石磊，王曼，時(shí)國(guó)強(qiáng)，董振國(guó)，劉昱

(1 .暨南大學(xué) 食品安全與營(yíng)養(yǎng)研究院，廣東 廣州 510000；2．河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071003; 3. 河北三獅生物科技有限公司 研發(fā)部，河北 石家莊 050000)

病原微生物常常存在于食品源以及食物產(chǎn)品之中，往往造成疾病傳染以及難以估量的經(jīng)濟(jì)損失. 最初，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)常常被應(yīng)用于食品以及肉源動(dòng)物的病原微生物檢測(cè)，然而其具有操作煩瑣、檢測(cè)設(shè)備昂貴、檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)、假陽(yáng)性多等缺點(diǎn)，使得研究人員不斷探尋代替該技術(shù)的方法.環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技術(shù)具有高靈敏度、運(yùn)行簡(jiǎn)潔、實(shí)驗(yàn)設(shè)施低廉、高特異性等優(yōu)勢(shì)，被轉(zhuǎn)基因檢驗(yàn)[1]、胚胎性別鑒別[2-3]、病原微生物[4-8]等方面廣泛采納、應(yīng)用.迄今為止, 關(guān)于LAMP 在食品安全檢測(cè)、植物水產(chǎn)檢疫以及人類醫(yī)學(xué)檢測(cè)等方面的應(yīng)用也越來(lái)越廣泛[9]. 近年來(lái)，研究人員對(duì)LMAP進(jìn)行不斷改良并與其他技術(shù)聯(lián)用，其巨大的技術(shù)優(yōu)勢(shì)在檢驗(yàn)病原微生物的應(yīng)用中越來(lái)越明顯.因此回顧LAMP的發(fā)展經(jīng)過(guò)以及展望其發(fā)展方向，是十分必要的.

1 LAMP技術(shù)原理

21世紀(jì)初,Notomi 等[9]宣布發(fā)明了環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)，不同于PCR僅僅需要設(shè)計(jì)上下游引物，LAMP則需要設(shè)計(jì)包括外引物、內(nèi)引物最少4條引物. 利用具有鏈置換效應(yīng)以及識(shí)別延伸效應(yīng)的BstDNA聚合酶，對(duì)目的片段進(jìn)行大量且快速的擴(kuò)增. LAMP的原理在于根據(jù)目的基因的保守序列設(shè)計(jì)出1組引物，即內(nèi)外引物(FIP、BIP，F(xiàn)3、B3)，利用Bst DNA聚合酶的相關(guān)功能對(duì)目的基因片段進(jìn)行特定的指數(shù)式體外擴(kuò)增，以此就可以檢測(cè)出目的基因. Nagamine等[10]，通過(guò)設(shè)計(jì)1對(duì)環(huán)引物來(lái)大幅推進(jìn)反應(yīng)速率，耗時(shí)減少了0.5 h，使得LAMP檢測(cè)更加迅速，然而添加環(huán)引物會(huì)增加引物錯(cuò)配概率.反應(yīng)主要包括2個(gè)階段：1)在適宜的溫度下，由外引物以及內(nèi)引物擴(kuò)增出“啞鈴狀”的擴(kuò)增元件； Bst 酶作用于擴(kuò)增元件，由于折疊效應(yīng)，使得FIP折疊環(huán)化，Bst酶開(kāi)始鏈置換并進(jìn)行合成，替換出的單鏈核酸繼續(xù)環(huán)化.2)從內(nèi)引物BIP的3′末端B1區(qū)間開(kāi)始擴(kuò)增，以內(nèi)引物為模板，促使單鏈核酸合成延伸及鏈置換，生成2條環(huán)化DNA片段. 內(nèi)引物上的B2區(qū)域與其雜交，開(kāi)始新的循環(huán)擴(kuò)增. 另外，可以設(shè)計(jì)1對(duì)環(huán)引物(LF/LB)以提高擴(kuò)增效率.擴(kuò)增終產(chǎn)物具有不同個(gè)數(shù)莖環(huán)結(jié)構(gòu)，并且片段大小也不一致，在凝膠電泳擴(kuò)增后顯現(xiàn)出1組特殊的擴(kuò)增條帶.

