黃志偉，劉濤，陳曉波，耿潔，李光，王玉亮△

T細(xì)胞共刺激分子OX40（CD134）及其同源配體OX40L（CD134L、CD252）作為治療T 細(xì)胞所介導(dǎo)疾病的重要靶點(diǎn)被廣泛研究。OX40、OX40L分別屬于腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）受體及TNF 超家族的成員，OX40 在活化的 CD4+T 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞中均有表達(dá)，OX40L主要表達(dá)于活化的抗原提呈細(xì)胞（APC）、活化的T/B 細(xì)胞及巨噬細(xì)胞等。T 細(xì)胞與APC 間以及T 細(xì)胞相互間均可通過OX40 和OX40L 共刺激信號（第二信號）的傳導(dǎo)而增強(qiáng)T 細(xì)胞活化能力、CD4+記憶T 細(xì)胞增殖水平及濾泡輔助T 細(xì)胞（Tfh）的生成，進(jìn)而調(diào)節(jié)T 輔助細(xì)胞（Th）1 與Th2 的平衡，促進(jìn)干擾素（IFN）-γ、TNF-α、白細(xì)胞介素（IL）-2、IL-21等細(xì)胞因子的產(chǎn)生［1-2］。在器官移植和自身免疫性疾病中，阻斷OX40/OX40L共刺激信號可以抑制T細(xì)胞活化、延長移植物的存活時間并提高對自身抗原的免疫耐受［3］。脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（ADSCs）因可發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)、減輕全身炎癥反應(yīng)及損傷修復(fù)等功能而成為治療多種難治性疾病的有效方案［4］。此外，ADSCs作為基因治療載體也具有潛在的臨床應(yīng)用價值。本研究擬構(gòu)建OX40Ig基因修飾ADSCs（ADSCsOX40Ig），探討其對異基因反應(yīng)性淋巴細(xì)胞免疫抑制的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性SPF 級Lewis 大鼠5 只和BN 大鼠4 只，6～8 周齡，體質(zhì)量200～250 g，購自解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗動物中心。DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清（美國Gibco公司）；胰蛋白酶、成骨成脂及成胰島樣細(xì)胞誘導(dǎo)試劑、絲裂霉素C（美國Sigma 公司）；細(xì)胞標(biāo)記抗體、FACS Calibur 流式細(xì)胞儀（美國BD 公司）；MiniBEST 凝膠DNA 回收試劑盒（日本TaKaRa 公司）；TRIzol RNA 提取試劑盒、質(zhì)粒載體pcDNA3.1（+）、瓊脂糖（美國Invitrogen 公司）；EcoRⅠ、BamHⅠ、XhoⅠ限制性內(nèi)切酶、T4 DNA 連接酶（美國Thermo 公司）；AxyPrep質(zhì)粒小量提取試劑盒（美國Corning公司）；Amaxa轉(zhuǎn)染試劑盒（德國Amaxa 公司）；重組Anti-OX40 抗體（美國Abcam 公司）；ABI 7500實(shí)時熒光PCR擴(kuò)增儀（美國Applied Biosystems公司）；凝膠成像分析系統(tǒng)（美國Alpha Innotech公司）。

1.2 大鼠OX40 胞外區(qū)編碼序列的獲得及合成 取雄性Lewis 大鼠1 只，異氟醚吸入麻醉后取腹主動脈新鮮血液2 mL，淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單個核細(xì)胞，按耿潔等［5］方法擴(kuò)增大鼠OX40 胞外區(qū)及人IgG Fc 段編碼序列。OX40片段用BamHⅠ-EcoRⅠ雙酶切，IgG Fc 片段用EcoRⅠ-XhoⅠ雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段。

