蔣繼志,張聰穎,梁嬌,喬柳,孟翠麗
(1.河北大學 生命科學學院,河北 保定 071002;2. 邢臺醫(yī)學高等??茖W校 基礎(chǔ)醫(yī)學部,河北 邢臺 054000)
植物病害生物防治因具有低毒、高效、環(huán)境友好等特性,越來越受到學者們的關(guān)注,細菌因其種類多、繁殖快、易于存活等特點而更顯優(yōu)勢[1-2].生防細菌的抑菌機理主要有空間和營養(yǎng)競爭[3]、誘導植物抗性[4]、自發(fā)產(chǎn)生抑菌物質(zhì)[5]、促進植物生長[6]等方式,其中通過空間競爭和營養(yǎng)競爭是眾多生防細菌抑制植物病原菌的重要方式之一[3,7],部分拮抗菌能同時借助多種方式抑制植物病原菌.王智榮等[7]發(fā)現(xiàn)熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)ZX既可以產(chǎn)生抑菌物質(zhì),又可通過對葡萄糖、果糖等營養(yǎng)物質(zhì)的利用優(yōu)勢抑制病原菌指狀青霉(Penicilliumdigitatum)的生長;虢雅潔等[8]報道淡紫紫孢菌(Purpureocilliumlilacinum)PLF-1能誘導百合種球?qū)怄哏牭毒?Fusariumoxysporum)的抗性,主要是增強植株中超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)活性,有效減輕尖孢鐮刀菌的毒害作用,并促進植株健康生長,同時還能有效抑制尖孢鐮刀菌生長,抑制率高達72%.
關(guān)于致病疫霉(Phytophthorainfestans)拮抗細菌的抑制機理,當前主要集中于拮抗菌自身產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)及誘導植物抗性與促進植物生長方面.林睿[9]研究表明供試的8株致病疫霉拮抗放線菌均可以產(chǎn)生吲哚乙酸(IAA),且具有解磷能力、產(chǎn)脲酶能力,可以分解土壤中的大分子營養(yǎng)物質(zhì),促進馬鈴薯植株的生長;馬強[10]發(fā)現(xiàn)弱小珊瑚球菌E10(Corallococcusexiguous)和珊瑚狀珊瑚球菌E10(C.coralloides)的次級代謝產(chǎn)物具有比較高的抗致病疫霧活性;王游游[11]證明枯草芽孢桿菌WL-2可以產(chǎn)生Iturin A和Surfactin兩類脂肽物質(zhì)來抑制致病疫霉,并且該菌株對馬鈴薯植株具有良好的促生作用.迄今為止,對于拮抗細菌是否通過營養(yǎng)與空間位點競爭或通過競爭作用與其他抑菌作用協(xié)同抑制致病疫霉鮮見報道.
HT-6菌株是本研究室前期從西藏林芝核桃樹病葉中分離出的1株內(nèi)生細菌,經(jīng)鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis),其菌液對致病疫霉菌絲生長具有很強的抑制作用(抑菌率為89.22%)[12],并能使菌絲體形態(tài)發(fā)生畸變,但無菌體發(fā)酵濾液沒有抑菌作用[13],同時在HT-6菌液和致病疫霉菌落之間沒有觀察到明顯且很寬的抑菌帶,推測HT-6的抑菌作用可能依賴于細菌的快速生長.另外,本研究室張紅霞等[14]發(fā)現(xiàn)HT-6菌株經(jīng)致病疫霉誘導(對峙培養(yǎng))后能產(chǎn)生纖維素酶(活力為8.141 U),且該纖維素酶可引起致病疫霉菌絲體形態(tài)發(fā)生明顯畸變(畸變率為23%),而HT-6菌株單獨培養(yǎng)時不產(chǎn)生纖維素酶.由于致病疫霉細胞壁中主要含有纖維素和葡聚糖等結(jié)構(gòu)物質(zhì),菌絲體生長受阻尤其是形態(tài)發(fā)生畸變,可能是細胞壁中的纖維素和葡聚糖等發(fā)生了變化.因此,本實驗擬證實HT-6菌株對致病疫霉的營養(yǎng)或空間位點競爭作用,同時探討致病疫霉菌體和菌絲體細胞壁制劑對HT-6產(chǎn)生纖維素酶和葡聚糖酶的影響,并明確HT-6對致病疫霉的競爭作用和致病疫霉誘導HT-6產(chǎn)生抗菌物質(zhì)在抑制致病疫霉菌絲生長中的相互關(guān)系,為進一步闡明HT-6菌株的拮抗機制提供依據(jù).
