良預(yù)后有關(guān)［1］。趨化因子12（CXCL12）是CXCR4 的惟一配體，其水平反映CXCR4 活性。CXCL12/CXCR4 通路與白細(xì)胞運(yùn)輸、癌性骨痛和術(shù)后疼痛等一系列生理、生化及病理過(guò)程有關(guān)，也是腫瘤細(xì)胞與體內(nèi)微環(huán)境溝通的重要物質(zhì)［2］。白細(xì)胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）是常見(jiàn)的炎癥細(xì)胞因子，其在腫瘤骨侵襲破壞的微環(huán)境中起促進(jìn)作用。2019年10 月—2021年2 月，我們觀察了CXCR4 競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑AMD3100干預(yù)肺腺癌A549 細(xì)胞與破骨細(xì)胞前體細(xì)胞共培養(yǎng)后破骨細(xì)胞的分化情況，初步探討通過(guò)抑制CX?CL12/CXCR4是否能影響破骨細(xì)胞的分化及其可能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料 人肺腺癌細(xì)胞株A549、破骨細(xì)胞前體細(xì)胞（小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞RAW264.7）均購(gòu)于中科院昆明細(xì)胞庫(kù)；AMD3100購(gòu)自上海陶素生化科技有限公司；胎牛血清（FBS）、DMEM 培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾科技公司；Transwell 小室購(gòu)自美國(guó)康寧公司；抗酒石酸堿性磷酸酶（TRAP）染色試劑盒購(gòu)自上海貝博生物科技有限公司；TRNzol Universal 總RNA 提取試劑、第一鏈cDNA 合成試劑盒及破骨細(xì)胞標(biāo)志物組織蛋白酶K（CTSK）、降鈣素受體（CTR）、TRAP、破骨細(xì)胞分化因子受體（RANK）熒光定量試劑盒均購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；CXCL12、IL-6、TNF-α 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢云克隆科技股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 RAW264.7、A549細(xì)胞培養(yǎng) 將RAW264.7、A549 細(xì)胞分別接種于含10% FBS 的高糖DMEM 培養(yǎng)液中，在37 ℃、5% CO2下培養(yǎng)，2～3 d 傳代1 次，待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 RAW264.7 細(xì)胞分組與干預(yù)處理 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549 和RAW264.7 細(xì)胞，PBS 洗滌2 遍后胰酶消化A549 細(xì)胞，吹落RAW264.7 細(xì)胞；以800 r/min 離心5 min，加入配制好的DMEM 培養(yǎng)基分別制備成1×104/mL 的A549 單細(xì)胞懸液及2×103/mL 的RAW264.7 單細(xì)胞懸液，并將RAW264.7細(xì)胞隨機(jī)分為干預(yù)組和對(duì)照組。兩組均在6 孔的Transwell 下室接種RAW264.7 細(xì)胞，上室接種A549細(xì)胞，并保證上室的細(xì)胞培養(yǎng)在下室培養(yǎng)基中；干預(yù)組在小室內(nèi)分別加入含12.5、25.0、50.0、100.0 μg/mL AMD3100的培養(yǎng)基，對(duì)照組僅加入培養(yǎng)基；兩組均置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，每2～3 d 換液1 次。

1.2.3 RAW264.7 細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化情況觀察 采用TRAP 染色法。取用兩組培養(yǎng)7 d 的Tran?swell 小室，去除Transwell 上室，棄除下室內(nèi)剩余培養(yǎng)基；用PBS 洗滌2 遍，用TRAP 固定液4 ℃避光固定60 s；水洗，稍微晾干。加入TRAP孵育液工作液，37 ℃避光浸染1 h 后水洗；用蘇木紫染色液復(fù)染4 min后水洗晾干，鏡檢。在高倍光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)取5 個(gè)視野并進(jìn)行計(jì)數(shù)，細(xì)胞核數(shù)目≥3 個(gè)且TRAP染色陽(yáng)性視為破骨細(xì)胞。