1.3 pcDNA3.1（+）/OX40Ig融合基因表達(dá)載體的構(gòu)建 按耿潔等［5］pcDNA3.1（+）/IgG Fc 質(zhì)粒構(gòu)建方法構(gòu)建質(zhì)粒，取pcDNA3.1（+）/IgG Fc 與OX40 胞外區(qū)序列連接反應(yīng)產(chǎn)物，應(yīng)用熱休克法轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)大腸桿菌，堿裂解法小量提取質(zhì)粒。質(zhì)粒產(chǎn)物進(jìn)行BamHⅠ-EcoRⅠ雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳，若出現(xiàn)約600 bp 的目的條帶，則初步鑒定為正確的重組質(zhì)粒，命名為pcDNA3.1（+）/OX40Ig并測序鑒定。

1.4 大鼠ADSCs 分離培養(yǎng)及鑒定 1.2 中雄性Lewis 大鼠再取血后，無菌條件下取單側(cè)腹股溝脂肪組織，參照文獻(xiàn)［5］分離并提取ADSCs，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)及油紅O染色、茜素紅染色法對第3代ADSCs 表面標(biāo)志物（CD90、CD105、CD73、CD34及CD45）及ADSCs誘導(dǎo)多向分化潛能進(jìn)行鑒定。其中細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)＞95%為陽性，＜1%為陰性；成脂細(xì)胞誘導(dǎo)觀察細(xì)胞質(zhì)內(nèi)球形脂滴情況，成骨細(xì)胞誘導(dǎo)觀察深染鈣結(jié)節(jié)形成情況。

1.5 ADSCs轉(zhuǎn)染和OX40Ig蛋白表達(dá)水平檢測 ADSCs消化成單細(xì)胞懸液，參照文獻(xiàn)［5］采用核轉(zhuǎn)染技術(shù)將pcDNA3.1（+）/OX40Ig質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至ADSCs。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染ADSCs 后72 h，Western blot法檢測ADSCs中OX40Ig表達(dá)，分離的蛋白電泳轉(zhuǎn)移到聚二氟乙烯膜上，BSA封閉液封閉后加重組Anti-OX40抗體4 ℃孵育過夜，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶1 000）室溫下和聚二氟乙烯膜孵育1 h，用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)顯色陽性條帶。

1.6 混合淋巴細(xì)胞反應(yīng) 異氟醚吸入麻醉后，將4 只BN 大鼠和4 只Lewis 大鼠通過異氟醚吸入麻醉后取脾臟，通過尼龍濾網(wǎng)過濾法制備脾細(xì)胞懸液，再經(jīng)淋巴細(xì)胞分離液分離并經(jīng)尼龍毛柱法獲得淋巴細(xì)胞。取2×106/mL的BN大鼠淋巴細(xì)胞懸液并加入25 mg/L 絲裂霉素C，于37 ℃作用30 min，以1 500 r/min 離心 10 min，RPMI 1640 培養(yǎng)液洗滌后調(diào)整為 2×106/mL作為刺激細(xì)胞。將Lewis大鼠淋巴細(xì)胞1×105/孔（反應(yīng)細(xì)胞）與刺激細(xì)胞2×105/孔混合接種于96孔培養(yǎng)板中。每孔加入絲裂霉素C 處理過的ADSCs、ADSCsOX40Ig（2×104/孔），實(shí)驗分為對照組（反應(yīng)細(xì)胞+刺激細(xì)胞）、ADSCs 組（反應(yīng)細(xì)胞+刺激細(xì)胞+ADSCs）及ADSCsOX40Ig組（反應(yīng)細(xì)胞+刺激細(xì)胞+ADSCsOX40Ig）；每組設(shè)3個復(fù)孔，37 ℃、5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)4 d后采用MTT法測定淋巴細(xì)胞增殖的吸光度（A）值，并計算細(xì)胞增殖抑制率。增殖抑制率（%）=（1-A實(shí)驗組/A對照組）×100%。