2 LAMP應(yīng)用領(lǐng)域

2.1 LAMP在食品安全中的應(yīng)用

LAMP在食品安全中檢測(cè)真菌、細(xì)菌等病原微生物污染的應(yīng)用已經(jīng)得到了廣泛的關(guān)注與認(rèn)可[11].何琳[12]通過(guò)優(yōu)化LAMP反應(yīng)體系中的鎂離子濃度、甜菜堿濃度、反應(yīng)溫度等條件后，發(fā)現(xiàn)對(duì)蝦的白斑病病毒(white spotsyndrome virus)檢測(cè)只需45 min就有了顯著的檢出效果，在加入SYBR GeenⅠ后可達(dá)到肉眼可見(jiàn)的檢測(cè)效果.張蕾等[13]將LAMP檢測(cè)法從檢出限、特異性等方面與QRT-PCR、普通檢測(cè)方法進(jìn)行對(duì)比，并將優(yōu)化調(diào)試后的LAMP法應(yīng)用于食品安全相關(guān)方面的沙門氏菌檢測(cè)中. 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該方法與實(shí)時(shí)熒光PCR具有幾乎一致的特異性, 并且檢測(cè)更加靈敏. Ferrara等[14]建立了一種基于fum10基因設(shè)計(jì)引物的方法，并與作為標(biāo)準(zhǔn)的比色法對(duì)比.對(duì)產(chǎn)伏馬菌素B2的黑曲霉(Aspergillusniger)和衛(wèi)氏曲霉(A.welwistchiae)進(jìn)行了快速、特異的檢測(cè)，可用于玉米食品鏈現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)，適用于田間粗提取的DNA樣本的可視性評(píng)估.呂觀等[15]開(kāi)發(fā)了免疫磁珠分離(IMS)聯(lián)合LAMP技術(shù)，用來(lái)檢測(cè)牛肉中含有金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)與鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium.)這2種常見(jiàn)的食品污染菌. 首先將2種菌的抗體蛋白進(jìn)行生物素標(biāo)記，通過(guò)對(duì)鏈霉親和素磁珠進(jìn)行功能性修飾，進(jìn)而濃縮和檢驗(yàn)牛肉中的目標(biāo)病菌.

2.2 LAMP在動(dòng)植物疫病檢測(cè)中的應(yīng)用

近年來(lái)，隨著等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)改良研究的不斷開(kāi)展，LAMP被越來(lái)越多的領(lǐng)域認(rèn)可，逐漸拓展到了家禽畜牧業(yè)疫病防治和人類醫(yī)學(xué)的檢測(cè)領(lǐng)域，對(duì)比PCR檢測(cè)具有明顯優(yōu)勢(shì). Chen等[16]采用反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(RT-LAMP)技術(shù)，通過(guò)將病原病毒RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再通過(guò)LAMP擴(kuò)增檢測(cè)病原cDNA，實(shí)現(xiàn)了豬瘟病毒(CSFV)的快速檢測(cè).研究發(fā)現(xiàn)該方法的檢出限比標(biāo)準(zhǔn)RT-PCR方法低100倍. 谷曉紅等[17]根據(jù)大腸桿菌的malB基因設(shè)計(jì)LAMP引物，對(duì)飲用水中大腸桿菌進(jìn)行LAMP檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)該方法可以快速、靈敏、特異性地檢測(cè)到大腸桿菌(Escherichiacoli)，對(duì)防治大腸桿菌引起的相關(guān)傳染病有積極的意義. Htun等[18]采用LAMP法對(duì)腐霉病的臨床樣本進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其檢測(cè)時(shí)間比普通PCR檢測(cè)縮短了一半，比普通PCR檢測(cè)靈敏10倍，特異性也幾乎一致. 更加確定了LAMP檢測(cè)在對(duì)比檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”PCR檢測(cè)時(shí)也具有很明顯的優(yōu)勢(shì). Niczyporuk等[19]采用LAMP檢測(cè)技術(shù)，根據(jù)腺病毒外殼蛋白六鄰體的基因設(shè)計(jì)引物，首次為波蘭野禽中禽腺病毒(FAV)擴(kuò)增提供了準(zhǔn)確的定量數(shù)據(jù)，揭示了腺病毒的種間傳播，并證明了禽腺病毒在野禽中的傳播.Yu等[20]根據(jù)ORF2基因設(shè)計(jì)LAMP引物，建立了一種快速簡(jiǎn)便檢測(cè)臨床樣品中鵝星狀病毒(GAstVs)的RT-LAMP方法,并與傳統(tǒng)RT-PCR和巢式RT-PCR方法進(jìn)行了比較. 結(jié)果表明，該方法與后者具有相同的靈敏度，相較前者的方法靈敏度高1個(gè)數(shù)量級(jí).

