黃世金，張 穎，韓 超，劉成業(yè)，秦崇臻，盧瑤瑤，柴玉娜*

［1.鄭州大學第一附屬醫(yī)院，河南鄭州 450052；2.河南省洛陽正骨醫(yī)院（河南省骨科醫(yī)院）髖部疾病研究治療中心，河南洛陽 471002；3.河南科技大學第三附屬醫(yī)院洛陽東方醫(yī)院骨科，河南洛陽 471003；4.鄭州大學醫(yī)學科學院，河南鄭州 450052］

創(chuàng)傷性股骨頭壞死（trauma-induced osteonecro?sis of the femoral head,TIONFH）一般由股骨頭頸骨折、髖臼骨折、髖關節(jié)脫位等引起。目前認為其主要的影響因素為患者年齡、骨折分型和復位質量。該病預后較差，若無早期干預，則可能導致股骨頭結構發(fā)生改變及塌陷，導致髖關節(jié)疼痛及功能障礙［1］。

成骨細胞和破骨細胞的平衡對于骨形成和骨重構具有關鍵作用［2，3］。最新研究發(fā)現一些非編碼RNA及靶向分子對成骨細胞和破骨細胞的生物學功能具有重要的調控作用［4～6］。血液成分是骨細胞生長的重要物質基礎，探索TIONFH外周血中特異性微小RNA（miRNA）靶向的蛋白分子，可能為TIONFH的發(fā)病機制提供新的證據。

本研究聯合miRNA芯片和蛋白質組學技術對TIONFH患者外周血樣本中的差異分子進行鑒定，以期篩選出特異性miRNAs調控的差異化蛋白分子，為TIONFH的表觀遺傳機制提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 納入與排除標準

納入標準：（1）年齡在20～55歲之間；（2） 股骨頸骨折經皮空心螺釘內固定術治療>2年，出現股骨頭壞死；（3）符合《成人股骨頭壞死診療標準專家共識（2012年）》。

排除標準：（1）合并全身性疾病或者關節(jié)疾病的患者；（2）隨訪時間<2年。

1.2 一般資料與標本采集

按照以上納入和排除標準篩選股骨頭壞死患者10人（疾病組），另外選取10例股骨頸骨折非壞死患者（對照組）。本研究已獲得醫(yī)院倫理委員會批準，所有入組患者均簽署知情同意書［4，7］。

受試者于空腹狀態(tài)下抽取肘部靜脈血2管，離心取血漿，立即于-80℃保存，分別用于miRNA芯片和蛋白組學的檢測。

1.3 特異性miRNAs靶基因預測

前期通過芯片技術篩選并驗證出TIONFH血漿中8個顯著差異的 miRNAs［7］，5個上調的 miRNAs為hsa-miR-93-5p、hsa-miR-7i-5p、hsa-miR-16-2-3p、hsa-miR-320a、hsa-miR-25-3p；3 個下調的miRNAs 為 hsa-miR-122-5p、hsa-miR-4711-3p、hsa-miR-3191-5p。通過miranda microscom以及tar?getscan三個數據庫預測靶基因，通過維恩分析取三個數據庫檢索結果的交集。

1.4 蛋白組學分析

蛋白提取和酶解：各樣品分別加入裂解液，4℃，2 000 g離心10 min，取上清加入三氯乙酸，靜置后4℃，12 000 g離心3 min，用丙酮洗滌后，沉淀用8 M尿素復溶，最后用BCA蛋白試劑盒進行定量。加入胰酶，37℃酶解過夜。胰酶酶解的肽段用Strata X C18除鹽后真空冷凍干燥。以0.5 M TEAB溶解肽段，根據TMT試劑盒操作說明標記肽段。

液相色譜-質譜聯用分析：肽段用高pH反向HPLC分級。隨后肽段合并為18個組分，合并后的組分經真空冷凍干燥。肽段用液相色譜流動相A相溶解后使用EASY-nLC 1000超高效液相系統(tǒng)進行分離。肽段經由超高效液相系統(tǒng)分離后被注入NSI離子源中進行電離然后進質譜進行分析。二級質譜數據使用Maxquant（v1.5.2.8）進行檢索。

