吳潔，張黎黎，李艷紅，張嫻，寸麗蘋

(昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，云南 昆明 650101)

0 引言

膽堿是人體必需營養(yǎng)素之一，其主要生理功能包括：神經(jīng)傳導(dǎo)、生物膜的信號傳遞、脂肪轉(zhuǎn)運(yùn)和一碳代謝[1]。盡管膽堿較為廣泛的存在于日常膳食中，但由于膳食不均衡、膽堿代謝關(guān)鍵酶基因多態(tài)性差異、孕期和哺乳期需求量相對增加等原因，導(dǎo)致大部分孕婦的膳食膽堿攝入量未達(dá)到適宜攝入量[2]。孕期膽堿攝入不足不但影響孕婦自身健康，而且干擾胎兒代謝穩(wěn)態(tài)，影響子代健康。有研究提示膽堿補(bǔ)充可以拮抗肥胖小鼠的胰島素抵抗發(fā)生，孕期補(bǔ)充膽堿可拮抗能影響妊娠期糖尿病所導(dǎo)致的子代脂代謝紊亂，提示孕期膽堿水平可能影響子代的糖脂代謝穩(wěn)態(tài)?，F(xiàn)實狀況中膽堿缺乏較為常見，本研究擬構(gòu)建孕期膽堿攝入不足的跨代動物模型，探討孕期膽堿攝入不足對子代糖脂代謝的影響。

1 材料

1.1 實驗動物

選用7周齡C57BL/6小鼠，動物登記為SPF級，雌性20只，雄性10只，由上海市計劃生育科學(xué)研究所實驗動物經(jīng)營部購進(jìn)，實驗動物許可證: SCXK(滬)2018-0006，墊料、飼料由上海市計劃生育科學(xué)研究所實驗動物經(jīng)營部提供。實驗場所由上海市實驗動物研究中心提供。動物飼養(yǎng)條件：溫度24°C-26°C，空氣濕度40%-70%，12h光照/黑暗循環(huán)，標(biāo)準(zhǔn)小鼠箱飼養(yǎng)，實驗過程中小鼠均自由攝食飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始造模。

1.2 主要試劑

實驗動物的膽堿缺乏飼料購自美國Research Diets公司。小鼠血清胰島素采用酶聯(lián)免疫吸附試劑盒為美國Bio TSZ Trust Specialty Zeal 公司的小鼠胰島素ELISA試劑盒。

2 孕期不同膽堿攝入的實驗動物模型構(gòu)建方法

2.1 母鼠膽堿營養(yǎng)狀態(tài)及分組

7周齡C57BL/6J小鼠正常飲食喂養(yǎng)適應(yīng)1周后，按照雌雄比2:1的比例合籠，合籠后以觀察到雌鼠陰栓確認(rèn)懷孕。確認(rèn)懷孕后孕鼠單籠飼養(yǎng)并隨機(jī)分組，給予不同膽堿含量的飼料喂養(yǎng)。由于市場尚無不同膽堿含量的動物飼料，僅有無膽堿飼料，因此采用無膽堿飼料添加不同含量的氯化膽堿以導(dǎo)致不同程度的膽堿攝入不足。根據(jù)既往研究報道，小鼠標(biāo)準(zhǔn)飼料的膽堿含量是1.4g氯化膽堿/kg飼料。將孕鼠隨機(jī)分為組：A組：給予標(biāo)準(zhǔn)膽堿飲食(無膽堿飼料+1.4g氯化膽堿/kg飼料)，B組：給予1/2標(biāo)準(zhǔn)膽堿飲食(無膽堿飼料+0.7g氯化膽堿/kg飼料)，C組：給予1/4標(biāo)準(zhǔn)膽堿飲食(無膽堿飼料+0.35g氯化膽堿/kg飼料)，D組：給予無膽堿飲食(無膽堿飼料，不添加氯化膽堿)。所有小鼠均自由攝食、攝水。每周稱量并母鼠妊娠期每周測量一次體重及攝食量(攝食量=總飼料量-剩余飼料量-撒料)。

表2 不同膽堿攝入組孕鼠所生小鼠的糖脂代謝指標(biāo)(±s)

表2 不同膽堿攝入組孕鼠所生小鼠的糖脂代謝指標(biāo)(±s)

指標(biāo)組別 血糖(mmol/L) 胰島素(μU/mL) 總膽固醇(μg/μL) 甘油三酯(mmol/L) HOMO-IR A組 3.29±1.25 0.89±0.18 1.56±0.34 1.29±0.17 0.12±0.02 B組 3.76±0.98 1.09±0.24 1.90±0.44 1.67±0.81 0.23±0.06 C組 3.03±1.07 1.32±0.43 1.77±0.90 1.29±0.17 0.23±0.09 D組 2.98±1.25 1.06±0.09 1.86±0.34 1.94±0.36 0.16±0.03 P值 0.671 0.344 0.787 0.940 0.598

