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        八角楓丸劑抗大鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制

        2021-10-26 12:55:50徐李玲黃艷萍郭殊瑋梁寶賢蔣偉哲付書婕
        中成藥 2021年10期
        關(guān)鍵詞:丸劑滑膜類風(fēng)濕

        徐李玲, 黃艷萍, 郭殊瑋, 梁寶賢, 蔣偉哲, 付書婕

        (廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,廣西 南寧 530021)

        類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種常見的全身性自身免疫性疾病,以關(guān)節(jié)的慢性炎癥、軟骨和關(guān)節(jié)骨的破壞為特征,表現(xiàn)為類風(fēng)濕結(jié)節(jié)、肺間質(zhì)病變、Felty’s綜合征等一系列關(guān)節(jié)外表現(xiàn)[1-2],是一種典型的慢性炎性自身免疫性疾病,主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)炎、滑膜增生、軟骨及骨破壞。目前,相關(guān)治療藥物包括非甾體類抗炎藥、甾體類抗炎藥、疾病修飾類抗風(fēng)濕藥、生物制劑、中藥[3]。NF-κB信號通路參與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制,它作為轉(zhuǎn)錄因子,通過激活和參與炎癥產(chǎn)生(如IL-1β、TNF-α等)來調(diào)節(jié)發(fā)病機(jī)理,從而影響本病炎癥進(jìn)展[4-6]。

        八角楓為八角楓科八角楓屬植物AlangiumChinese(Lour)Harms,其味辛溫[7-8],主要成分為生物堿,烯、醇醚類、苷類等[9-11],對中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、平滑肌、呼吸系統(tǒng)均有良好的作用[12]。八角楓丸劑由廣西壯要方醫(yī)院醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑室提供,具有鎮(zhèn)痛、消炎、抗風(fēng)濕、肌肉松弛的作用[13-14],主要用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病的治療。本實(shí)驗(yàn)建立膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎大鼠模型,研究八角楓丸劑抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎活性及其可能的作用機(jī)制。

        1 材料

        1.1 動物 SPF級雄性SD大鼠40只,體質(zhì)量(150±20)g,由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供,實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號SCXK(桂)2014-0002,溫度控制在(23±2)℃,相對濕度控制在(50±10)%,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

        1.2 藥物 八角楓丸劑(批號20190730,廣西壯要方醫(yī)院醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑室自制);雷公藤多苷片(批號20190401,湖南千金協(xié)力藥業(yè)有限公司)。

        1.3 試劑 牛源性Ⅱ型膠原蛋白(批號190209,美國Chondrex公司);弗氏不完全佐劑(批號SLBZ2765,美國Sigma公司);羧甲基纖維素鈉CMC-Na(批號20180110,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);4%多聚甲醛溶液(批號P1110)、苯甲基磺酰氟化物PMSF(批號20190903)、RIPA裂解液(批號20190826),均購自北京索萊寶科技有限公司;腫瘤壞死因子(TNF-α)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β1)、白介素1β(IL-1β)、白介素10(IL-10)ELISA試劑盒(批號均為20191220),均購自于南京建成生物工程研究所;β-actin抗體(批號4970S)、Anti-rabbit IgG(H+L).(DyLightTM800 4×PEG Conjugate)(批號5151P),均購自美國CST公司;NLRP3抗體(批號AB263899,英國Abcam公司);TLR4抗體(批號ABS143411)、IRAK1抗體(批號ABS116547),均購自上海愛必信生物科技有限公司。

        1.4 儀器 冷凍離心機(jī)(MicroCL17R型,美國Thermo Fisher Scientific公司);連續(xù)光譜掃描酶標(biāo)儀(SpectraMaxPlus384型,香港分子儀器公司);電泳儀(PowerPac HC型,美國Bio-Rad公司);Odyssey紅外熒光掃膜成像系統(tǒng)(LI-COROdyssey CLx型,美國LI-COR公司)。