數據通過R（version 3.6.2）中l(wèi)imma包計算，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

1.5 生物信息學分析

聚類分析：使用分層聚類方法做單邊聚類分析，聚類關系使用R語言包gplots中的函數heatmap.2繪制出熱圖。KEGG通路（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes Pathway）富集：使用KEGG在線服務工具KAAS對提交的蛋白進行注釋，之后通過KEGG mapper將注釋過的蛋白匹配入數據庫中相應的通路中。通路的富集分析采用KEGG數據庫進行，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

1.6 關聯分析

根據miRNA反向調控靶基因的規(guī)律，將TION?FH中上調miRNAs的靶基因與蛋白組學中下調的蛋白進行關聯，將下調miRNAs的靶基因與蛋白組學中上調的蛋白進行關聯，然后取交集。

2 結 果

2.1 特異性miRNAs的靶基因及KEGG通路

對TIONFH中8個特異性miRNAs進行靶基因預測，結果顯示上調miRNAs有609個靶基因，如圖1a；下調miRNAs有37個靶基因，如圖1b。經過KEGG信號通路富集分析，依據-log10（P value）將富集最顯著的前10條信號通路分別展示，如圖1c和1d。結果顯示，這些靶基因在MAPK、PI3K-Akt等重要的信號通路上顯著富集。

圖1 TIONFH血漿特異性miRNAs的靶基因及富集的信號通路 1a:上調miRNAs的靶基因 1b:下調miRNAs的靶基因 1c:上調信號通路 1d:下調信號通路

2.2 蛋白組結果及KEGG通路

在這項研究中共鑒定到905個蛋白，其中652個包含定量信息。如果以P<0.05為標準，檢測到差異化表達蛋白115個，其中上調蛋白23個，下調蛋白92個，如圖2a。將115個蛋白進行KEGG信號通路富集，發(fā)現上調蛋白富集在補體系統(tǒng)等3條信號通路，如圖2b；下調蛋白富集在蛋白酶體等11條信號通路，如圖2c。

圖2 TIONFH血漿蛋白組學分析 2a:115個差異表達的蛋白的聚類圖（紅色代表富集程度強，藍色代表富集程度弱）2b:上調信號通路 2c:下調信號通路（Disease：疾病組；Normal：對照組）

2.3 關聯分析

將上調的miRNA的靶基因與下調的蛋白數據關聯，將下調的miRNA的靶基因與上調的蛋白數據關聯，得到22個共性蛋白分子，其中電壓依賴性陰離子選擇性通道1（voltage-dependent anion-selective channel protein 1,VDAC1）、26S蛋白酶體非ATP酶調控亞基 （26S proteasome non-ATPase regulatory sub?unit 14,PSMD14）、膜棕櫚酰化蛋白（membrane-pal?mitoylated protein 1,MPP1）和磷酸核糖焦磷酸激酶（ribose-phosphate pyrophosphokinase 1,PRPS1） 4個蛋白分子有顯著差異。VDAC1受到miR-7i-5p、miR-16-2-3p、miR-320a和miR-93-5p共同靶向調控；PSMD14受到miR-16-2-3p和miR-25-3p共同靶向調控；PRPS1受到miR-7i-5p和miR-320a共同靶向調控；MPP1受到miR-25-3p靶向調控。4個蛋白分子與miRNAs的表達呈反向關系（符合miRNAs對靶向分子的調控規(guī)律），如表1。22個共性蛋白參與的信號通路有：破骨細胞分化通路、Wnt信號通路、PI3K-Akt信號通路、蛋白質水解泛素化通路等，如表2。

表1 特異性miRNAs靶基因和差異蛋白的關聯分析

表2 共性蛋白分子及參與的信號通路

3 討論

研究證明，miRNAs在骨形成和骨重構中有重要作用，它們通過對成骨細胞和破骨細胞關鍵轉錄因子的調控發(fā)揮表觀遺傳調控功能［4～6］，但是在TION?FH中的研究尚不充分。本研究結合前期基于miR?NAs芯片技術的研究成果，關聯蛋白組學的數據，篩選出特異性8個miRNAs調控的蛋白分子VDAC1、PSMD14、PRPS1和MPP1等，并梳理出相關的重要信號通路，分析結果初步揭示了這些特異性分子在TIONFH中可能的作用。