1.7 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測淋巴細(xì)胞內(nèi)IFN-γ、IL-10及轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-βmRNA 表達(dá)水平 收集混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)培養(yǎng)72 h 后的淋巴細(xì)胞，采用TRIzol 法提取總RNA，取總RNA 5 μg反轉(zhuǎn)錄為cDNA，產(chǎn)物體積20 μL。IFN-γ引物：上游 5′-AGGCCATCAGCAACAACATAAGTG-3′，下游5′-GACAGCTTTGTGCTGGATCTGTG-3′；IL-10引物：上游5′-AAGGCCATGAATGAGTTTGACAT-3′，下游 5′-CGGGTGGTTCAATTTTTCATTT-3′；TGF-β引物：上游 5′-CAAGGGCTACCATGCCAACT-3′，下游5′-CCGGGTTGTGTTGGTTGTAGA-3′；內(nèi)參基因β-actin引物：上游5′-CGTTGACATCCGTAAAGACCTCC-3′，下 游 5′-TAGGAGCCAGGGCAGTAATCT-3′。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性15 min；95 ℃變性20 s，60 ℃退火和延伸 60 s，40 個循環(huán)。記錄Ct 值，以 2-ΔCt表示IFN-γ、IL-10、TGF-βmRNA的相對表達(dá)水平，其中ΔCt=Ct目的基因-Ctβ-actin。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，2 組間均數(shù)比較用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒的酶切鑒定EcoRⅠ-XhoⅠ雙酶切重組質(zhì)粒pcDNA3.1（+）/OX40Ig，電泳結(jié)果顯示目的基因條帶對應(yīng)1 000 bp；BamHⅠ-EcoRⅠ雙酶切重組質(zhì)粒pcDNA3.1（+）/OX40Ig，電泳結(jié)果顯示目的基因條帶對應(yīng)570 bp，見圖1。

2.2 重組質(zhì)粒的測序鑒定 重組質(zhì)粒測序鑒定與GenBank上公布的目標(biāo)序列完全一致，無插入、缺失和移碼突變，表明質(zhì)粒構(gòu)建正確，見圖2。

2.3 大鼠ADSCs 的體外培養(yǎng)和鑒定 ADSCs 傳代后細(xì)胞形態(tài)為長梭形并呈漩渦狀幾何倍數(shù)穩(wěn)定增長。ADSCs 表面分子 CD90、CD105 和 CD73 呈陽性表達(dá)，CD34、CD45呈陰性表達(dá)，見圖3。ADSCs在成脂及成骨細(xì)胞誘導(dǎo)液培育下分化為脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞，見圖4。

2.4 OX40Ig 蛋白在ADSCs 細(xì)胞中的表達(dá)情況 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染ADSCs細(xì)胞后，OX40Ig在ADSCs中呈高表達(dá)，見圖5。

2.5 ADSCsOX40Ig對異基因淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的影響 與ADSCs 組（46.7%±3.1%）比較，ADSCsOX40Ig組（60.5%±4.4%）異基因淋巴細(xì)胞增殖抑制率增強(qiáng)（n=4，t=5.085，P＜0.01）。

2.6 3 組IFN-γ、IL-10、TGF-βmRNA 表達(dá)水平比較 對照組、ADSCs 組及ADSCsOX40Ig組的IFN-γmRNA 相對表達(dá)水平依次降低，而IL-10、TGF-βmRNA相對表達(dá)水平依次升高（P＜0.01），見表1。

Fig.1 Validation of the recombinant plasmid pcDNA3.1(+)/OX40Ig圖1 pcDNA3.1（+）/OX40Ig質(zhì)粒的酶切鑒定

Fig.2 DNA sequencing graph of pcDNA3.1(+)/OX40Ig圖2 pcDNA3.1（+）/OX40Ig重組質(zhì)?；驕y序圖

Fig.3 Phenotypic characterization of ADSCs圖3 ADSCs表型特征

Fig.4 ADSCs multilineage differentiation capacity(×200)圖4 ADSCs多向分化能力（×200）

Fig.5 Expression of OX40Ig detected by Western blot analysis圖5 Western blot檢測OX40Ig融合蛋白表達(dá)情況

Tab.1 Comparison of IFN-γ,IL-10 and TGF-β mRNA between the three groups表1 3組IFN-γ、IL-10、TGF-β mRNA表達(dá)水平比較（n=4，）

Tab.1 Comparison of IFN-γ,IL-10 and TGF-β mRNA between the three groups表1 3組IFN-γ、IL-10、TGF-β mRNA表達(dá)水平比較（n=4，）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與ADSCs組比較，P＜0.05