        2 方法

        2.1 八角楓丸劑的制備 稱取八角楓適量,加入10倍量蒸餾水煎煮提取2次,每次1 h,合并濾液,濃縮成稠膏,蒸干為干膏,取適量加入輔料(CMS-Na和淀粉)和潤濕劑(水)制丸,干燥,即得。

        2.2 造模 將溶解于冰醋酸的牛源性Ⅱ型膠原蛋白加入等體積的弗式不完全佐劑,在冰浴條件下使兩者充分乳化(以乳化液滴入水中不擴(kuò)散為度),使用高速勻漿機(jī)充分混合均勻,轉(zhuǎn)速設(shè)置為3 000 r/min,時(shí)間間隔3 min,其間適時(shí)更換冰水混合物,保持離心管溫度在4 ℃左右,以免膠原變性,乳劑最終狀態(tài)應(yīng)充分混勻,呈油包水狀。若未達(dá)到此效果需重復(fù)上述操作過程,最終質(zhì)量濃度為1 mg/mL。在大鼠尾根部及足恥底部注射牛源性Ⅱ型膠原蛋白乳劑各0.1 mL,初次免疫后第7天,在大鼠尾根部、背部以相同劑量再次免疫[15]。

        2.3 分組及給藥 造模成功后,將大鼠分為模型組、八角楓丸劑高(84 mg/kg)和低(21 mg/kg)劑量組、陽性藥(15 mg/kg雷公藤多苷)組、空白組,按10 mL/kg劑量灌胃給藥,模型組、空白組大鼠灌胃給予等量0.5%的CMC-Na,連續(xù)28 d。

        2.4 檢測指標(biāo)

        2.4.1 足厚度 分別于致炎前(第0天)和致炎后第14、21、28、35、42天,用軟尺測量每只大鼠右后爪周長,游標(biāo)卡尺測量右足肉墊厚度。

        2.4.2 關(guān)節(jié)炎指數(shù) 參考文獻(xiàn)[16-17]報(bào)道,于致炎前(第0天)和致炎后第14、21、28、35、42天進(jìn)行評分,標(biāo)準(zhǔn)為(1)0分,正常;(2)1分,踝關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅斑和輕微腫脹;(3)2分,踝關(guān)節(jié)到跖關(guān)節(jié)或掌關(guān)節(jié)紅斑和輕微腫脹;(4)3分,踝關(guān)節(jié)到跖趾關(guān)節(jié)或掌關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅斑和中度腫脹;(5)4分,踝關(guān)節(jié)到趾關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅斑和重度腫脹。

        2.4.3 免疫器官指數(shù) 各組大鼠禁食12 h,末次給藥1 h后腹腔注射水合氯醛麻醉,分離脾臟和胸腺,稱定質(zhì)量,計(jì)算大鼠免疫器官指數(shù),公式為脾臟或胸腺指數(shù)=(脾臟或胸腺質(zhì)量/體質(zhì)量)×103。

        2.4.4 血清炎癥因子水平 各組大鼠禁食12 h,末次給藥1 h后腹腔注射水合氯醛麻醉,腹主動脈取血,3 000 r/min離心15 min,取血清,采用ELISA法檢測血清IL-1β、TNF-α、IL-10、TGF-β1水平。

        2.4.5 組織病理學(xué) 大鼠脫頸處死,立即分離病變關(guān)節(jié),4%多聚甲醛固定48 h,10%EDTA脫鈣液脫鈣,以大頭針刺入踝關(guān)節(jié)局部無阻力感為脫鈣完全,HE染色后,于顯微鏡下觀察踝關(guān)節(jié)組織病理學(xué)變化及評分,標(biāo)準(zhǔn)為(1)滑液損傷,無損傷0分,輕度損傷1分,中度損傷或增生2分,嚴(yán)重破壞3分;(2)炎性浸潤,無炎癥0分,輕度浸潤1分,溫和的滲透2分,嚴(yán)重的滲透3分;(3)軟骨破壞,無損傷0分,輕度破壞1分,中度破壞2分,嚴(yán)重破壞伴有軟骨丟失或完全碎裂3分;(4)骨破壞,無損傷0分,輕度軟骨下骨質(zhì)破壞1分,中度骨質(zhì)破壞2分,骨破壞嚴(yán)重伴有大面積骨丟失3分;(5)骨贅形成,無0分,輕微形成1分,中等形成2分,廣泛形成3分[18]。