VDAC1是一種β桶蛋白，在人類中由位于5號染色體上的VDAC1基因編碼。在真核細胞中，線粒體負責ATP合成細胞存活所需的其他代謝物，而VDAC1在線粒體外膜和細胞膜中形成離子通道，允許線粒體和細胞之間的通信，從而介導細胞代謝和細胞死亡之間的平衡。高表達VDAC1可使線粒體自噬水平增強，導致NLRP3炎癥體的活化被抑制，保護細胞生物學功能不受損害［8］。結合本研究結果VDAC1在TIONFH中血漿的含量顯著降低，可以初步推測VDAC1可能在TIOFNH中起保護作用。VDAC1能夠通過增加鈣離子水平導致線粒體膜電位破壞，從而誘導細胞凋亡［9］。雖然有報道TIONFH的早期發(fā)病過程與骨細胞凋亡有關［10］，但VDAC1是否參與了TIONFH的細胞凋亡尚需進一步研究證明。關聯分析顯示，VDAC1是多個miRNAs的靶基因，進一步提示VDAC1在TIONFH中可能與多種非編碼RNA的轉錄調控相關。

PSMD14是一種金屬蛋白酶，屬于26S蛋白酶體的重要組分。蛋白酶體參與許多細胞過程，包括細胞周期進程、細胞凋亡或DNA損傷修復。PSMD14亞基可以調節(jié)特定蛋白質的去泛素化從而來影響其穩(wěn)定性，進而影響細胞的功能狀態(tài)［11］。已有報道PSMD14與腫瘤免疫相關［12］。本研究顯示該蛋白在TIONFH中含量降低，同時受到hsa-miR-16-2-3p和hsa-miR-25-3p的調控，具體機制有待進一步探明。

PRPS1是核酸合成的重要限速酶，對嘌呤、嘧啶相關的合成、代謝有重要作用，同時能夠影響細胞能量代謝。PRPS1基因突變可引起腫瘤對代謝類化療藥物的耐藥以及多種臨床綜合征［13］，如聽力損失、視網膜營養(yǎng)不良等。近些年逐漸有miRNA調控PRPS1基因轉錄在疾病中的相關報道［14，15］，進一步揭示了PRPS1的相關作用機制。本研究分析顯示hsamiR-7i-5p和hsa-miR-320a對PRPS1有調控作用，初步揭示了PRPS1在TIONFH中的轉錄調控作用。

MPP1是中性粒細胞的調節(jié)器，通過調節(jié)AKT1的磷酸化來調控中性粒細胞極性從而發(fā)揮生物學功能［16］。本研究分析表明：MPP1是hsa-miR-25-3p的靶基因，并且在TIONFH血漿中含量降低。但是該分子的相關報道較少，還需要進一步的探索。

特異性miRNA靶基因和差異蛋白關聯分析顯示，差異的miRNA調控的蛋白分子參與多條重要信號通路，如破骨細胞分化通路、Wnt信號通路、PI3K-AKT信號通路、MAPK信號通路、鈣信號通路等。已知Wnt信號能夠調控成骨細胞分化［17］，并且在破骨細胞形成中的作用也逐漸被揭示［18］；而PI3K-AKT信號通路、MAPK信號通路等亦為股骨頭壞死機制研究中的重要通路，已經成為治療或者干預非創(chuàng)傷性股骨頭壞死的切入點［19，20］。這些結果提示，上述信號通路有可能在TIONFH中也有重要作用，值得進一步挖掘驗證。

本研究結果顯示，特異性miRNAs調控的VDAC1、PSMD14、MPP1、PRPS1等蛋白分子可能參與了TIONFH的發(fā)病過程，為TIONFH的表觀遺傳機制提供了新的信息。但是它們參與TIONFH的具體作用機制還需進一步證明。