2.3 LAMP在人類疾病檢測(cè)中的應(yīng)用

陳濤等[21]分別采用LAMP法、直接涂片法、羅氏固體培養(yǎng)法及QPCR法對(duì)2 000多份痰標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)進(jìn)行檢測(cè).在陽(yáng)性檢出率上，LAMP法比臨床主流檢測(cè)方法——涂片法高，與另外2種檢測(cè)方法的結(jié)果幾乎沒(méi)有差別. Takayama等[22]開(kāi)發(fā)了呼吸道合胞病毒(RSV)與病毒流感病毒(influenza virus)實(shí)時(shí)RT-LAMP技術(shù)，原理是設(shè)計(jì)1對(duì)熒光淬滅引物(QPrimer)，當(dāng)引物與目的片段雜交時(shí)，QPrimer胞嘧啶上的熒光基團(tuán)會(huì)與目的片段上的鳥(niǎo)嘌呤殘基發(fā)生光誘導(dǎo)電子穿梭，實(shí)現(xiàn)熒光淬滅.對(duì)113份臨床標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果表明，該方法能夠鑒別呼吸道合胞病毒和流感病毒的類型和亞型，檢測(cè)特異性為100%，靈敏度均超過(guò)85.0%，15 min左右就可以明顯觀測(cè)到陽(yáng)性擴(kuò)增曲線.

基于QPrimer法，Le等[23]開(kāi)發(fā)并驗(yàn)證了直接rRT-LAMP檢測(cè)流感病毒的方法，該方法采用將凍干的樣本加入到反應(yīng)體系當(dāng)中，不需要使用RNA分離試劑盒進(jìn)行核酸純化步驟，也不需要在冰上儲(chǔ)存和處理試劑，在10～30 min內(nèi)完成檢測(cè)，在對(duì)310個(gè)臨床標(biāo)本進(jìn)行驗(yàn)證時(shí)顯示出高靈敏度和高特異性.

Garcia-Venzor等[24]建立了一種聯(lián)合LAMP技術(shù)和 CRISPR-Cas12技術(shù)的方法，首先合成包含新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)N基因mRNA和人類RNAseP POP7 mRNA的基因塊，然后體外轉(zhuǎn)錄作為指導(dǎo)RNA，結(jié)合利用CRISPR-Cas12技術(shù)可以迅速切取樣品中的新冠病毒中的目的基因片段，然后聯(lián)用LAMP技術(shù)可以省略提取RNA的步驟，直接檢測(cè)新型冠狀病毒(SARS-CoV-2).該方法的檢測(cè)限為16 copies/μL，特異性高，成本低.

3 熒光LAMP技術(shù)的改良研究

LAMP方法雖然具有設(shè)備低廉、操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)勢(shì)，但是仍有一些技術(shù)上的難題：1)擴(kuò)增得到的目的片段長(zhǎng)度存在明顯差異，在凝膠電泳檢測(cè)后，結(jié)果不容易分析；2)沒(méi)有特異性較高且價(jià)格低廉的熒光染料，當(dāng)使用SYBR Geen Ⅰ等常規(guī)熒光染料時(shí)容易造成非特異性結(jié)合dsDNA從而導(dǎo)致假陽(yáng)性；3)引物比較復(fù)雜，如果設(shè)計(jì)環(huán)引物，6條引物共存于反應(yīng)體系之中，可能會(huì)造成引物自聯(lián)產(chǎn)生假陽(yáng)性；4)擴(kuò)增產(chǎn)物的片段較大，不易降解，很容易造成嚴(yán)重氣溶膠污染，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)造成麻煩；5)擴(kuò)增目的片段一般選擇在200 bp左右，很少用于100 bp左右的擴(kuò)增實(shí)驗(yàn). 為了克服這些缺陷，近年來(lái)大量的科研工作者采用了各種實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行技術(shù)改良，以期該技術(shù)可以更加成熟，應(yīng)用于更加廣泛的領(lǐng)域中. 普通的LAMP檢測(cè)，往往只是做到了終端檢測(cè)，而熒光實(shí)時(shí)定量檢測(cè)，不但可以在反應(yīng)進(jìn)行中實(shí)時(shí)檢測(cè)，而且能夠?qū)U(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行定量檢測(cè),達(dá)到直觀詳細(xì)獲得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的目的.