枯草芽孢桿菌HT-6(Bacillussubtilis)為河北大學生命科學學院植物病理研究室從西藏林芝核桃樹病葉中分離得到的1株內(nèi)生細菌.致病疫霉[Phytophthorainfestans(Mont.) de Bary]W101菌株為本實驗室保存菌株(黑麥培養(yǎng)基斜面14 ℃培養(yǎng)箱黑暗保存).
黑麥固體培養(yǎng)基(Rye)、黑麥液體培養(yǎng)基(RL)、LB液體培養(yǎng)基(LBL)、LB固體培養(yǎng)基(LB)、苯胺藍葡聚糖酶檢測培養(yǎng)基(ABG)、剛果紅纖維素培養(yǎng)基(CRC)、CAS固體培養(yǎng)基(CAS)、化學合成培養(yǎng)基(LSM:MgSO4·7H2O, 0.2 g;NH4NO3, 1.0 g;K2HPO4, 0.9 g;KCl, 0.15 g;FeCl2,0.002 g;ZnSO4, 0.002 g;葡萄糖, 5.0 g;蒸餾水1 000 mL).
參考Ohtsu[15]的方法并作如下改進,在Rye平板上放置1個瓊脂柱(PDA培養(yǎng)基,d=10 mm,h=2 mm),將HT-6菌餅(d=9 mm)經(jīng)LB培養(yǎng)24 h后置于瓊脂柱上表面,再取經(jīng)Rye培養(yǎng)7 d的致病疫霉菌餅(d=9 mm)置于HT-6菌餅上,20 ℃黑暗培養(yǎng)7 d,以瓊脂柱上不接HT-6只接致病疫霉菌餅做為對照,觀察記錄HT-6及致病疫霉在瓊脂柱及Rye表面的生長情況.
1.3.1 產(chǎn)生嗜鐵素的檢測
參照余賢美[16]的方法觀察HT-6和致病疫霉是否產(chǎn)生嗜鐵素,取150 μL HT-6菌液加入CAS平板上的孔中(d=9 mm),以接種150 μL LBL作為對照,30 ℃黑暗培養(yǎng)3 d;取致病疫霉(d=9 mm)菌餅置于CAS平板上,以接種空白Rye瓊脂塊作為對照,20 ℃黑暗培養(yǎng)3 d;分別觀察CAS平板上HT-6和致病疫霉菌落邊緣是否產(chǎn)生橘黃色暈圈,判斷是否產(chǎn)生嗜鐵素.
1.3.2 競爭葡萄糖的檢測
按照邵江濤等[17]的方法,在150 mL LSM中加入3個HT-6菌餅(d=9 mm)后37 ℃、150 r/min培養(yǎng)5 d,培養(yǎng)液經(jīng)離心(6 000 r/min,5 min)、過濾(0.22 μm)得到無菌體發(fā)酵液;同樣在150 mL LSM中加入3個致病疫霉菌餅(d=9 mm)后20 ℃黑暗條件下靜置培養(yǎng)5 d,離心及過濾同HT-6無菌發(fā)酵液的制備,得到致病疫霉無菌體發(fā)酵液;采用硫酸-蒽銅法[18]測定2種無菌體發(fā)酵液中剩余葡萄糖含量,利用葡萄糖含量標準曲線與空白LSM培養(yǎng)液中葡萄糖的含量相比,得到細菌HT-6及致病疫霉的葡萄糖利用率.