2.2 子代糖脂代謝異常的模型構(gòu)建

新生子鼠出生后，麻醉后處死，從眼眶靜脈叢采血，立即4000r/min，常溫離心5min后取血清，置于-80℃冰箱保存進(jìn)行血清胰島素、血糖、甘油三酯、總膽固醇的測定。

2.3 糖脂代謝指標(biāo)的測定和評估

小鼠血清胰島素采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)方法測定，試劑盒為美國Bio TSZ Trust Specialty Zeal 公司的小鼠胰島素ELISA試劑盒，操作方法嚴(yán)格按照試劑盒操作說明書進(jìn)行。血糖、甘油三酯、總膽固醇采用美國貝克曼AU5800(BECKMAN COULTER AU5800)全自動生化分析儀測定。采用穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗指數(shù)(Homeostasis model assessment - insulin resistance, HOMA-IR)來評估新生子鼠的胰島素敏感性，HOMA-IR=空腹胰島素(uU/mL)×空腹血糖(mmol/L)/ 22.5[3]。

2.4 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)錄入采用Excel軟件錄入，再導(dǎo)入SPSS 23.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料且服從正態(tài)分布的用±s描述，不同膽堿營養(yǎng)水平組別的指標(biāo)比較使用單因素方差分析(One Way ANOVA)，多組均數(shù)兩兩比較采用LSD法。以α=0.05為檢驗顯著性標(biāo)準(zhǔn)。

3 結(jié)果

3.1 母鼠孕期體重增長和攝食情況

四組不同膽堿營養(yǎng)飼養(yǎng)組母鼠孕期體重增長有明顯統(tǒng)計學(xué)差異，D組孕鼠的孕期增重明顯低于A組小鼠，平均每天攝食量亦差異無統(tǒng)計學(xué)意義(表1)。

表1 不同膽堿攝入組別母鼠孕期增重和攝食量比較(±s)

表1 不同膽堿攝入組別母鼠孕期增重和攝食量比較(±s)

注：a孕期增重=分娩當(dāng)日體重-確認(rèn)懷孕時體重，4組小鼠孕期增重比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，兩兩比較結(jié)果顯示A組和D組的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.01)。b平均攝食量=(總飼料量-剩余飼料量-撒料)/懷孕天數(shù)，4組小鼠孕期平均攝食量比較P=0.34。

指標(biāo)組別 A組 B組 C組 D組a孕期增重(g) 5.40±0.79 5.77±0.98 4.92±0.65 4.63±0.5 b平均攝食量(g/d) 8.23±0.82 7.78±0.64 8.06±0.98 7.98±0.83

3.2 孕期膽堿攝入不足對新生小鼠出生體重的影響

采用比較4組新生小鼠的出生體重，結(jié)果顯示(見圖1)：單因素方差分析結(jié)果顯示不同組別新生小鼠的出生體重存在差異(F=3.467，P=0.019)，兩兩比較結(jié)果顯示孕期無膽堿飲食組(D組)所生的小鼠出生體重(1.47±0.33)g明顯低于標(biāo)準(zhǔn)膽堿飲食組(A組)(1.89±0.47)g(P=0.023)。

圖1 不同孕期膽堿營養(yǎng)組新生子鼠出生體重比較

3.3 孕期膽堿攝入不足對新生小鼠糖脂代謝生化指標(biāo)的影響

比較不同膽堿攝入組別孕期所生小鼠的糖脂代謝指標(biāo)，結(jié)果顯示新生新生小鼠的血糖、胰島素、總膽固醇、甘油三酯、HOMO-IR差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

4 討論

最近美國的一項膳食調(diào)查發(fā)現(xiàn)僅有10%的普通人群和8%的孕婦滿足他們相應(yīng)性別和生理階段所需的膽堿適宜攝入量[4]，英國的一項孕婦的膳食調(diào)查結(jié)果顯示僅有18%的孕婦膳食膽堿攝入達(dá)到適宜攝入量[5]。均提示孕婦人群中膽堿攝入不足并不少見，但孕期膽堿攝入不足對胎兒的影響知之甚少。