1.2.4 破骨細(xì)胞標(biāo)志物CTSK、CTR、TRAP、RANK mRNA 表達(dá)檢測(cè) 采用qPCR 法。取兩組培養(yǎng)7 d 的Transwell 小室，去除Transwell 上室，棄除下室內(nèi)剩余培養(yǎng)基；用PBS 洗滌2 遍，用TRIzol 試劑從細(xì)胞中提取總RNA；按提供的試劑操作步驟進(jìn)行操作，用第一鏈cDNA 合成試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。引物序列：CTSK 上游為5′-TATGACCACT?GCCTTCCAATAC-3′，下游為5′-GCCGTGGGGT?TATACATACA-3′；CTR上游為5′-CTGATTGTCATG?GCTGTGTTTAC-3′，下游為5′-GCCGTGGGGTTATA?CATACA-3′，TRAP 上游為5′-GTCAAGAACTTGC?GACCATTG-3′，下游為5′-CGTTCTCGTCCTGAA?GATACTG-3′；RANK 上游為5′-GAAGATTCCCA?CAGAGGATGAG-3′，下游為5′-TTGCTTCCCTGCT?GGATTAG-3′；內(nèi)參GAPDH 上游為5′- GGAGA?AACCTGCCAAGTATGA -3′，下游為5′- TCCTCAGT?GTAGCCCAAGA -3′。qPCR 反應(yīng)體系10 μL；反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性15 min 后，95 ℃變性10 s，60 ℃退火、延伸25 s，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，通過(guò)2-ΔΔCt法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5 小室上清液中細(xì)胞因子CXCL12、IL-6、TNF-α 水平檢測(cè) 采集Transwell 小室上清液，采用ELISA 法檢測(cè)CXCL12、IL-6、TNF-α，按試劑盒操作步驟進(jìn)行操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s 表示，多組間比較行多因素方差分析，組間兩兩比較行LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組RAW264.7 細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞的數(shù)量比較 干預(yù)組在12.5、25.0、50.0、100.0 μg/mL AMD3100 處理后，RAW264.7 細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化數(shù)量分別為（81 ± 3）、（49 ± 3）、（34 ± 3）、（11 ± 2）個(gè)，均低于對(duì)照組的（99 ± 5）個(gè)（P均<0.05）；且隨著AMD3100 處理濃度的增加，RAW264.7 細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化數(shù)量逐漸減少（P均<0.05）。

2.2 兩組破骨細(xì)胞標(biāo)志物CTSK、CTR、TRAP、RANK mRNA 表達(dá)比較 與對(duì)照組比較，干預(yù)組在不同濃度AMD3100 干預(yù)后破骨細(xì)胞標(biāo)志物CTSK、CTR、TRAP、RANK mRNA 表達(dá)減少（P均<0.05）；且隨著AMD3100處理濃度的增加，破骨細(xì)胞各標(biāo)志物表達(dá)逐漸減少（P均<0.05）。見(jiàn)表1。

表1 兩組破骨細(xì)胞標(biāo)志物TRAP、CTSK、CTR、RANK mRNA表達(dá)比較（±s）

表1 兩組破骨細(xì)胞標(biāo)志物TRAP、CTSK、CTR、RANK mRNA表達(dá)比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與干預(yù)組上一濃度比較，#P<0.05。

組別干預(yù)組12.5 μg/mL AMD3100 25.0 μg/mL AMD3100 50.0 μg/mL AMD3100 100.0 μg/mL AMD3100對(duì)照組TRAP mRNA 0.69 ± 0.04*0.45 ± 0.03*#0.28 ± 0.02*#0.21 ± 0.02*#1.00 ± 0.02 CTSK mRNA 0.72 ± 0.08*0.37 ± 0.03*#0.32 ± 0.01*#0.14 ± 0.03*#1.00 ± 0.02 CTR mRNA 0.66 ± 0.04*0.50 ± 0.03*#0.38 ± 0.04*#0.23 ± 0.04*#1.00 ± 0.03 RANK mRNA 0.52 ± 0.04*0.33 ± 0.01*#0.19 ± 0.04*#0.12 ± 0.01*#1.00 ± 0.01

2.3 兩組小室上清液CXCL12、IL-6、TNF-α 水平比較 與對(duì)照組比較，干預(yù)組在不同濃度AMD3100干預(yù)后小室上清液CXCL12、IL-6、TNF-α 水平降低（P均<0.05）；且隨著AMD3100 處理濃度的增加，小室上清液CXCL12、IL-6、TNF-α 水平逐漸降低（P均<0.05）。見(jiàn)表2。

表2 兩組小室上清液CXCL12、IL-6、TNF-α水平比較（±s）

表2 兩組小室上清液CXCL12、IL-6、TNF-α水平比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與干預(yù)組上一濃度比較，#P<0.05。

組別干預(yù)組12.5 μg/mL AMD3100 25.0 μg/mL AMD3100 50.0 μg/mL AMD3100 100.0 μg/mL AMD3100對(duì)照組CXCL12（ng/mL）22.69 ± 3.43*16.80 ± 0.92*#13.02 ± 0.57*#4.33 ± 1.49*#36.27 ± 1.80 IL-6（pg/mL）42.17 ± 2.35*34.00 ± 3.25*#25.26 ± 2.60*#6.71 ± 1.61*#62.75 ± 2.52 TNF-α（pg/mL）65.46 ± 5.28*#46.83 ± 1.04*#33.51 ± 0.51*#16.79 ± 6.74*#94.59 ± 3.38

3 討論

肺癌是近年來(lái)引起人類死亡最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，經(jīng)過(guò)手術(shù)、放化療、靶向治療及免疫治療等綜合治療后，患者的中位生存期較前明顯延長(zhǎng)［3］，但肺癌骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生率亦隨之增高。肺癌發(fā)生骨轉(zhuǎn)移時(shí)，腫瘤細(xì)胞首先與細(xì)胞外基質(zhì)分離，然后遷移、侵襲并滲入血液循環(huán)中，當(dāng)其到達(dá)骨骼后繼續(xù)增殖并形成新的腫瘤轉(zhuǎn)移灶。骨轉(zhuǎn)移一旦發(fā)生，往往預(yù)后較差，是臨床上降低肺癌患者生活質(zhì)量和影響其生存的重要因素。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞、破骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和骨基質(zhì)細(xì)胞相互作用，促進(jìn)溶骨性骨轉(zhuǎn)移的形成和發(fā)展，抑制以上任何一個(gè)因素都有可能降低骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生率。