1.3.3 競爭硝態(tài)氮的檢測
取在Rye上活化培養(yǎng)了7 d的致病疫霉菌餅(d=9 mm)置于新鮮的Rye平板一側(cè),將在LB上涂布培養(yǎng)24 h的HT-6菌餅(d=9 mm)置于距離致病疫霉菌餅邊緣30 mm處,20 ℃黑暗靜置培養(yǎng)3 d,取兩菌落之間的無菌體瓊脂塊(DCB,d=9 mm),按照張紅霞等[14]的方法,分別在ABG及CRC培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d,觀察有無透明圈出現(xiàn),從而判斷有無β-1,3-葡聚糖酶和纖維素酶產(chǎn)生,并用DNS法[14]測定酶活,同時單獨培養(yǎng)HT-6菌株,打取其菌落周圍的無菌體瓊脂塊(d=9 mm)作為對照.
參照李永才等[20]的方法并作如下改進制備菌絲體CWP,在新鮮Rye表面緊貼放置滅過菌的玻璃紙,取培養(yǎng)了7 d的致病疫霉菌餅放于玻璃紙上,20 ℃黑暗培養(yǎng)7 d,用無菌牙簽刮取菌絲體,經(jīng)無菌蒸餾水和PBS緩沖液沖洗、300目(孔徑0.05 mm)篩網(wǎng)過濾后收集菌絲體,取2 g菌絲體溶于100 mL無菌蒸餾水中于組織搗碎機中勻漿,得到致病疫霉菌絲體CWP;分別取3、6、9、12、15 mL CWP加入LBL中,得到CWP質(zhì)量濃度分別為0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 g/L的溶液,再向其中接種經(jīng)LBL活化培養(yǎng)24 h的HT-6菌液原液200 μL(OD600=1.433),37 ℃、150 r/min培養(yǎng)48 h,培養(yǎng)液經(jīng)離心(6 000 r/min,5 min)和過濾(0.22 μm)后,得到CWP誘導后的HT-6無菌體發(fā)酵液,按照1.4節(jié)中的方法分別檢測其中β-1,3-葡聚糖酶和纖維素酶的活力.
采用打孔法及平板對峙培養(yǎng)法測定經(jīng)CWP誘導后的HT-6無菌發(fā)酵液對致病疫霉的抑菌活性[14].在新鮮Rye平板中央接種培養(yǎng)7 d的致病疫霉菌餅(d=9 mm),菌餅兩側(cè)對稱打孔(d=9 mm),孔中滴加適宜質(zhì)量濃度CWP誘導后的HT-6無菌發(fā)酵液200 μL(濃縮10倍),20 ℃黑暗培養(yǎng)7 d,以LBL、HT-6無菌體發(fā)酵液及單獨培養(yǎng)的HT-6菌液原液分別作為對照,十字交叉法測量菌落直徑,統(tǒng)計抑菌率,并挑取受抑制的致病疫霉菌落邊緣的菌絲體,鏡檢觀察菌絲體的畸變情況并計算畸變率[14].
抑菌率=(對照菌落半徑-處理菌落半徑)/(對照菌落半徑-菌餅半徑)×100%,
畸變率= 發(fā)生畸變的菌絲(段)數(shù) / 總菌絲(段)數(shù)×100%.
實驗數(shù)據(jù)使用Excel(2020)進行統(tǒng)計,最后經(jīng)Origin(8.0)軟件在P<0.05水平上進行差異顯著性分析.
采用空間位點競爭法檢測HT-6與致病疫霉的生長速率(mm/d),結(jié)果如圖1所示.致病疫霉菌餅與HT-6菌餅在PDA瓊脂柱上對接培養(yǎng)后,HT-6越過瓊脂柱并在Rye表面迅速生長,至第7天菌落半徑可達20.0 mm,生長速率為2.8 mm/d(圖1a-g),對接培養(yǎng)中的致病疫霉僅在菌餅周圍和上方長出很少量菌絲,沒有擴展到Rye表面,基本被HT-6菌落抑制,而對照瓊脂柱上致病疫霉在第3天開始快速生長,至第7天時菌絲體已布滿Rye表面,菌落半徑達42.0 mm,生長速率達到6.0 mm/d(圖1a1-g1).表明細菌HT-6可以通過自身的迅速生長占據(jù)空間位點,從而抑制致病疫霉菌絲的生長.