        2.4.6 Western blot法 給藥4周后,麻醉處死各組大鼠,取下踝關(guān)節(jié)滑膜組織,用含蛋白酶和磷酸酶抑制劑混合物的高效RIPA組織/細(xì)胞裂解液裂解蛋白,加緩沖液,沸水浴5 min變性,上樣,電泳,轉(zhuǎn)膜1.5 h,5% BSA封閉液封閉1 h,孵育一抗,4 ℃過夜,二抗孵育1 h,掃膜,通過Image J軟件檢測蛋白表達(dá)。

        3 結(jié)果

        3.1 足厚度 造模后14 d,與空白組比較,模型組、陽性藥組、八角楓丸劑組大鼠足厚度增大(P<0.01);造模后21~42 d,與模型組比較,陽性藥組、八角楓丸劑組大鼠足厚度減小(P<0.05,P<0.01),見表1。

        表1 八角楓丸劑對大鼠足厚度的影響

        3.2 關(guān)節(jié)炎指數(shù) 造模后14~42 d,與空白組比較,模型組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)升高(P<0.01);造模后21~42 d,與模型組比較,陽性藥組、八角楓丸劑組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)降低(P<0.05,P<0.01),見表2。

        表2 八角楓丸劑對大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)的影響(分,

        3.3 臟器指數(shù) 與空白組比較,模型組大鼠脾臟、胸腺指數(shù)升高(P<0.01);與模型組比較,陽性藥組、八角楓丸劑組大鼠脾臟、胸腺指數(shù)降低(P<0.01),見表3。

        表3 八角楓丸劑對大鼠臟器指數(shù)的影響

        3.4 血清炎癥因子水平 與空白組比較,模型組大鼠血清TNF-α、IL-1β、TGF-β1水平升高(P<0.01),IL-10水平降低(P<0.01);與模型組比較,陽性藥組、八角楓丸劑組大鼠血清TNF-α、IL-1β、TGF-β1水平降低(P<0.05,P<0.01),IL-10水平升高(P<0.01),見表4。

        表4 八角楓丸劑對大鼠血清TNF-α、IL-10、IL-1β、TGF-β1水平的影響

        3.5 踝關(guān)節(jié)組織病理學(xué) 空白組大鼠滑膜組織細(xì)胞形態(tài)完整,無炎性細(xì)胞浸潤,關(guān)節(jié)軟骨無損傷,關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)完整;模型組大鼠關(guān)節(jié)腔內(nèi)滑膜組織增生,滑膜下組織血管擴(kuò)張,部分滑膜組織纖維化,有血管翳形成,并伴有大量炎性細(xì)胞浸潤;陽性藥物組大鼠病理切片顯示關(guān)節(jié)面光滑,但細(xì)胞形態(tài)改變,有纖維化痕跡;八角楓丸劑低劑量組效果不理想,而高劑量組大鼠細(xì)胞排列整齊,視野內(nèi)滑膜細(xì)胞增生減少,有少量炎性細(xì)胞浸潤,未見血管翳,與模型組比較病理變化明顯,見圖1、表5。

        圖1 各組大鼠踝關(guān)節(jié)組織病理學(xué)(×100)

        表5 八角楓丸劑對大鼠踝關(guān)節(jié)組織病理學(xué)的影響(分,

        3.6 NLRP3、TLR4、IRAK1蛋白表達(dá) 與空白組比較,模型組大鼠滑膜組織NLRP3、TLR4、IRAK1蛋白表達(dá)升高(P<0.01);與模型組比較,陽性藥組、八角楓丸劑組NLRP3、TLR4、IRAK1蛋白表達(dá)降低(P<0.05,P<0.01),見圖2、表6。

