田佳佳，李鵬，陳華永

(濰坊市益都中心醫(yī)院，山東 濰坊 262500)

0 引言

糖尿病痛性神經(jīng)病變(Diabetic Peripheral Neuropathy Pain，DPNP)是一種常見的糖尿病周圍神經(jīng)病變并發(fā)癥，在臨床上以痛覺過敏和自發(fā)痛為主要的表現(xiàn)，會嚴重影響患者的生活質(zhì)量。近幾年的研究認為，DPNP的發(fā)生是多種細胞因子、蛋白質(zhì)和信號傳導(dǎo)通路共同作用的結(jié)果。但是，目前在臨床上針對DPNP沒有有效的治療手段，非甾體類抗炎止痛藥物和阿片類麻醉藥物只能暫時的緩解癥狀，并且會帶來大量的副作用[1]。iTRAQ技術(shù)一種能夠?qū)Χ嘟M樣本同時進行分析的蛋白組學(xué)技術(shù)，結(jié)合液相色譜和串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)已經(jīng)成為蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究的主要工具，廣泛的用于各種生物學(xué)標志物的尋找。本實驗旨在利用iTRAQ技術(shù)篩選糖尿病痛性神經(jīng)病變患者血清中發(fā)生差異表達的蛋白質(zhì)，聯(lián)合生物信息學(xué)分析差異表達的蛋白質(zhì)，從而為進一步研究糖尿病痛性神經(jīng)病變的發(fā)病機制提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜儀、Nano-Tempo LC點靶儀、iMark型酶標儀、Agilent 1200 series液相色譜儀；iTRAQBuffer試劑盒、胰酶、Multiple Affinity Removal System (MARS) Human 14親和層析柱。

1.2 樣本采集及分組

選取2020年3到至2021年3月在濰坊市益都中心醫(yī)院內(nèi)分泌科住院的100例2型糖尿病患者。按照2013年中華醫(yī)學(xué)會糖尿病學(xué)分會制定的T2DM診斷標準和2009年美國糖尿病學(xué)會共識聲明中的DPN診斷標準，將2型糖尿病患者分為2組，A組：單純糖尿病組，50例；B組：糖尿病痛性神經(jīng)病變組，50例。

診斷標準：(1)2013年中華醫(yī)學(xué)會糖尿病學(xué)分會制定的T2DM、DPNP；(2)2009年美國糖尿病學(xué)會共識聲明中有關(guān)DPNP的診斷標準。

排除標準：患有糖尿病腎病、糖尿病視網(wǎng)膜病變等微血管病變；患有嚴重高血壓和心腦血管疾?。桓腥拘约膊?；惡性腫瘤；自身免疫性疾??；正在接受抗生素治療的患者；吸煙，飲酒有精神類藥物的濫用病史的患者；妊娠和哺乳期患者；其他原因引起周圍神經(jīng)痛的患者。

血液采集經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會批準并征得患者本人或者家屬的同意，每日清晨空腹抽取靜脈血5mL于促凝管內(nèi)，分別記為糖尿病組和糖尿病痛性神經(jīng)病變組，在室溫中放置30min，使用4℃恒溫離心機3000r/min離心20min，分離上層血清，放置于-80℃冰箱保存。

1.3 高豐度蛋白的去除

把-80℃冰箱保存的血清在冰上復(fù)溶，各組的50例樣本分別取5μL進行等體積的混合，然后應(yīng)用MARS HUMAN-14免疫親和色譜柱去掉在血清中高表達的白蛋白、IgG、轉(zhuǎn)鐵蛋白等14種蛋白。剩下的低豐度蛋白使用離心濃縮器濃縮，并測定蛋白的濃度。

1.4 使用胰酶酶解和進行標記

每一組樣本取100μg蛋白，進行變性、還原、半胱氨酸修飾和胰酶酶解等前期處理，然后使用iTRAQ試劑對糖尿病組和糖尿病痛性神經(jīng)病變組分別進行標記。

1.5 質(zhì)譜分析

完成標記的酶解多肽混合物首先進行脫鹽，再使用液相色譜儀進行色譜分離，分離完成后使用第二維反相色譜分離并點靶。點靶完成后使用質(zhì)譜儀進行質(zhì)譜分析。

1.6 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析使用ProteinPilot軟件，在人類IPI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中進行搜索。選擇可信度區(qū)間≧95%或者Protscore≧1.3的蛋白進行認定，把113為對照組，比值≧1.5或者≦0.67作為閾值篩選差異蛋白。使用DAVID對鑒定得到的差異蛋白質(zhì)進行功能注釋，其中選擇GO(gene ontology)的生物過程、細胞成分和分子功能注釋對蛋白進行分類，在KEEG的通路數(shù)據(jù)庫中對差異表達的蛋白質(zhì)進行分類和通路富集分析。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)譜鑒定結(jié)果