a-g.HT-6與致病疫霉對接培養(yǎng)1~7 d的結(jié)果;a1-g1.單獨接種致病疫霉培養(yǎng)1~7 d的結(jié)果.圖1 細菌HT-6與致病疫霉在PDA瓊脂柱上對接后對空間位點的競爭Fig.1 Competition between HT-6 strain and P. infestans in special position on agar column
a.HT-6菌液;b.LBL;c.致病疫霉菌餅.圖2 HT-6與致病疫霉產(chǎn)生嗜鐵素的檢測Fig.2 Siderophore in HT-6 strain and P. infestans was detected by chrome azurol sulphonate medium
致病疫霉菌餅與HT-6菌餅對峙培養(yǎng)7 d后,將兩菌落之間的無菌體瓊脂塊(DCB)分別轉(zhuǎn)移至CRC和ABG培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)3 d,發(fā)現(xiàn)該瓊脂塊在CRC(圖3a)和AGB(圖3b)上均有明顯的透明圈出現(xiàn),而單獨培養(yǎng)HT-6菌落周圍的無菌體瓊脂塊在CRC(圖3a)和AGB(圖3b)上均沒有觀察到明顯的透明圈出現(xiàn),說明HT-6在單獨培養(yǎng)時不產(chǎn)生纖維素酶和β-1,3-葡聚糖酶,但受致病疫霉活體或其分泌的某種成分誘導或刺激后產(chǎn)生了這2種酶.進一步用DNS法測得DCB中纖維素酶的活力為6.638 U,β-1,3-葡聚糖酶的活力為2.913 U.
a-b.HT-6與致病疫霉對峙培養(yǎng)之間的無菌體瓊脂塊;c-d.單獨培養(yǎng)HT-6后的無菌體瓊脂塊.圖3 HT-6與致病疫霉對峙培養(yǎng)后產(chǎn)生纖維素酶及β-1,3-葡聚糖酶的檢測Fig.3 Detection of cellulase and β-1,3-glucanase after dual culture of HT-6 strain and P. infestans
利用DNS法檢測了不同質(zhì)量濃度CWP誘導后HT-6無菌體發(fā)酵液中纖維素酶及β-1,3-葡聚糖酶的活性,結(jié)果如圖4所示.總體上來看,隨著供試CWP質(zhì)量濃度的增加,誘導后的HT-6無菌發(fā)酵液中纖維素酶活先急劇上升而后顯著下降,β-1,3-葡聚糖酶活則先上升而后基本保持不變;2種酶活均在CWP為1.2 g/L時達到最高且彼此比較接近,分別為1.326、1.289 U,但在其他質(zhì)量濃度條件下,β-1,3-葡聚糖酶活均遠高于纖維素酶活;在1.2 g/L CWP質(zhì)量濃度下的纖維素酶活與其他時間段均達到顯著性差異(P<0.05),而1.2 g/L CWP質(zhì)量濃度下的β-1,3-葡聚糖酶活僅與0.4、0.8 g/L CWP質(zhì)量濃度下的酶活有顯著性差異.