        表6 八角楓丸劑對大鼠滑膜組織NLRP3、TLR4、IRAK1蛋白表達(dá)的影響

        圖2 各組大鼠滑膜組織NLRP3、TLR4、IRAK1蛋白表達(dá)

        4 討論

        類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是一種慢性全身性自身免疫性疾病,主要累及關(guān)節(jié),引起增殖性滑膜炎。其特點(diǎn)是大量炎性細(xì)胞浸潤,形成血管翳,滑膜擴(kuò)張,侵犯鄰近關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨,與腫瘤相似,造成損傷[19-20]。NF-κB信號通路參與各種炎癥因子和基質(zhì)金屬蛋白酶的產(chǎn)生[21-22]。NF-κB作為一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用,其中包括兩個(gè)主要機(jī)制,首先NF-κB的激活能增加炎癥介質(zhì)的轉(zhuǎn)錄,反過來,這些炎癥介質(zhì)可以激活NF-κB的表達(dá);兩者都構(gòu)成正反饋機(jī)制,導(dǎo)致類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的炎癥介質(zhì)[23]。

        本研究結(jié)果顯示,八角楓丸劑能降低大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù),能緩解大鼠的足趾紅腫,表明八角楓丸劑能較好的抑制RA大鼠的炎癥癥狀。通過病理學(xué)分析可以知道八角楓丸劑組大鼠細(xì)胞排列整齊,視野內(nèi)滑膜細(xì)胞增生減少,有少量炎性細(xì)胞浸潤,未見血管翳。與模型組比較,病理改變明顯。由此可看出,八角楓丸劑對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎具有良好的治療作用。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜,根據(jù)相關(guān)研究顯示,在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的病變過程中,會使關(guān)節(jié)積液與滑膜組織中T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞數(shù)量增多,進(jìn)而促進(jìn)多種炎癥因子的分泌,炎癥因子是關(guān)鍵功能分子在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中影響發(fā)病和進(jìn)展的主要原因之一[24],包括TNF-α、IL-6和IL-1β[25]。其中IL-1β在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制中起著重要的作用。研究表明,IL-1β主要由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生,IL-1β可以激活單核細(xì)胞巨噬細(xì)胞,誘導(dǎo)細(xì)胞粘附分子,趨化因子和其他炎癥介質(zhì),從而導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎癥加劇[26]。本文研究顯示,八角楓丸劑可以降低大鼠血清中IL-1β、TNF-α、TGF-β1水平,升高IL-10水平,提示八角楓丸劑可能通過減少炎癥因子的產(chǎn)生從而減輕類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠足腫脹炎癥反應(yīng)來發(fā)揮抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用。說明降低炎癥因子的水平可能是八角楓丸劑抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎作用機(jī)制的一部分。

        NF-κB信號通路作為參與炎癥反應(yīng)的最關(guān)鍵的信號通路,其密切作用于慢性疾病的發(fā)展過程。NF-κB有能力控制基因產(chǎn)物的表達(dá)影響多種細(xì)胞反應(yīng),包括細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡。該信號通路可刺激滑膜的新生血管生成和炎癥反應(yīng)[27-28]。蛋白免疫印跡法結(jié)果顯示,八角楓丸劑能下調(diào)NLRP3、TLR4、IRAK1蛋白表達(dá)水平,說明八角楓丸劑抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的機(jī)制與抑制NF-κB信號通路的激活有關(guān)。

        綜上,八角楓丸劑對牛源性Ⅱ型膠原蛋白所致的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎具有良好的治療作用,其機(jī)制與抑制炎癥因子的產(chǎn)生和下調(diào)NF-κB信號通路相關(guān)蛋白水平有關(guān)。

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