黃云，傅文凡，戴璐，江澤勇，吳文杰，趙健

廣州醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院胸外科，廣州510095

肺癌是常見的惡性腫瘤，分為非小細胞肺癌（NSCLC）和小細胞肺癌（SCLC）兩種主要的組織學亞型，其中NSCLC是最主要的發(fā)病類型［1］。據(jù)統(tǒng)計，60% 以上的NSCLC 患者在初次就診時就發(fā)現(xiàn)有惡性腫瘤轉(zhuǎn)移而失去了手術機會，而50% 以上接受手術治療的NSCLC患者會再次復發(fā)并出現(xiàn)轉(zhuǎn)移［2］。因此，探索NSCLC 轉(zhuǎn)移的機制對改善NSCLC 患者生存率具有重要意義。長鏈非編碼RNA（lncRNA）是一類長度大于200 nt 的不編碼蛋白質(zhì)RNA 分子，主要通過與蛋白質(zhì)、miRNA 和mRNA 等大分子相互作用來參與表觀遺傳、基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)翻譯等分子調(diào)控過程，從而參與調(diào)控細胞的增殖、凋亡和遷移［3］。研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA 的異常表達與惡性腫瘤密切相關［4］。我們前期通過TCGA 數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，lncRNA LINC01176在NSCLC細胞中表達上調(diào)，但其在NSCLC 中的作用機制尚不明確。上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是指上皮細胞通過特定程序轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細胞的生物學過程，其主要的特征有細胞黏附分子（如E-cadherin）表達減少、細胞骨架由角蛋白為主轉(zhuǎn)化為波形蛋白（Vimentin）為主等［5］。NSCLC 是上皮細胞來源的腫瘤，NSCLC 上皮細胞發(fā)生間質(zhì)化改變是轉(zhuǎn)移過程中至關重要的一個步驟［6］。2020年10 月—2021年5 月，本研究觀察了LINC01176在NSCLC細胞中的表達情況及其對腫瘤細胞侵襲和遷移的影響，并探討其是否通過調(diào)控EMT參與腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移過程。

1 材料與方法

1.1 主要材料 人正常肺上皮細胞株16HBE，人NSCLC 細胞株A549、H1299、H1975和H1650均購自武漢普諾賽公司；LINC01176 siRNA 和LINC01176 siRNA 對照無干擾序列由上海吉瑪基因公司設計合成。1640 培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶購自美國Gibco公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本ToYoBo公司，實時熒光定量檢測試劑盒購自日本TaKaRa 公司，Tranwell小室購自美國Corning公司。上皮標志物Ecadherin、間質(zhì)標志物Vimentin 一抗及二抗均購自美國CST公司，GAPDH抗體購自美國Affinity公司。

1.2 正常肺上皮細胞、NSCLC 細胞培養(yǎng)及LINC01176 表達檢測 用含10% 胎牛血清的1640完全培養(yǎng)基分別培養(yǎng)正常肺上皮細胞16HBE，NSCLC 細胞A549、H1299、H1975 和H1650，將細胞置于37 ℃、5% CO2飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中，每2 d更換一次新鮮培養(yǎng)基。當細胞融和度達80%～90%時，用0.25% 的Trypsin-EDTA 溶液消化傳代。采用實時熒光定量PCR法檢測LINC01176表達。收集對數(shù)生長期的16HBE、A549、H1299、H1975 和H1650細胞，使用TRIzol 試劑分別提取細胞總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA 為模板進行PCR 擴增。引物序列：LINC01176 上游引物為5′-TGGATGGTTTAGCATTATCCC-3＇，下游引物為5′-CTCCAGCCAATACTTTAAACAG-3′；GAPDH上游引物為5′-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3′，下游引物為5′-GCCATCACGCCACAGTTTC-3′。以GAPDH 為內(nèi)參，按2-ΔΔCt計算LINC01176 相對表達量。取LINC01176 相對表達量最高的NSCLC 細胞進行后續(xù)研究。

1.3 NSCLC 細胞分組與轉(zhuǎn)染 細胞轉(zhuǎn)染前1 d 用6孔板鋪板，每孔細胞數(shù)為2×105～4×105，待細胞融合率達70%～80%即可進行轉(zhuǎn)染。將細胞分為轉(zhuǎn)染敲低組和轉(zhuǎn)染對照組，分別按照LipofectamineTM3000試劑盒說明書轉(zhuǎn)染LINC01176 siRNA 和LINC01176 siRNA對照無干擾序列48 h。