3.1 熒光探針?lè)?/h3>

由于常規(guī)的熒光染料常常造成假陽(yáng)性，給結(jié)果分析帶來(lái)麻煩， 所以一些學(xué)者嘗試使用熒光探針來(lái)代替前者承擔(dān)發(fā)射熒光信號(hào)功能. 然而，由于6條引物或4條引物(不設(shè)計(jì)環(huán)引物)已經(jīng)占用了大量目的片段的結(jié)合區(qū)域，這就給設(shè)計(jì)探針增加了難度.

Gadkar等[25]將設(shè)計(jì)好的環(huán)引物L(fēng)B的3′端的殘基T上連接FAM熒光基團(tuán)，該殘基處于3′端末尾倒數(shù)2、3位上，且要求殘基T的2側(cè)有1個(gè)G苷，這樣環(huán)引物探針LB在游離狀態(tài)下由于G苷供電子的關(guān)系，F(xiàn)AM熒光基團(tuán)處于自淬滅的狀態(tài)，當(dāng)結(jié)合目的片段時(shí)，G苷終止供給電子，F(xiàn)AM熒光基團(tuán)被解除電子供給而發(fā)射熒光信號(hào)，完成了一個(gè)自淬滅到除淬滅的過(guò)程. Elbeaino等[26]在LAMP的內(nèi)引物之間目的片段的空白處設(shè)計(jì)了TaqMan熒光探針，經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)測(cè)試,特異性明顯增強(qiáng),避免了假陽(yáng)性現(xiàn)象的出現(xiàn). 以上2種方法雖然在設(shè)計(jì)引物上都有一定的難度,但是卻比Shi等[27]采用雙鏈探針?lè)ǚ磻?yīng)體系要簡(jiǎn)單的多. Ding等[28]巧妙地將已經(jīng)設(shè)計(jì)好的環(huán)引物探針設(shè)計(jì)成一個(gè)發(fā)夾探針,當(dāng)目標(biāo)探針沒(méi)有與環(huán)引物結(jié)合到目標(biāo)片段上時(shí),由于探針的發(fā)夾性質(zhì)原因,熒光基團(tuán)與淬滅環(huán)引物基團(tuán)之間距離很近,熒光基團(tuán)被探針?biāo)銣缍荒苤苯影l(fā)出熒光信號(hào);當(dāng)要與目的片段進(jìn)行結(jié)合時(shí),探針依然在內(nèi)切酶作用下打開(kāi)發(fā)夾結(jié)構(gòu),使得兩端基團(tuán)之間距離變大,熒光基團(tuán)被激活后產(chǎn)生發(fā)射信號(hào)進(jìn)而被系統(tǒng)檢測(cè)到,而且探針仍然可以直接起到環(huán)引物作用. 該方法不僅提升了檢測(cè)的特異性，而且靈敏度也得到了提高. Kim等[29]在LAMP的LF環(huán)引物的5′端鏈接FAM熒光基團(tuán)，在3′端鏈接淬滅集團(tuán)BHQ1，稱之為同化探針[30]，并且根據(jù)LAMP內(nèi)引物相對(duì)鏈的上游序列設(shè)計(jì)的“蜂群引物”[31]檢測(cè)了豬圓環(huán)病毒3型(PCV3)，發(fā)現(xiàn)其靈敏度是普通qPCR的10倍，檢出時(shí)間為17 min左右，比普通qPCR快了將近一半，并且kappa值為0.98(置信區(qū)間為0.95～1.00)，代表其準(zhǔn)確度良好.

3.2 優(yōu)選熒光染料

目前常用的熒光染料有SYBR GreenⅠ、SolisGreen、EvaGreen等，其中SYBR系列熒光染料最常應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室中，然而其對(duì)于雙鏈DNA的非特異性結(jié)合，以及引物自聯(lián)等都會(huì)造成假陽(yáng)性結(jié)果. 所以選擇特異性較好的熒光染料對(duì)于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性十分重要.