近年來(lái)，對(duì)于趨化因子及其受體與肺癌的研究逐漸成為熱點(diǎn)。目前，已經(jīng)明確CXCR4在多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，其在肺癌患者原發(fā)病灶組織、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)及骨轉(zhuǎn)移灶的表達(dá)均有升高［4］，并與腫瘤生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移有關(guān)［5］。CXCL12是CXCR4的惟一配體，兩者構(gòu)成CXCL12/CXCR4啟動(dòng)下游信號(hào)通路以維持組織體內(nèi)的平衡，在參與免疫細(xì)胞的生存與轉(zhuǎn)運(yùn)的同時(shí)也支持腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移［2］。 CXCR4 拮抗劑AMD3100 的作用基礎(chǔ)是競(jìng)爭(zhēng)性抑制CXCL12 與CXCR4結(jié)合，抑制CXCL12/CXCR4造成的生物學(xué)效應(yīng)。在該實(shí)驗(yàn)中我們使用AMD3100干預(yù)肺癌骨轉(zhuǎn)移模型，通過(guò)TRAP染色確定使用AMD3100干預(yù)后肺癌骨轉(zhuǎn)移模型中破骨細(xì)胞數(shù)量減少；通過(guò)對(duì)共培養(yǎng)模型中細(xì)胞mRNA的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)破骨細(xì)胞標(biāo)記基因CTSK、CTR、TRAP、RANK mRNA表達(dá)減少；在共培養(yǎng)模型上清液中檢測(cè)到IL-6、TNF-α及CXCL12分泌下降。

破骨細(xì)胞是由骨髓中髓系祖細(xì)胞分化而成的單核巨噬細(xì)胞相互融合形成的多核巨細(xì)胞［6］，其分化的經(jīng)典信號(hào)通路包括巨噬細(xì)胞集落刺激因子（MCSF）、NF-κB配體RANKL以及免疫受體酪氨酸活化基序（ITAM）共刺激信號(hào)通路［7］。破骨細(xì)胞分化的典型途徑需要存在RANKL 和M-CSF 的受體激活劑，但一部分細(xì)胞因子或生長(zhǎng)因子可以替代RANKL或M-CSF 以誘導(dǎo)破骨細(xì)胞形成，如TNF-α、IL-6、IL-11 和IL-8 等；同時(shí)，這些生長(zhǎng)因子也可以影響RANKL/M-CSF誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成［8］。研究顯示，IL-6在肺癌細(xì)胞株高分泌，并能增加肺癌細(xì)胞上皮—間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移進(jìn)而影響肺癌的轉(zhuǎn)移［9-10］；有回顧性研究表明，IL-6 的高分泌與骨轉(zhuǎn)移的發(fā)展有顯著相關(guān)性［11］。TNF-α 是一種多功能細(xì)胞因子，其持續(xù)高分泌可以促進(jìn)腫瘤的侵襲，而TNF-α 高分泌腫瘤患者通常具有較高的轉(zhuǎn)移率與復(fù)發(fā)率［12］。研究發(fā)現(xiàn)，破骨細(xì)胞的形成離不開(kāi)其細(xì)胞外基質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)。在肺癌骨轉(zhuǎn)移病灶中，一系列的細(xì)胞因子、趨化因子對(duì)骨轉(zhuǎn)移灶的形成與進(jìn)展起重要作用，如CXCL12、IL-6、TNF-α、RANKL 等，這些因子可以促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化、增殖和活化［13］。在肺癌骨轉(zhuǎn)移病灶中，CXCL12、IL-6、TNF-α、RANKL 等一系列細(xì)胞因子、趨化因子對(duì)骨轉(zhuǎn)移灶的形成與進(jìn)展起重要作用，并促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化、增殖和活化；不斷生成的腫瘤細(xì)胞會(huì)分泌更多的因子，促進(jìn)破骨細(xì)胞的生成，導(dǎo)致發(fā)生進(jìn)一步的溶骨，形成“惡性循環(huán)”，進(jìn)而在骨組織局部形成腫瘤微轉(zhuǎn)移灶［14］。

綜上所述，AMD3100 通過(guò)影響CXCL12/CXCR4通路活性，減少細(xì)胞因子如IL-6、TNF-α 和CXCL12的分泌，抑制人肺腺癌細(xì)胞誘導(dǎo)破骨細(xì)胞前體細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化，并可能因此抑制肺癌骨轉(zhuǎn)移病灶的發(fā)生和發(fā)展。但是，通過(guò)影響CXCL12/CXCR4 是如何降低IL-6、TNF-α 和CXCL12 的分泌，以及過(guò)表達(dá)CXCR4 及沉默CXCR4 又會(huì)如何影響肺癌骨轉(zhuǎn)移中的細(xì)胞因子及基因，仍需要繼續(xù)探索。