組別對照組ADSCs組ADSCsOX40Ig組F IFN-γ 1.54±0.18 0.59±0.06a 0.26±0.05ab 127.923＊＊IL-10 0.20±0.01 0.55±0.04a 0.72±0.03ab 307.696＊＊TGF-β 0.17±0.02 0.34±0.03a 0.44±0.03ab 83.180＊＊

3 討論

3.1 共刺激分子-Ig 融合蛋白用于共刺激通路阻斷 研究顯示，激活T 細(xì)胞所必需的共刺激分子信號（第二信號）主要來自CD28、可誘導(dǎo)共刺激分子、OX40 等共刺激途徑［6］。OX40/OX40L 對維持效應(yīng) T細(xì)胞的活化、增殖及T 細(xì)胞免疫記憶等發(fā)揮重要生物學(xué)功能。研究發(fā)現(xiàn)，OX40基因敲除小鼠因喪失增殖分化能力，T細(xì)胞活化后會大量凋亡，而增強(qiáng)OX40基因表達(dá)可阻止T細(xì)胞無反應(yīng)狀態(tài)并打破基因敲除小鼠已建立的外周免疫耐受［7］。近期研究發(fā)現(xiàn)，OX40可作為預(yù)測急性排斥反應(yīng)的一個分子標(biāo)志物，是T 細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答的關(guān)鍵共刺激分子［8-9］。共刺激分子與Ig融合蛋白通過重組工程技術(shù)可產(chǎn)生共刺激分子-Ig 融合蛋白，用于共刺激阻斷；與其他免疫抑制策略比較，共刺激分子-Ig融合蛋白可更好地誘導(dǎo)特異性免疫耐受并減少脫靶效應(yīng)［10］。Kitchens等［11］研究顯示，Balatacept與人源化抗OX40L抗體組合給藥可顯著延長非靈長類動物移植腎存活時間。Chen 等［12］研究顯示，通過腺病毒介導(dǎo)OX40Ig基因表達(dá)來阻斷OX40-OX40L 信號通路，可抑制大鼠同種異體肝移植排斥反應(yīng)，并通過降低IL-2表達(dá)而誘導(dǎo)免疫耐受。本實(shí)驗所構(gòu)建的pcDNA3.1（+）/OX40Ig質(zhì)粒 DNA 序列測序鑒定結(jié)果表明，DNA 序列與目標(biāo)序列完全匹配，無插入、缺失和移碼突變，表明成功構(gòu)建了真核表達(dá)重組質(zhì)粒，因此通過OX40-OX40L阻斷誘導(dǎo)免疫耐受有望成為一種有前景的治療策略。

3.2 ADSCs 應(yīng)用 根據(jù)全球最大的臨床試驗登記系統(tǒng)Clinical Trials 的數(shù)據(jù)，全球共有數(shù)千項間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）治療相關(guān)的臨床研究登記注冊，主要研究MSCs治療某種特定疾病的安全性和有效性［13］。ADSCs 具有取材方便、易于標(biāo)準(zhǔn)化大規(guī)模生產(chǎn)以及可被基因修飾等特點(diǎn)。此外，ADSCs 具有比骨髓MSCs更強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)能力，是具有臨床應(yīng)用前景的種子細(xì)胞［14-15］。Sánchez-Guijo 等［16］對 13 例重癥新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）患者在接受機(jī)械通氣的情況下給予ADSCs治療，結(jié)果表明，ADSCs可在重癥COVID-19 患者中安全使用，并且大多數(shù)受試者臨床癥狀得到改善。本研究結(jié)果顯示，ADSCs 表面標(biāo)志物CD90、CD105和CD73呈陽性表達(dá)，而造血干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD34、白細(xì)胞共同抗原CD45 均呈陰性表達(dá)，同時ADSCs 具有誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞能力，表明來自脂肪組織所分離培養(yǎng)擴(kuò)增的細(xì)胞為MSCs。鑒于ADSCs 的這些獨(dú)特優(yōu)勢，ADSCs有望成為共刺激分子誘導(dǎo)特異性免疫耐受的理想的基因運(yùn)載工具。