本研究構(gòu)建了孕期小鼠膽堿攝入不足和缺乏的跨代動物模型，探討孕期膽堿攝入對子代健康的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：孕期膽堿攝入缺乏孕鼠所生新生子鼠的出生體重明顯降低，提示孕期膽堿攝入缺乏可能會影響胎兒體重。該結(jié)果與西班牙的一項人群研究結(jié)果類似，該研究發(fā)現(xiàn)低出生體重兒的臍血膽堿水平較低[6]。膽堿在膽堿脫氫酶的作用下，通過氧化反應(yīng)形成甜菜堿，在同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下，提供一個甲基形成體內(nèi)通用的甲基供體——S-腺苷甲硫氨酸(Sadenosylmethionine，SAM)，廣泛參與后續(xù)的DNA、蛋白質(zhì)等甲基化過程。基于膽堿的此種代謝機(jī)制，推測孕期膽堿攝入不足可通過影響子代的甲基化修飾，導(dǎo)致表觀遺傳遺傳改變，從而影響胎兒的宮內(nèi)生長發(fā)育[7]。其中的機(jī)制可能與孕期膽堿營養(yǎng)可影響胎盤功能有關(guān)。有研究提示對胎盤功能受損的小鼠模型的雌鼠交配前5天開始補(bǔ)充不同劑量(1、2、4倍)的膽堿，結(jié)果發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充4倍膽堿劑量可以增加妊娠早期和中期的胎鼠和胎盤重量[8]。提示孕期膽堿營養(yǎng)可能通過影響胎盤功能，從而影響子代宮內(nèi)生長發(fā)育。

本研究構(gòu)建了孕期小鼠膽堿攝入不足和缺乏影響子代健康的跨代動物模型，可為下一步從表觀遺傳學(xué)機(jī)制探討孕期膽堿對胎兒生長發(fā)育的影響機(jī)制研究構(gòu)建基礎(chǔ)。由于膽堿在脂肪酸的分解代謝、脂肪細(xì)胞的合成、肝臟的脂肪轉(zhuǎn)運(yùn)過程中有著至關(guān)重要的作用[9]。因此，母親孕期膽堿狀態(tài)可能影響血脂水平，影響胎盤供給胎兒的血脂狀態(tài)，從而影響胎兒的脂代謝[10,11]。同時有動物實驗提示膽堿、甜菜堿與胰島素抵抗存在相關(guān)性[12-14]?；谝陨咸崾荆狙芯繖z測了新生小鼠的糖脂代謝指標(biāo)和胰島素抵抗指標(biāo)，但未能發(fā)現(xiàn)孕期膽堿攝入不足或缺乏對新生小鼠血糖、胰島素、甘油三酯、總膽固醇和HOMO-IR有顯著影響。與上述研究存在不一致性，原因可能是體內(nèi)糖脂代謝、胰島素抵抗的代謝過程、以及胎兒宮內(nèi)生長發(fā)育過程非常復(fù)雜，特別是膽堿是重要的一碳代謝供體，參與了DNA甲基化修飾這一重要的表觀遺傳機(jī)制。表觀遺傳的對代謝的調(diào)控影響可能不會在子代出生時立刻顯現(xiàn)出來，可能會給子代打上遺傳印記，當(dāng)出生后環(huán)境變化時出現(xiàn)相應(yīng)的表型改變。研究者發(fā)現(xiàn)在高脂飲食誘導(dǎo)的孕期糖尿病大鼠模型中發(fā)現(xiàn)：給孕鼠補(bǔ)充膽堿可以預(yù)防孕中期胎兒體重的過度增長，其作用機(jī)理在于孕期膽堿補(bǔ)充可抑制胎盤mTOR信號通路，該信號通路可促進(jìn)胎盤葡萄糖和脂肪的轉(zhuǎn)運(yùn)[15]。在高脂飲食誘導(dǎo)的大鼠模型中發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充甲基化供體飲食可減輕脂肪肝，修飾脂肪酸合成相關(guān)基因的甲基化水平，從而影響脂肪酸的合成[16]。有研究者在高脂飲食喂養(yǎng)導(dǎo)致肥胖的大鼠模型中發(fā)現(xiàn)，孕期補(bǔ)充膽堿顯著降低胎鼠肝臟脂肪酸合成相關(guān)基因Acc1, Fads, Elovl5, Srebp1c的microRNA富集，下調(diào)子鼠的肝臟脂肪酸合成[17]。

綜上，本研究成功構(gòu)建了孕期膽堿缺乏影響子代糖脂代謝穩(wěn)態(tài)的跨代動物模型，發(fā)現(xiàn)孕期膽堿缺乏小鼠孕期增重和新生子鼠的出生體重明顯降低，提示孕期膽堿營養(yǎng)缺乏可影響胎鼠宮內(nèi)生長發(fā)育。但未發(fā)現(xiàn)孕期膽堿營養(yǎng)缺乏對子代糖脂代謝生化指標(biāo)有顯著影響，下一步可以從表觀遺傳調(diào)控機(jī)制深入研究孕期膽堿營養(yǎng)不足對子代糖脂代謝穩(wěn)態(tài)及健康的影響，