Tangkanchanapas等[32]使用SYTO9熒光染料進(jìn)行RTPCR并與羥基萘酚藍(lán)(HNB)和加入鈣黃素(加入MnCl2)可視化實(shí)驗(yàn)進(jìn)行對(duì)比. 結(jié)果發(fā)現(xiàn),SYTO9具有良好的可視性、靈敏度和特異性. Seyrig等[33]和吳亮等[34]研究表明，SYTO8.1和SYTO9對(duì)比SYBR，在其飽和濃度下，DNA鏈的合成不會(huì)受到干擾，并且熒光信號(hào)更強(qiáng). 檢測(cè)肺炎支原體時(shí)，加入SYTO9染料后，當(dāng)樣本中靶基因拷貝數(shù)達(dá)到104時(shí)，樣本組熒光即與對(duì)照組熒光在0.5 h時(shí)差異開(kāi)始變得尤為明顯.

4 LAMP其他方面的改良

4.1 反應(yīng)條件的改良

Frisch等[35]通過(guò)優(yōu)化LAMP實(shí)驗(yàn)得出在檢測(cè)擴(kuò)展青霉素時(shí)，LAMP適宜溫度為68 ℃，這意味著B(niǎo)st聚合酶的最適宜溫度不一定局限在60～65 ℃.

Zhou等[36]在標(biāo)準(zhǔn)的25 μL LAMP反應(yīng)混合物中加入低至0.15 U的高保真DNA聚合酶. 這一數(shù)量足以去除39個(gè)3′端引物的錯(cuò)配堿基，從而使LAMP引物在擴(kuò)增過(guò)程中對(duì)3′端出現(xiàn)的各種錯(cuò)配具有良好的耐受性. 該方法顯著提高了擴(kuò)增效率，特別是對(duì)與6條引物不匹配的突變體. 無(wú)論引物和模板是否特異性互補(bǔ)，新方法的反應(yīng)時(shí)間都比傳統(tǒng)LAMP方法快5.6～22.6 min，可用于高度變異病毒的分子診斷，特別適合在資源有限的環(huán)境中應(yīng)用.

4.2 LAMP與其他技術(shù)聯(lián)用

Marciniak等[37]采用可環(huán)化探針將滾環(huán)擴(kuò)增與LAMP結(jié)合的方法，其原理是設(shè)計(jì)一個(gè)“鎖式探針”，反應(yīng)未開(kāi)始該探針與目的擴(kuò)增片段結(jié)合形成環(huán)狀，只有當(dāng)LAMP內(nèi)引物與之結(jié)合，LAMP才可以進(jìn)行擴(kuò)增.此方法成功檢測(cè)到31 bp短片段核酸,解決LAMP不能檢測(cè)短片段的問(wèn)題. Chen等[38]將LAMP和橫向流動(dòng)生物傳感器(lateral flow biosensors, LFB)技術(shù)聯(lián)合起來(lái)，傳感器分為控制線和檢測(cè)線2個(gè)結(jié)合區(qū)域，LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物兩端分別修飾熒光素和生物素，當(dāng)擴(kuò)增產(chǎn)物與控制線和檢測(cè)線結(jié)合后，納米金粒子會(huì)結(jié)合擴(kuò)增產(chǎn)物，從而產(chǎn)生肉眼可見(jiàn)的紅色條帶，從而創(chuàng)建了一種快速可靠的檢測(cè)關(guān)西瘧原蟲(chóng)的方法，具有適用于現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)點(diǎn)檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn).

Fu等[39]采用LAMP結(jié)合電化學(xué)的方法研制了一種高靈敏度檢測(cè)B族鏈球菌的LAMP電化學(xué)傳感器(LAMP E-sensor). 該方法在1 h內(nèi)大量擴(kuò)增目標(biāo)基因，并得到了大量二茂鐵修飾的產(chǎn)物(Fc)，用于轉(zhuǎn)化成為電化學(xué)信號(hào)，這些Fc修飾的產(chǎn)物可以通過(guò)Fc和β-環(huán)糊精(β-CD)之間的宿主客體相互作用連接β-CD. 此外，亞甲基藍(lán)(MB)嵌入在LAMP產(chǎn)物的雙鏈中，使得MB接近化學(xué)傳感器電極，產(chǎn)生了強(qiáng)烈的電化學(xué)信號(hào). 使用該MB作為報(bào)告基因、Fc作為內(nèi)部對(duì)照，LAMP E傳感器顯示出1～100 pg/L的寬檢測(cè)范圍和0.23 fg/L的較低檢測(cè)限，具有良好的重復(fù)性和靈敏度.