不同小寫字母及帶上標小寫字母分別表示纖維素酶、β-1,3-葡聚糖酶酶活在0.05水平上差異顯著.圖4 CWP誘導后HT-6無菌發(fā)酵液中纖維素酶及β-1,3-葡聚糖酶的活性Fig.4 Activities of cellulase and β-1,3-glucanase in HT-6 free cell fermentation liquid after CWP induction
由于單獨培養(yǎng)HT-6后的無菌體發(fā)酵液對致病疫霉菌絲生長沒有抑制作用,利用平板打孔法檢測了1.2 g/L CWP誘導培養(yǎng)HT-6后的無菌體發(fā)酵液對致病疫霉菌絲生長的影響(圖5).結(jié)果顯示,LBL和單獨培養(yǎng)HT-6的無菌體發(fā)酵液均沒有抑制作用,而CWP誘導后的HT-6無菌發(fā)酵液展現(xiàn)出了顯著的抑制活性,抑菌率達到33.25%,與LBL以及單獨培養(yǎng)HT-6的無菌體發(fā)酵液之間均有顯著性差異(P<0.05),但與單獨培養(yǎng)的HT-6菌液原液作為陽性對照(抑菌率81.33%)相比,抑菌活性要低很多,兩者之間達到顯著性差異(P<0.05).表明本來對致病疫霉菌絲生長沒有抑制作用的HT-6無菌體發(fā)酵液,經(jīng)CWP誘導后變得有抑菌作用了,推測CWP誘導后HT-6產(chǎn)生的纖維素酶和β-1,3-葡聚糖酶發(fā)揮了抑菌作用,但抑菌活性顯著低于HT-6菌液原液,表明CWP誘導后HT-6產(chǎn)生的纖維素酶和β-1,3-葡聚糖酶在抑制致病疫霉菌絲生長過程中并不起主要作用,同時暗示在HT-6菌液中可能還有其他參與抑制致病疫霉菌絲生長的物質(zhì)存在或HT-6菌株尚有其他抑菌方式存在.
a.CWP誘導后的HT-6無菌體發(fā)酵液;b.單獨培養(yǎng)的HT-6菌液;c.單獨培養(yǎng)HT-6的無菌體發(fā)酵液;d.LBL.圖5 CWP誘導培養(yǎng)后的HT-6無菌發(fā)酵液對致病疫霉菌絲體生長的抑制Fig.5 Inhibition of HT-6 free cell fermentation liquid after CWP induction on P. infestans mycelial growth
進一步挑取致病疫霉菌絲體鏡檢,觀察到經(jīng)CWP誘導后的HT-6無菌發(fā)酵液可使部分菌絲體發(fā)生畸變,畸變率約為29.58%,主要有粗細不一、扭曲、折疊、表面凸起增多、分枝增多、內(nèi)含物分布不均勻或溢出等現(xiàn)象(圖6a-c),與受HT-6菌液抑制后的菌絲體形態(tài)發(fā)生畸變相似(畸變率約為43.2%)(圖6d),而正常菌絲體粗細均勻,光滑直順,內(nèi)含物飽滿且分布均勻(圖6e).
a-c.CWP誘導后的HT-6無菌發(fā)酵液處理的菌絲;d.HT-6菌液處理的菌絲;e.單獨培養(yǎng)的正常菌絲.a.含物流出;b.粗細不一,凸起增多;c.扭曲折疊;d.內(nèi)含物分布不均勻.圖6 CWP誘導后HT-6無菌發(fā)酵液對致病疫霉菌絲體的影響Fig.6 Effect of HT-6 free cell fermentation liquid after CWP induction on P. infestans mycelia
空間位點和營養(yǎng)競爭是生防菌拮抗病原菌的重要作用機理之一[3],一種生物如果能夠優(yōu)于其他生物優(yōu)先占據(jù)空間并快速、有效地利用該空間中的各種營養(yǎng)進行生長定殖, 則能使自身更好地生存、繁殖或傳播[16].