1.4 NSCLC 細胞侵襲能力觀察 采用Transwell 實驗。取對數(shù)生長期的兩組細胞，用無血清1640 培養(yǎng)基制作細胞懸液，離心重懸后調(diào)整細胞密度至5×105/mL，以5×104/孔接種于上室，取500 μL 含10%胎牛血清的1640 培養(yǎng)基置于下室。37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h 后取出Transwell 小室，PBS 清洗1 遍，甲 醇固定20 min，1% 結晶 紫染色15 min，用棉簽輕柔擦去上室未遷移細胞后用水清洗并晾干。小室干后將小室置于倒置顯微鏡下直接計算下室穿膜細胞數(shù)并拍照，穿膜細胞數(shù)越多表示細胞侵襲能力越強。

1.5 NSCLC 細胞遷移能力觀察 采用細胞劃痕實驗。使用馬克筆在6 孔板背后沿直尺均勻劃5 條橫線，間隔為0.5～1.0 cm，橫穿過孔。取兩組細胞常規(guī)消化，以5×105/孔接種至6 孔板過夜培養(yǎng)，使用小槍頭沿直尺盡量垂直于背后的橫線在6 孔板中間劃痕。PBS 洗滌3 次，洗去劃下的細胞。加入無血清培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)并拍照（0 h），12 h后在相同位置拍照，使用熒光倒置顯微鏡標尺計算0 h～12 h的細胞遷移距離。

1.6 NSCLC細胞EMT情況觀察

1.6.1 E-cadherin、Vimentin mRNA 表達檢測 采用實時熒光定量PCR 法。取對數(shù)生長期的兩組細胞，操作方法同“1.3”。引物序列：E-cadherin 上游引物5′-GGGGTCTGTCATGGAAGGTG-3′，下游引物5′-CGACGTTAGCCTCGTTCTCA-3′；Vimentin 上 游引物5′-GCACATTCGAGCAAAGACAGG-3′，下游引物5′-TGAGGGCTCCTAGCGGTTTA-3′。以GAPDH為內(nèi)參，按2-ΔΔCt計算E-cadherin、Vimentin mRNA 的相對表達量。

1.6.2 E-cadherin、Vimentin 蛋白表達檢測 采用Western Blotting 法。收集對數(shù)生長期的兩組細胞，加入適量RIPA 裂解液和蛋白酶抑制劑PMSF；冰浴裂解細胞15 min，用細胞刮刮取裂解物并將其吸入1.5 mL 的EP 管中；超聲裂解8 次后4 ℃12 000 g 離心15 min，吸取上清液至另一1.5 mL的EP管。BCA試劑盒測量蛋白濃度，100 ℃煮沸10 min 后進行SDS-PAGE 電泳。電泳后將蛋白濕轉(zhuǎn)于PVDF 膜上，5%脫脂牛奶封閉2 h后，剪下所需的目的條帶；加入E-cadherin、Vimentin 一抗，4 ℃平衡搖床輕搖孵育過夜。PBST搖床漂洗3次，每次10 min；加入相應二抗搖床孵育，PBST 搖床漂洗3 次，每次10 min；用ECL發(fā)光液發(fā)光顯影，測定各條帶灰度值，以目的蛋白條帶與內(nèi)參GAPDH 條帶灰度值的比值表示E-cadherin、Vimentin蛋白相對表達量。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS25.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以± s 表示，組間比較行t檢驗。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 LINC01176 在正常肺上皮細胞及NSCLC 細胞中的表達比較 LINC01176 在正常肺上皮細胞16HBE 及NSCLC 細胞A549、H1299、H1975 和H1650 中的相對表達量分別為1.00 ± 0.01、6.82 ±0.33、13.19 ± 1.50、99.35 ± 0.81、6.89 ± 1.73，LINC01176在NSCLC細胞中的相對表達量均高于正常肺上皮細胞（P均<0.05），其中H1975 細胞的LINC01176表達量最高。

2.2 LINC01176 對H1975 細胞侵襲的影響 轉(zhuǎn)染敲低組和轉(zhuǎn)染對照組穿膜細胞數(shù)分別為（847.33 ±50.06）、（1 715.67 ± 55.47）個，轉(zhuǎn)染敲低組穿膜細胞數(shù)少于轉(zhuǎn)染對照組（P<0.05）。

2.3 LINC01176對H1975細胞遷移的影響 轉(zhuǎn)染敲低組和轉(zhuǎn)染對照組細胞遷移距離分別為（489.37 ±16.14）、（556.07 ± 12.41）μm，轉(zhuǎn)染敲低組細胞遷移距離小于轉(zhuǎn)染對照組（P<0.05）。見圖1。

圖1 LINC01176對H1975細胞遷移的影響（細胞劃痕實驗）

2.4 LINC01176對H1975細胞E-cadherin、Vimentin表達的影響 轉(zhuǎn)染敲低組E-cadherin mRNA 及蛋白表達量均高于轉(zhuǎn)染對照組，Vimentin mRNA 及蛋白表達量均低于轉(zhuǎn)染對照組（P均<0.05）。見表1。