3.3OX40Ig基因修飾ADSCs 免疫耐受通常指當(dāng)ADSCs 遷移到目標(biāo)組織時，共刺激分子融合蛋白可以在局部持續(xù)釋放，同時發(fā)揮ADSCs免疫調(diào)節(jié)、損傷修復(fù)等多方面作用，兩者可協(xié)同誘導(dǎo)免疫耐受，且不存在常規(guī)免疫抑制劑帶來的不良反應(yīng)。研究顯示，利用基因工程技術(shù)將共刺激分子融合蛋白基因轉(zhuǎn)染至ADSCs，可使ADSCs 在體內(nèi)持續(xù)分泌特定融合蛋白并延長融合蛋白在體內(nèi)的半衰期，發(fā)揮細(xì)胞治療與基因治療對誘導(dǎo)免疫耐受的協(xié)同作用［17］。目前，ADSCs可以較容易地用已知的病毒和非病毒載體進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)，并有效地過表達(dá)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物，這使得用基因工程技術(shù)開發(fā)以ADSCs為基礎(chǔ)表達(dá)所需治療因子的構(gòu)想成為可能［18］。本研究使用核轉(zhuǎn)染方法將pcDNA3.1（+）/OX40Ig重 組 質(zhì) 粒 轉(zhuǎn) 染 ADSCs，Western blot結(jié)果顯示，ADSCs細(xì)胞中OX40Ig蛋白表達(dá)顯著升高，表明通過核轉(zhuǎn)染技術(shù)重組質(zhì)粒能夠成功介導(dǎo)融合蛋白在真核細(xì)胞中的表達(dá)，從而為進(jìn)一步研究其對淋巴細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用打下基礎(chǔ)。

3.4 ADSCsOX40Ig對異基因淋巴細(xì)胞的免疫抑制作用 本研究結(jié)果顯示，與ADSCs 比較，ADSCsOX40Ig在體外可顯著增強(qiáng)異基因淋巴細(xì)胞增殖抑制率，表明ADSCsOX40Ig表達(dá)OX40Ig 并具有生物學(xué)功能，提示ADSCs可能通過與淋巴細(xì)胞直接接觸抑制了異基因淋巴細(xì)胞的增殖，進(jìn)而發(fā)揮其免疫抑制作用，并通過OX40Ig阻斷T細(xì)胞之間的OX40/OX40L共刺激信號通路進(jìn)一步增強(qiáng)了其對ADSCs 的免疫抑制作用，從而發(fā)揮兩者協(xié)同誘導(dǎo)異基因淋巴細(xì)胞的低反應(yīng)性作用。相關(guān)研究顯示，應(yīng)用MSCs 或阻斷OX40 共刺激通路均可通過影響Th 的極化來發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用［2，19］。IFN-γ、IL-10 以及 TGF-β 分別是 Th1、Th2及調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（Treg）表達(dá)和釋放的主要細(xì)胞因子［20］。本研究結(jié)果顯示，與ADSCs 比較，ADSCsOX40Ig能夠進(jìn)一步下調(diào)淋巴細(xì)胞IFN-γmRNA 表達(dá)，同時上調(diào)IL-10和TGF-βmRNA 表達(dá)，提示上調(diào)的IL-10及TGF-β使混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)體系中的T淋巴細(xì)胞群由促炎性Th1 占主導(dǎo)向抗炎性Th2 和Treg 偏移，從而發(fā)揮負(fù)性免疫調(diào)節(jié)作用。因此，筆者認(rèn)為，OX40Ig基因修飾的ADSCs 可同時發(fā)揮ADSCs 的免疫調(diào)節(jié)作用和OX40Ig的共刺激阻斷作用，協(xié)同誘導(dǎo)免疫耐受，其可成為抑制異基因淋巴細(xì)胞活化及誘導(dǎo)其低反應(yīng)性的有效策略，但ADSCsOX40Ig在體內(nèi)是否發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用仍有待深入研究。