郭榮君等[21]將枯草芽孢桿菌B006和B010分別與大豆尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)和腐皮鐮刀菌 (F.solani)W1對接培養(yǎng)后,發(fā)現(xiàn)這2株細菌均可優(yōu)先在瓊脂柱表面生長并迅速在培養(yǎng)基平板上擴展,完全覆蓋病原菌,且病菌菌絲被破壞,無法形成菌落,他們推測如果這2株拮抗菌以產(chǎn)生抗菌物質(zhì)抑制病原菌生長為主,則自身不會在培養(yǎng)基表面迅速生長并擴展,因而認為這2株細菌主要是通過空間位點競爭發(fā)揮抑菌作用[22];Celar等[22]比較了生防木霉菌與多種植物病原菌(F.solani,F.sambucinum,F.moniliforme等) 之間對硝態(tài)氮的利用情況,發(fā)現(xiàn)分別培養(yǎng)6 d后,生防木霉菌對硝態(tài)氮的利用率高達100%,而供試的幾種鐮刀菌的利用率為60%~75%,均顯著低于前者,認為木霉菌主要通過營養(yǎng)競爭抑制上述植物病原菌.此外,在拮抗菌與植物病原菌相互作用中,病原菌的某些成分可作為激發(fā)子誘導拮抗菌產(chǎn)生抗菌物質(zhì),陳剛等[23]收集植物病原菌尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)、立枯絲核菌(R.solani)和稻瘟病菌(Pyriculariagrisea)的菌絲,清洗并以濾紙過濾,然后將菌絲體用 120 ℃滅活10 min,再用液氮研磨至粉末,得到細胞壁制劑(CWP),并以10 g/L的CWP對生防菌球毛殼菌(Chaetomiumglobosum)進行誘導,發(fā)現(xiàn)誘導前球毛殼菌產(chǎn)β-1,3-葡聚糖酶的能力幾乎為0,誘導后產(chǎn)酶能力顯著增強,3種病菌的CWP誘導后最高酶活力分別為0.19、0.31和0.61 U;殷福嬌[24]以華山松皰銹病菌(Cronartiumribicola)的銹孢子壁CWP誘導木霉菌(Trichodermaspp.)LS020和SS003菌株后,2種菌所產(chǎn)的β-1,3-葡聚糖酶活性均顯著增強,其中LS020菌株中酶活由1.71 U升至3.58 U,SS003菌株中酶活由2.08 U升至4.16 U.
本研究中致病疫霉菌餅與細菌HT-6菌餅對接培養(yǎng)后,致病疫霉菌絲被HT-6強烈抑制,基本無法生長,而HT-6可以正常生長并在培養(yǎng)基表面迅速蔓延,表明細菌HT-6在空間位點競爭方面占有絕對優(yōu)勢,這與郭榮君等[22]報道的枯草芽孢桿菌B006和B010主要是通過空間位點競爭抑制大豆尖孢鐮刀菌和腐皮鐮刀菌的結(jié)果一致;同時,致病疫霉不產(chǎn)生嗜鐵素,而HT-6可以產(chǎn)生嗜鐵素來優(yōu)先利用環(huán)境中的鐵,即可以通過在根際中螯合鐵來抑制植物病原體的生長(抑菌率為89.22%)[12],這與余賢美等[15]發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌CAS15可以分泌嗜鐵素來抑制稻瘟病菌、尖孢鐮刀菌等15種病原菌的結(jié)果相一致(抑制率均高于88%);HT-6對于葡萄糖和硝酸鹽的利用率均顯著高于致病疫霉,這與Celar等[22]對生防木霉菌與幾種植物病原菌競爭硝態(tài)氮的研究結(jié)果一致.此外,本實驗還發(fā)現(xiàn)HT-6經(jīng)致病疫霉菌體和CWP誘導后均可產(chǎn)生纖維素酶和β-1,3-葡聚糖酶,只是菌體誘導后產(chǎn)生的2種酶活顯著高于CWP的誘導,而HT-6菌株單獨培養(yǎng)時不產(chǎn)生這2種酶;進一步發(fā)現(xiàn)本來對致病疫霉菌絲生長無抑制作用的HT-6菌株無菌體發(fā)酵液,經(jīng)CWP誘導后對致病疫霉菌絲生長有了較強的抑制作用,可能是誘導后HT-6無菌體發(fā)酵液中的纖維素酶和β-1,3-葡聚糖酶發(fā)揮了抑菌作用.以上結(jié)果表明細菌HT-6既可通過空間與營養(yǎng)競爭又可通過致病疫霉的誘導而產(chǎn)生胞壁降解酶來協(xié)同抑制致病疫霉,其中以空間和營養(yǎng)競爭抑制病菌為主.這為深入理解HT-6對致病疫霉的抑制機理提供了新的實驗證據(jù),也暗示細菌HT-6在未來防治馬鈴薯晚疫病中應根據(jù)病害發(fā)生發(fā)展情況預先施用才會有更好的效果.因此,利用細菌HT-6在田間實際防治馬鈴薯晚疫病的實驗研究應盡快開展.