表1 LINC01176對H1975細胞E-cadherin、Vimentin蛋白表達的影響（ ± s）

表1 LINC01176對H1975細胞E-cadherin、Vimentin蛋白表達的影響（ ± s）

注：與轉(zhuǎn)染對照組比較，*P<0.05。

組別轉(zhuǎn)染對照組轉(zhuǎn)染敲低組E-cadherin mRNA 1.00 ± 0.09 2.58 ± 0.20*蛋白1.00 ± 0.13 3.36 ± 0.08*Vimentin mRNA 1.00 ± 0.15 0.51 ± 0.03*蛋白1.00 ± 0.10 0.58 ± 0.05*

3 討論

腫瘤細胞轉(zhuǎn)移是包括肺癌在內(nèi)的惡性腫瘤致命的主要原因，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA 參與調(diào)控惡性腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移［7］。研究顯示，lncRNA 肺腺癌轉(zhuǎn)移相關轉(zhuǎn)錄物1（MALAT1）可作為調(diào)控miR124/STAT3 和miR206/AKT 信號通路的競爭性內(nèi)源RNA（ceRNA）促進肺癌的發(fā)生發(fā)展，其還可通過與人體抑癌基因p53啟動子結合來抑制p53活性，調(diào)控影響肺腫瘤細胞周期進展的下游基因，促進肺腫瘤細胞的遷移和侵襲［8］。lncRNA HOX 轉(zhuǎn)錄反義RNA（HO?TAIR）被發(fā)現(xiàn)在肺腫瘤組織中高表達，可促進肺腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲［9］。lncRNA 肺癌相關轉(zhuǎn)錄本1（LCAT1）可通過吸附miR-4715-5p 作為ceRNA發(fā)揮促癌作用，其在肺腫瘤組織中表達上調(diào)，且其上調(diào)程度與肺癌患者的預后成反比［10］。本研究通過TCGA 數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，LINC01176 在NSCLC 中表達上調(diào)，這與我們的實時熒光定量PCR 結果相一致。進一步分析LINC01176 對NSCLC 細胞侵襲及遷移的影響，發(fā)現(xiàn)LINC01176 能夠抑制NSCLC 細胞的侵襲和遷移，即LINC01176 參與了NSCLC 細胞轉(zhuǎn)移的調(diào)控過程。目前，尚未有關于LINC01176 的文獻研究報道，其在細胞中的作用仍有待進一步研究。

惡性腫瘤轉(zhuǎn)移是一個非常復雜的多步驟過程，包括腫瘤細胞從細胞外基質(zhì)分離、突破相關屏障進入血液、在血液中存活、突破相關屏障定植于遠處組織、在轉(zhuǎn)移部位生長等［11］。在NSCLC 中，腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移與EMT 密切相關［12］。在胚胎發(fā)育、炎癥反應、組織重建等正常生理過程中，通過EMT 的作用，黏附細胞之間的連接開始消失，細胞獲得運動能力，然后遷移到新的部位發(fā)揮生物學功能［13］。在腫瘤組織中，為了侵襲臨近組織、擴散到遠處組織并形成轉(zhuǎn)移灶，腫瘤上皮細胞必須轉(zhuǎn)變成間質(zhì)表型。EMT 在這一轉(zhuǎn)變過程中起到至關重要的作用，使得腫瘤上皮細胞失去了細胞極性、與基底膜的連接等上皮表型，同時獲得了抗凋亡、可降解細胞外基質(zhì)等間質(zhì)表型，從而導致細胞具有較高的遷移性和侵襲性［14］。在細胞發(fā)生EMT 的生物學過程中，細胞黏附分子（如E-cadherin）表達減少，細胞角蛋白細胞骨架轉(zhuǎn)化為Vimentin 為主的細胞骨架［15］。E-cadherin 是跨膜糖蛋白，參與維持上皮細胞間的連接和組織［16］。Vimentin 是中間絲蛋白，在細胞遷移、維持細胞結構和細胞運動中發(fā)揮重要作用［17］。本研究結果顯示，轉(zhuǎn)染敲低LINC01176 可抑制間質(zhì)細胞標志物Vimentin 的表達、促進上皮細胞標志物E-cadherin的表達。這提示轉(zhuǎn)染敲低LINC01176 可抑制EMT過程、降低腫瘤細胞遠處轉(zhuǎn)移的風險，LINC01176可通過調(diào)控EMT過程促進腫瘤細胞轉(zhuǎn)移。

綜上所述，LINC01176在NSCLC細胞中高表達，可促進NSCLC 細胞的侵襲和遷移，其作用可能是通過參與調(diào)控EMT 實現(xiàn)的。在未來的研究中，我們將進一步探究LINC01176 調(diào)控EMT 的具體分子機制，以及LINC01176在NSCLC轉(zhuǎn)移中的臨床應用。