Sharma等[40]結(jié)合LAMP法開(kāi)發(fā)了一種全自動(dòng)芯片微流控實(shí)驗(yàn)平臺(tái)，通過(guò)精確地控制磁珠的移動(dòng)以確保吸附在其表面的目的核苷酸片段得到純化和擴(kuò)增.由于白晶體紫(LCV)染料的比色特性，只要在擴(kuò)增室中觀察到寨卡病毒靶標(biāo)發(fā)生顏色變化，就可以判定其為寨卡病毒陽(yáng)性. 其不但具有優(yōu)異特性，而且在樣品加載后的任何步驟都不需要人為干預(yù)，降低了因?yàn)榧夹g(shù)操作不規(guī)范影響檢測(cè)結(jié)果的概率.

4.3 多重LAMP檢測(cè)法

多重LAMP法指的是在一個(gè)反應(yīng)體系中同時(shí)檢測(cè)2種或者3種目的基因，要求在反應(yīng)期間不能出現(xiàn)引物自聯(lián)、錯(cuò)配的狀況，這就要求設(shè)計(jì)引物時(shí)避免這些問(wèn)題，提升引物設(shè)計(jì)的標(biāo)準(zhǔn).

Siddique等[41]利用groEL和fklB基因，建立了快速、經(jīng)濟(jì)、物種特異性和高靈敏度的檢測(cè)鰻鱺和溶藻弧菌的單、雙LAMP檢測(cè)方法，用于海水人為污染的評(píng)估. 該研究采取的檢測(cè)方式為顏色反應(yīng)和凝膠電泳相結(jié)合的方法，不能實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)污染程度.

Lin等[42]設(shè)計(jì)了一種雙重RT-LAMP-LFD檢測(cè)法來(lái)檢測(cè)聯(lián)合引起蝦白尾病的羅氏沼蝦諾達(dá)病毒(MrNV)與超小型病毒(XSV)，該方法分別設(shè)計(jì)了2套LAMP內(nèi)外引物，并在內(nèi)引物FIP的5′端上標(biāo)記了異硫氰酸熒光素(FITC),經(jīng)驗(yàn)證該方法特異性和檢出限都十分優(yōu)異.

Kim等[43]創(chuàng)建了一種三重環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法，并將其應(yīng)用于具有代表性的食源性致病菌沙門氏菌模型中，以考察各項(xiàng)性能及對(duì)污染食品中病原菌的檢測(cè)能力.根據(jù)3種病菌為沙門氏菌屬及其亞種Ⅰ和鼠傷寒沙門氏菌的靶基因設(shè)計(jì)了3套LAMP引物，每個(gè)引物只擴(kuò)增目標(biāo)基因，而不與非目標(biāo)基因雜交.該方法的檢出限為2.5 pg/μL鼠傷寒鏈球菌DNA.

5 未來(lái)展望

LAMP自2000年問(wèn)世以來(lái)，以其優(yōu)異的性能和低難度的操作，引起了廣泛的關(guān)注與研究熱情.近年來(lái)，關(guān)于LAMP的研究從未間斷過(guò)，這不僅僅是因?yàn)槠渚哂袕?qiáng)大的技術(shù)包容性可以與其他技術(shù)相聯(lián)合的優(yōu)勢(shì)，更因?yàn)槠渚薮蟮氖袌?chǎng)潛力.至今，我國(guó)已研制出近20種LAMP 檢測(cè)試劑盒，并申請(qǐng)專利進(jìn)行銷售[44].前面已經(jīng)提到，盡管LAMP有如此多的優(yōu)勢(shì)，其需要改良的方面仍有不少，今后LAMP將會(huì)朝著克服這些劣勢(shì)的方向發(fā)展，使其能更好地為人類社會(huì)服務(wù).