數(shù)據(jù)利用Protein Pilot軟件搜索得到可信度大于95%的蛋白170種，差異表達的蛋白23種，較糖尿病組表達上調(diào)的蛋白有16種，下調(diào)的蛋白質(zhì)7種，見表1。

表1 兩組比較，上調(diào)或者下調(diào)差異1.5倍以上的蛋白質(zhì)

2.2 生物學(xué)功能分析

對糖尿病痛性神經(jīng)病變患者發(fā)生差異表達的23種蛋白質(zhì)進行基因功能聚類分析以及通路的分類和富集分析后發(fā)現(xiàn)這23種蛋白主要參與了炎癥級聯(lián)反應(yīng)、激活補體系統(tǒng)、細胞凋亡過程、蛋白酶類的水解等生物學(xué)過程；細胞組分主要包括細胞膜結(jié)合蛋白、核蛋白復(fù)合體、免疫攻擊復(fù)合物等；分子功能主要為結(jié)合催化功能；富集到的信號通路主要是多種細胞因子介導(dǎo)的炎癥信號通路、凝血級聯(lián)反應(yīng)等。

3 討論

隨著對糖尿病痛性神經(jīng)病變研究的進一步深入，發(fā)現(xiàn)不論是神經(jīng)的異常放電、神經(jīng)生長因子的改變或者是神經(jīng)的中樞敏化等作用大都能夠轉(zhuǎn)歸到各種細胞因子引起的炎癥反應(yīng)上，了解這些細胞因子的信號通路和作用對象對更加深入的了解和闡釋糖尿病痛性神經(jīng)病變的發(fā)生機制具有重要的意義。本研究利用itraq技術(shù)對糖尿病和糖尿病痛性神經(jīng)病變患者的血清進行了分析，發(fā)現(xiàn)了23種差異蛋白。

在本實驗的結(jié)果中，糖尿病痛性神經(jīng)病變組發(fā)生上調(diào)的蛋白中有3個為炎癥反應(yīng)蛋白，分別為α1-抗胰蛋白酶、血清淀粉樣蛋白A(SAA)、C反應(yīng)蛋白(CRP)。α1-抗胰蛋白酶主要在肝臟，是一種重要的血清蛋白溶解酶抑制物。Graterol[2]等α1-抗胰蛋白酶能夠通過細胞內(nèi)途徑活化核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)，而κB(NF-κB)是一種在人體組織細胞中廣泛存在，在過度炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。C-反應(yīng)蛋白和SAA是敏感的炎癥指標。

S100 A8是低分子量鈣結(jié)合蛋白，在抑制細胞增殖、導(dǎo)致細胞凋亡和急性炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要的作用。該蛋白能夠激活單核巨噬細胞的釋放，在炎癥過程中改變細微的結(jié)構(gòu)骨架，使白細胞的變形能力增加，匯聚到微血管處，使炎癥反應(yīng)級聯(lián)擴大而而加重組織的損傷。微血管病變是糖尿病痛性神經(jīng)病變的病理生理學(xué)基礎(chǔ)。近年來，炎癥因子與糖尿病并發(fā)癥之間的關(guān)系也逐漸被認識[3,4]。一項關(guān)于糖尿病周圍神經(jīng)病變的研究表明，隨著糖尿病周圍神經(jīng)病變程度的加重，S100A8/A9的濃度逐漸增加，提示S100A8/A9可能參與DR患者的血管炎癥反應(yīng)，其濃度的變化對糖尿病痛性神經(jīng)病變的嚴重程度有預(yù)測作用[5]。Tabur S等研究發(fā)現(xiàn)糖尿病合并周圍神經(jīng)病變患者體內(nèi)S100A8/A9水平明顯高于正常人及糖尿病未合并神經(jīng)病變組，且S100A8/A9水平與C反應(yīng)蛋白、糖化血紅蛋白呈正相關(guān)[6]。

凝血栓蛋白-1(thrombospondin-1，簡稱TSP-1)，是一種細胞外糖蛋白。TSP-1與TGF-β具有非常高的親和性，具有重要的抗炎癥作[7]。Kong P等研究發(fā)現(xiàn),在糖尿病微血管病變患者血清中TSP-1水平會有明顯的升高，并且與hs C-RP呈正相關(guān)，與MA-IR、HOMA-β水平呈負相關(guān)，前者是炎性反應(yīng)的非特異性敏感指標，后兩者則是糖尿病微血管病變的保護因素[8]。

本研究利用iTRAQ技術(shù)構(gòu)建了糖尿病患者和糖尿病痛性神經(jīng)病變患者血清的差異表達蛋白圖譜，為進一步的了解糖尿病痛性神經(jīng)病變的發(fā)病機制，并進行早期的干預(yù)和治療提供了重要的理論和實驗依據(jù)。但本實驗僅為初步研究，樣本量相對較少，所篩選出的一系列差異蛋白尚需擴大樣本量進一步驗證。